Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 2. Материалы и методы 61
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Изучение иммуногистохимических характеристик аденогенного протокового рака молочной железы
3.2. Изучение иммуногистохимических характеристик рака легкого .
3.2.1. Плоскоклеточный рак легкого. 110
3.2.2. Аденоплоскоклеточный рак легкого 126
3.2.3 Аденогенный рак легкого. 143
3.3. Изучение иммуногистохимических характеристик переходноклеточный рака мочевого пузыря .
3.4. Изучение иммуногистохимических характеристик плоскоклеточного рака шейки матки .
3.5. Изучение иммуногистохимических характеристик светлоклеточного почечноклеточного рака почки.
3.6.Иммуногистохимическое исследование новых потенциальных прогностических маркеров.
Глава 4. Обсуждение результатов 211
Выводы 240
Практические рекомендации 242
Список литературы
- Изучение иммуногистохимических характеристик аденогенного протокового рака молочной железы
- Изучение иммуногистохимических характеристик рака легкого
- Изучение иммуногистохимических характеристик переходноклеточный рака мочевого пузыря
- Изучение иммуногистохимических характеристик плоскоклеточного рака шейки матки
Введение к работе
Одной из важных задач современной онкологии является поиск признаков и свойств опухолей, на основе которых можно было бы прогнозировать течение заболевания и определять адекватную терапию. Важнейшими характеристиками злокачественного новообразования помимо клинической стадии является его гистологический вариант, степень дифференцировки и биологическая агрессивность. В последние годы усилия морфологов и онкологов направлены на выявление дополнительных прогностических признаков, которые позволят выяснить причины различного поведения опухолей при одинаковой клинической стадии и степени дифференцировки. Хорошо известно, что течение болезни, опухолевая прогрессия, ответ на определенные виды лечения у пациентов с одной и той же клинической стадией и морфологической формой рака часто бывает различен. Кроме того, желательно именно на ранних стадиях заболевания определить те характеристики опухоли, которые могли бы указывать на ее биологическую агрессивность и, исходя из этого, планировать необходимость того или иного метода лечения. Поиск маркеров, отражающих биологическую агрессивность конкретной опухоли - актуальная задача онкоморфологии. Благодаря успехам современной молекулярной биологии становятся ясными новые ключевые точки канцерогенеза и параметры опухолевых клеток, влияющие на течение болезни и ответ на терапию. Как известно, оценить биологическую агрессивность первичной опухоли можно, исследуя показатели ее пролиферативной активности, активности апоптоза, состояние ряда основных регуляторных рецепторов и систем. Для этого, различными современными
Введение 4
молекулярно-биологическими методами (иммуногисто- и иммуноцитохимия, гибридизация in situ, полимеразная цепная реакция, лазерная микродиссекция, секвенирование, микрочиповые технологии и т.д.), исследуются белки -регуляторы клеточного цикла, гены-супрессоры опухолей и их продукты, белки, регулирующие запрограммированную клеточную гибель, многочисленные факторы роста и их рецепторы, интерлеикины, цитокины и многие другие регуляторные системы клетки. Помимо вышеперечисленного биологическая агрессивность опухолей проявляется в инвазивном росте и метастазировании. Эти качества опухолевых клеток связаны с изменением их адгезивных свойств, появлением способности проникать в лимфатические и кровеносные сосуды, продуцируя повышенное количество протеаз и разрушая внеклеточный матрикс, влияя на паренхиматозно-стромальные взаимоотношения. Значительные успехи исследований в области клеточной биологии показывают ключевую роль взаимодействия опухолевых клеток и стромы в процессе метастазирования и опухолевой прогрессии. Современные данные молекулярно-биологического изучения опухолей указывают на целый ряд факторов, влияющих на поведение опухоли, но многие из них исследованы или на клеточных культурах или на незначительных выборках с учетом морфологических и клинических данных. В большинстве исследований изучены и сопоставлены с гистологической формой и клиническими данными характеристики, отражающие лишь один из параметров, связанных с биологической агрессивностью новообразования, например, только пролиферативная активность или состояние молекул адгезии, или активность некоторых ферментов, участвующих в деградации клеточного матрикса и т.д. До настоящего времени количество работ, в которых был бы изучен широкий
Введение 5
спектр маркеров, отражающих различные проявления биологической агрессивности опухоли, незначительно. Кроме того, в настоящее время не определена панель иммуногистохимических маркеров, характеризующих биологическую агрессивность опухоли, которая была бы необходима и достаточна для проведения стандартного исследования биопсийного или операционного материала как для научного, так и для практического диагностического изучения характеристик конкретной опухоли.
Изучение способности опухолевых клеток к инвазии и метастазированию особенно на ранних стадиях имеет не только теоретический интерес, но и может дать возможность для прогноза течения болезни и корректировки лечения, а также указать направления создания новых препаратов для быстро развивающейся таргетной терапии.
Цели и задачи исследования
Исходя из актуальности выше изложенных проблем, целью настоящего исследования явилось изучение комплекса параметров, определяющих биологическую агрессивность опухоли и создание алгоритма исследования, определяющего инвазивный и метастатический потенциал эпителиальных неоплазий, на примере карцином разных локализаций и разного гистогенеза: рака легкого (плоскоклеточного и железистого), аденогенного протокового рака молочной железы, переходноклеточного рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки, плоскоклеточного рака шейки матки.
Поставленная цель исследования предполагает решение следующих задач:
Введение 6
изучить экспрессию показателей пролиферативной активности, маркеров апоптоза, генов-супрессоров в материале первичной опухоли в раках нескольких локализаций и разных гистологических форм, в группах опухолей с метастазами и без метастазов;
изучить экспрессию ряда металлопротеиназ и их ингибиторов в тех же группах;
изучить экспрессию молекул адгезии в тех же группах;
на основе сравнительного анализа экспрессии изученных групп маркеров определить наиболее значимые из них для карцином разного гистогенеза и локализаций;
провести многофакторный анализ исследованных молекулярно-биологических маркеров и провести корреляции между выявленными значимыми маркерами;
сформировать алгоритм определения метастатической активности карцином изученных локализаций для применения в практических диагностических исследованиях;
провести исследование новых потенциальных маркеров биологической агрессивности опухоли.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное изучение широкого спектра иммуногистохимических маркеров, отражающих различные аспекты биологической агрессивности эпителиальных опухолей разных локализаций (молочная железа, легкое, мочевой пузырь, почка, шейка матки) с учетом
Введение 7
гистологического строения (плоскоклеточный рак, аденогенный рак, переходноклеточный рак), т.е. с учетом основных морфологических типов.
Проведено сопоставление показателей метастатической активности опухолей (состояние молекул адгезии, металлопротениназ и их ингибиторов) с показателями пролиферативной активности опухолей, маркерами апоптоза, активностью некоторых генов-супрессоров, рецепторов семейства эпидермального фактора роста в группах рака разной локализации с наличием или отсутствием метастазов.
Проведены корреляции между пролиферативным потенциалом опухолей и наличием метастазов, между показателями метастатической активности карцином и метастазами в регионарные лимфатические узлы.
Впервые разработан оригинальный объективный автоматизированный метод оценки количества тенасцина в гистологических срезах при иммуногистохимическом окрашивании.
Проведенный многофакторный анализ позволил впервые выделить наиболее значимые иммуногистохимические маркеры для определения пролиферативного и метастатического потенциала эпителиальных опухолей. На основе этого анализа впервые создан оригинальный алгоритм проведения уточняющей диагностики метастатической активности эпителиальных новообразований, включающий исследование экспрессии металлопротеиназ 1, 2, 9, тканевых ингибиторов металлопротеиназ 1 и 2, Е-кадгерина, бета-катенина, CD44, коллагена IV типа, тенасцина.
Введение 8
Научно-практическая значимость.
Сформирован алгоритм исследования биологической агресивности и метастатического потенциала карцином различных локализаций и гистологических форм, что создает основу для выработки индивидуального морфологического прогноза течения заболевания и позволит разрабатывать адекватные схемы терапии. Определение предлагаемых показателей рекомендуется проводить в крупных региональных онкологических научно-практических центрах.
Выявленные новые аспекты определения метастатического потенциала опухолей, особенно на ранних стадиях, позволят в будущем не только определять прогноз течения болезни и корректировать соответствующую терапию, но и указывают возможные направления для создания препаратов таргетной терапии.
Обнаруженные корреляции между экспрессией матриксных металлопротеиназ, молекул адгезии и наличием метастазов карцином разных локализаций и гистологических типов вносят значительный вклад в исследование механизмов канцерогенеза.
Созданная новая методика автоматизированного определения количества тенасцина в гистологических срезах при проведении иммуногистохимического исследования позволяет объективно определять количественное содержание одного из ключевых маркеров метастазирования. Методика рекомендуется для применения в патологоанатомических отделениях онкологических центров и научно-исследовательских институтов.
Введение 9
Апробация работы
Материалы исследования были доложены на ряде всероссийских и международных конференций и съездов: I Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2004г., II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2005г., Съездах онкологов СНГ - Белоруссия, Минск, 2004г., Азербайджан, Баку, 2006г., IV Всероссийском съезде онкологов, Россия, Ростов-на -Дону, 2005г., Всероссийской научно-практической конференции "Высокие медицинские технологии", Россия, Москва, 2006г., 20 Европейском конгрессе патологии, Франция, Париж, 2005г., XXV Международном конгрессе Международной академии патологии, Австралия, Брисбен, 2004г., XXVI Международном конгрессе Международной академии патологии, Канада, Монреаль, 2006г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, их них - 1 книга, 1 глава в Руководстве, 4 пособия для врачей, 2 статьи в зарубежных сборниках и 11 статей в зарубежных журналах.
Обзор литературы
Изучение иммуногистохимических характеристик аденогенного протокового рака молочной железы
Инвазия и метастазирование являются важнейшими этапами канцерогенеза изучение которых привлекает все большее внимание, особенно с внедрением в онкологию и, в частности, онкоморфологию новых молекулярно-биологических методов изучения и диагностики опухолей имуногистохимического, in situ гибридизации, лазерной микродиссекции, полимеразной цепной реакции и др.
Благодаря успехам современной молекулярной биологии сейчас хорошо известно, что различные внешние воздействия (физические, химические, биологические) могут вызывать в нормальной клетке изменения генома, приводящие к появлению нарушений сигнального, рецепторного и биохимического аппарата клетки, что в свою очередь ведет к созданию условий для неконтролируемого размножения клеток, разрушения системы запрограммированной гибели клеток (апоптоза) и появлению у клеток способности проникать через базальные мембраны, мигрировать по кровеносным и лимфатическим сосудам и образовывать метастатические очаги в других органах.
По современным представлениям инвазия опухоли, основанная на определенных генетических перестройках, происходит в три стадии. Для первой стадии характерно ослабление контактов между клетками, связанное с уменьшением количества межклеточных контактов, снижением количества специфических и неспецифических молекул адгезии увеличение концентрации других молекул, в том числе интегриновых рецепторов, обеспечивающих контакт клеток с компонентами внеклеточного матрикса - ламинином, коллагеном, фибронектином, и усиление их подвижности. На второй стадии опухолевая клетка увеличивает секрецию различных протеолитических ферментов и их активаторов, обеспечивающих разрушение внеклеточного матрикса и базальных мембран, и создающих тем самым путь для инвазии. Продукты деградации составляющих внеклеточного матрикса являются хемоаттрактантами для опухолевых клеток, мигрирующих в зону повреждения на следующей стадии процесса инвазии (Kohn Е.С., Liotta L.A.,2001). Связанный с инвазией процесс метастазирования также основан на определенных гено- и фенотипических изменениях клеток опухоли. В метастатическом каскаде сейчас условно выделяют четыре этапа (Рис. 1.1.): сниженным количеством межклеточных контактов и усиленной способностью к передвижению. Эти клетки выделяют повышенное количество эндопротеаз, разрушающих базальные мембраны как опухолевых комплексов, так и сосудов, проникают в просвет сосудов, перемещаются по току крови и лимфы.
Анализируя эти сложнейшие процессы можно отметить, что для осуществления процесса инвазии опухолевая клетка секретирует и выделяет в межклеточное пространство ряд протеолитических ферментов, действие которых приводит к деградации базальных мембран и межклеточного матрикса. Кроме того, изменяются и молекулы адгезии, находящиеся на поверхности клеток (молекулы исчезают или уменьшается количество молекул, обеспечивающих гомологические связи и D{ МИГРАЦИЯ появляются молекулы, способствующие I Туре IV collagen cleavage связыванию гетерологических клеток). Помимо этих двух процессов, важных для осуществления процесса инвазии, происходит еще и изменение Рис. 1.2. Механизм проникновения клеток через базальную мембрану. подвижности опухолевых клеток, что связано с изменениями в воздействии на клетку различных ростовых факторов и с изменением субстрата по которому перемещаются клетки. Обзор литературы 13 В настоящее время изучение процесса инвазии и метастазирования ведется по нескольким направлениям: - изучение изменений базальных мембран (БМ) и внеклеточного матрикса (ВКМ) в первичных опухолях, метастазах, инвазивных комплексах в лимфатических узлах и в лимфатических и кровеносных сосудах, - изучение биохимических изменений клеток опухоли и стромы, синтезирующих различные ферменты, разрушающие БМ, - изучение изменений адгезивных свойств малигнизированных клеток.
В этих направлениях достигнуты уже значительные успехи, хотя многие важные проблемы еще остаются нерешенными и достижения клеточной биологии еще плохо сопоставлены с гистологической структурой опухолей и клиническими данными. Обзор достижений по этим направлениям исследований представлен в данной главе.
Внеклеточный матрикс (ВКМ) - это межклеточное бесструктурное вещество, в создании которого участвуют различные клетки и основными составляющими которого являются ламинин, коллагены разных типов, тенасцин, фибронектин, витронектин, тетранектин, протеогликаны и ряд других (Гладских О.П., Федоров Д.Н., Иванов А.А. 2002, Иванов А.А., Гладских О.П., Кузнецова А.В. 2005, Bosman FT., Stamenkovic I. 2003, Stamenkovic I. 2003, Bordrer W.A., Okuda S.,Nakamura Т.,1989, ). Составляющие ВКМ являются для клеток важными сигнальными субстанциями, действующими как регуляторы роста и дифференцировки клеток. Клетки дифференцируются, растут и передвигаются в тесном контакте с ВКМ, который выполняет не только механическую функцию, но и наряду с факторами роста, цитокинами, гормонами влияет на различные функции клеток. ВКМ, составляющий значительную часть объема любой ткани, играет ключевую роль в эмбриогенезе, органогенезе, посттравматическ заживлении, канцерогенезе, инвазии и метастазировании опухолей (Bhowmick N.A., Moses Н. 2005, De Wever О., Mareel М. 2003).
ВКМ состоит из фибриллярных белков - коллагенов разных типов и эластина и интерстициального матрикса, образованного адгезивными гликопротеидами, заключенными в гель из протеогликанов и гликозаминогликанов. К интерстициальному матриксу относятся и базальные мембраны, окружающие эпителиальные, эндотелиальные и гладкомышечные структуры. БМ имеют ограничительное значение, играют роль субстрата, способствующего адгезии, миграции, пролиферации так нормальных так и опухолевых клеток. В норме БМ формируется с участием прилегающие к ней клеток, контактирующих с различными компонентами ВКМ, специальными рецепторами, преимущественно интегриновыми (Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е.,2003, Cavallaro U., Christofori G. 2001). Комплексы рака также могут формировать вокруг себя БМ и их состояние также определяет инвазивную и метастатическую активность опухоли.
Изучение иммуногистохимических характеристик рака легкого
Интерстициальные коллагены связывают и стабилизируют протеогликаны БМ, участвуя в сборке базальных мембран, взаимодействуют с фибронектином создавая фибриллярную основу ВКМ. Коллагены IV, XV, XVIII типов обеспечивают нерастворимость и механическую стабильность БМ (Timple R., 1996). Коллаген IV типа присоединяется к клеткам с помощью интегриновых рецепторов.
Эластин - гидрофобный, негликозилированный белок образует во внеклеточном пространстве слои и волокна, формирующие эластиновую сеть.
Еще одной важной составляющей ВКМ являются адгезивные гликопротеины, такие как фибронектин, ламинин, энакгин и др. Их главным свойством является способность связываться как компонентами ВКМ, так и с интегральными белками клеточной мембраны.
Фибронектин - крупномолекулярный многофункциональный гликопротеид, молекулярной массой 250000 Д, состоящий из двух цепей, является ключевым компонентом ВКМ. Он способен одновременно связываться с клеточной поверхностью, базальными мембранами другими компонентами ВКМ. Фибронектин - продукт одного гена, но в результате альтернативного сплайсинга могут образовываться более 20 изоформ. Клеточно-ассоциированный и матриксный фибронектин вырабатываются фибробластами, моноцитами, эндотелиоцитами и другими клетками. Фибронектин связывается с клетками посредством интегриновых рецепторов, а с составляющими ВКМ, в том числе коллагенами I, II, III и V типов с помощью специфических доменов (Ruoslahti Е.,1998). Эти взаимодействия могут влиять на организацию цитоскелета клеток, регулируя форму и подвижность клеток. Исследование уровня фибронектина при переходноклеточном раке мочевого пузыря также указывает на прямую корреляцию экспрессии фибронектина с биологическим поведением клеток опухоли (Zhang W., Ма.Т., 1998). Экспрессия фибронектина позитивно коррелирует со стадией опухоли, пролиферативной активностью, экспрессией коллагена и ламинина (Loachim Е., et al., 2005, Koukoulis G.K., Zardi L, Vitranen I. et al. 1997). Состояние BKM влияет не только на возможность клеток опухоли мигрировать по организму, но и на их пролиферативную активность и способность к вступлению в апоптоз (Zvang W., Xu Y., Ma Т. 1998, Zigar N., Kanbie V., Gale N. 1999, Hanamura N., Youshida Т., Matsumoto E., et al., 1997).
Еще одним существенным составляющим БМ и ВКМ является гликопротеид ламинин, стабилизирующий структуру БМ путем формирования мостиков между коллагеном IV типа, фибронектином и гепарансульфатпротеогликаном (Martin G.R.,1987). Ламинин - крупномолекулярный белок, молекулярной массой (800 -1000Д) состоящий из трех полипептидных цепей. Существует 8 изоформ ламинина, которые синтезируются в разные периоды эмбриогенеза и локализуются в разных структурах ВКМ. Для эпителиальных БМ специфическим является ламинин-5 - субстрат ВКМ для адгезии и миграции клеток. Деградация именно ламинина-5 металлопротеиназами является механизмом облегчающим миграцию клеток. Взаимодействие ламинина с клетками опосредуется связыванием с интегриновыми рецепторами. Ламинин увеличивает подвижность клеток, выполняя роль адгезивного субстрата для эпителиальных и мезенхимальных клеток (Gullberg D., Tiger C.-F.,Veiling Т., 1999, Colognato H., Yurcenco PD., 2000, Hirosaki Т., Tsubota Y., Kariya Y., et al., 2004). В опухолях происходит деградация ламинина БМ, но увеличивается его количество в строме. Связываясь с интегриновыми рецепторами, ламинин вместе с фибронектином обеспечивает прикрепление клеток к субстрату соединительной ткани (Patarroyo М., Tryggvason К., Virtanen I., 2002). Именно дефадация составляющих ВКМ и ведет к возможности инвазии опухолевых клеток в сосуды (Engbring JA., Kleinman НК., 2003). В ряде работ, выполненных на эпителиальных опухолях разных локализаций (рак молочной железы, прямой кишки, поджелудочной железы), четко продемонстрировано, что уменьшение количества материала, из которого построена БМ - коллагена и ламинина, то есть их разрушение может свидетельствовать о инвазивной активности клеток опухоли (Кудрявцева Е.И., Морозова О.В., Рудинская Т.Д. и др., 2001, Aumailley М., Smyth N.. 1998, Gannelli G., Pozzi A., Stetler-Stevenson WG., et al., 1999). В то же время показано, что рост аденокарциномы поджелудочной железы сопровождается уменьшением количества коллагена IV в строме при одновременном увеличении ламинина в строме опухоли, что коррелирует со снижением степени дифференцировки опухоли (Гуревич Л.Е.,2004, Taraboletti et.al.,2002). Иммуногистохимическое исследование экспрессии ламинина-5 в инвазивной и неинвазивной уротелиальнои карциноме выявило прямую корреляцию его экспрессии с инвазивным характером опухоли (Hindermann W. et al.,2003, Gianelli G., Falk-Marzillier J., Schiraldi 0., et al., 2003) . Для раков различных локализаций сейчас выявлено, что экспрессия рецепторов ламинина на мембранах эпителиальных клеток коррелирует с инвазивным ростом (Martin GR., Candido A., Sousa S., 2006, Lohi J., 2001), т.к. ламинин не только выполняет роль адгезивного субстрата для различных эпителиальных клеток, но и может усиливать пролиферацию и подвижность клеток новообразования (Gianelli G., Falk-Marzillier J., Schiraldi О., et al., 2003, Gullberg D., Tiger C.-F., Veiling Т., 1999, Hlubek F., Jung A., Kotzor N., et al., 2001, Spessoto P., Yin Z., Magro G., et al., 2001). Повышенная экспрессия ламинина -5 коррелирует с экспрессией EGFR и HER2 и связана с агрессивным поведением уротелиальнои карциномы, в тоже время предлагается считать, что гиперэкспрессия ламинина-5 играет ключевую роль в интравезикальном рецидивировании поверхностного уротелиального рака (Kiyoshima К., et al.,2005).
Помимо уже описанных, важным компонентом ВКМ являются протеогликаны, представленные гликозаминогликанами, содержащими различное количество боковых гликозаминогликановых цепей, связанных с ядром молекулы белка (lozzo RV., 2001, Ishigaki S., Toi M., Ueno Т., et al., 1999, Kresse H., Schonherr E.,2001). В тканях существуют и гликозаминогликаны без белкового ядра, например гиалуроновая кислота, рецепторов для которой служит неспецифическая молекула адгезии - CD44 (Goodison S., Urquidi V., Tarin D., 1999). Протеогликаны посредством своих гликозаминогликановых цепей обеспечивают связывание с коллагеном, фибронектином, ламинином, с другими компонентами ВКМ, а так же взаимодействуют с клеточной поверхностью (Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. и др., 2005, Afify A., McNiel М., Cruig S., 2006, McNiel М., 2006, Oz В., Karayel FA., Gazio NL, et al., 2000, Takanashi M., Eto H., Tanabe KK., 1999, Sugahara K., Kitagawa H., 2000). Известно, что связывание гиалуроновой кислоты с CD44 активирует несколько каскадов, приводящих к реорганизации актинового скелета, вызывающих клеточную пролиферацию (через CD44 - НЕР2-гетеродимиризацию) и влияющих на активность других тирозинкиназ и эндопептидаз (Bourguignon L.Y., Gunja-Smyth Z., lida N., et al., 1998, Van der Steen P., Rudd PM., Dwek RA., 1998, Zhang W., Hyjek E., Sica G., et al., 2006, Yu W.H.,Woessner J.F.,McNeish J.D.,Stamencovic I.,2002, Stamencovic 1.,2003).
Изучение иммуногистохимических характеристик переходноклеточный рака мочевого пузыря
Регуляция активности ММР на уровне транскрипции связана в основном с Ets семейством транскрипционных факторов (McCawley I.J., Matrisian I.M., 2001). В ряде исследований показана их способность активировать транскрипцию ряда протеаз, включая урокиназный тип активатора плазминогена, ММР-1, ММР-3, ММР-9. В тоже время многие ростовые факторы (фактор роста фибробластов, эндотелиальный ростовой фактор, эпидермальный фактор роста) способны индуцировать экспрессию Ets-протеинов. В раке яичников показан не только повышенный уровень ММР-2 и МТ1-ММР, но и высокое содержание Ets1, в связи с чем некоторые авторы называют Ets1 прогностическим фактором для инвазивной карциномы яичника (Raspollini M.R., Castiglione F., Deg lnnocenti D.R., et al., 2005, Trudel D., Popa J., Bairati I., et al., 2006).
Особое внимание уделяется сейчас изучению интенсивности экспрессии и локализации разных типов ММР, в сравнительном аспекте, в норме, при разных степенях диспазии, карциноме in situ и инвазивном раке. Интересно, что, что экспрессия разных ММР (ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-9) различна по интенсивности на разных стадиях и при разных локализациях опухоли, и поскольку, действие этих ферментов направлено на разные составляющие БМ и ВКМ, то существенно определение активности всех этих ферментов. В ранней инвазии злокачественных опухолей важнейшую роль играет разрушение коллагена базальных мембран ММР-2 и ММР-9. Ряд авторов продемонстрировали, что экспрессия ММР-9 (коллагеназа, разрушающая коллаген IV типа эпителиальных БМ и БМ сосудов), имеет повышенный уровень при инвазивных формах карцином разных локализаций. При изучении рака шейки матки ММР-9 обнаружена в 72% карцином, в 50% CIN и отсутствует в эпителии окружающих тканей и в норме (Davidson В., Goldberg I., Kopolovic J. et al 1999). Корреляция опухолевой прогрессии с усилением экспрессии ММР-2 и ММР-9 при плоскоклеточном раке шейки матки была подтверждена и работе Bor-Ching Sheu с соавторами (2003), при этом экспрессия ММР-2 и ММР-9 отмечена практически во всех изученных случаях рака и в 83% CIN III, ММР-1, ММР-14 и ММР-15 обнаруживались в 55-81% рака , а ММР-1 еще и в 39% CINIII. При этом отмечалась слабая экспрессия TIMP при раке. Также выявлено и увеличение экспрессии металлопротеиназ мембранного типа, являющихся активаторами комплекса рго-ММР-2, переводящими его в активную форму. Наряду с экспрессией ММР-2 и ММР-9 наблюдалась экспрессия ММР-1 и ММР-13. Экспрессиия этих типов ММР обнаруживалась другими исследователями при карциномах легкого, колоректальной аденокарциноме, плоскоклеточном раке головы и шеи, вульвы, поджелудочной железы, желудка, почки, мочевого пузыря (Bando Е., Yonemura Y., Endou Y., et al., 1998, Braskar v.S., Kallakury M., Karikehalli S., et al., 2001, Cai M., Onoda K., Nakao M., et al., 2002, Ellenrieder V., Adher G., Gress T.M., 1999, Han J.L, Xie W.L, Huang J., 2003, Heslin M.J., Yan J., Johnson M.R., et al., 2001). Исследование экспрессии ММР в раке шейки матки показало
корреляцию экспрессии ММР-13 с наличием высокоонкогенных типов ВПЧ (Mosre p.l., Heffer L., Templer С, et al., 1999, Peg V., Castellvi J., Garsia A., 2006). Возможно, что на интенсивность синтеза ММР и TIMP могут влиять не только внутриклеточные метаболиты, но и внешние факторы (Umehara F., Okada Y., Fujimoto N., et al., 1998). Так группа исследователей Каролинского Университета установила усиление экспрессии ММР-9 под влиянием онкопротеина LMP-1 вируса Эпштейна-Барр при носоглоточном раке (Takeshita Н., Yoshizaki Т., Miller W.E., 1999).
В других исследованиях рака шейки матки позитивная реакция с ММР-2 описана в 50% изученных случаев инвазивной карциномы (4 из 8), экспрессия ММР-2 коррелировала с увеличением пролиферативной активности, оцениваемой по индексу MIB-1, которая составила в среднем 33,8% (Minami R. et al 2003. В дисплазиях разной степени экспрессия ММР-2 не отмечалась. В неинвазивных раках желудка и прямой кишки уровень ММР-9 значительно ниже, чем при инвазивных формах тех же опухолей (Bando Е., Yonemura Y., Endou Y. et al 1999: Vrettou E.,Jordanilis F., Penopoulis V. et al 1999). Наличие MMP-1 и ММР-2 также коррелирует с инвазией в лимфатические сосуды и метастазами в лимфатических узлах при раке шейки матки, молочной железы, мочевого пузыря и при меланоме (Hattori М., Ohno Е., Kuramoto Н., 2000, Jing X., Kakuda S., Sakaguchi К. et al 1999, Makela M., Salo Т., Larjava H., 1998, McCawley L.J., Brien P., Hudson L.G., 1998, Morgan M.B., Saba S.R., Gower W.A., 1998). Существенным является нахождение ММР не только в цитоплазме неопластических клеток, но и в клетках стромы, инфильтрирующих опухоль лимфоцитах, фибробластах, миоэпителиальных и гладкомышечных клетках (Stamenkovic 1.,2003). При исследовании почечноклеточного рака было выявлено, что плохой прогноз, уменьшение выживаимости и снижение степени дифференцировки прямо коррелирует с увеличением экспрессии ММР-2 и ММР-9. Kallakury B.V.S с соавторами рекомендуют определять уровень экспрессии ММР в материале опухоли после радикального хирургического лечения с целью выделения групп риска по прогрессированию заболевания. При этом отмечено и увеличение уровня экспрессии TIMP-1 и TIMP-2, что авторы называют парадоксальным результатом (Kallakury B.V.S, et al,2001). Однако аналогичные результаты были получены и другими исследователями при анализе уровня mRNK TIMP-1 и TIMP-2 карциноме молочной железы (Ree А.Н et al 1997). Возможно, это отражает механизмы регуляции активности ингибиторов протеаз одним из которых является гиперметилирование, изучению которого посвящено сейчас много исследований (Ivanova Т. et al 2004). Отмечена корреляция высокой экспрессии ММР-2 и ММР-9 и инвазивной и метастатической активностью плоскоклеточного рака гортани, аденокарцином прямой кишки и пищевода, почечноклеточкого рак (Kallakury В. et al 2001, Hemmerlein B.,et al 2004). Помимо своей основной роли по деградации ВКМ, ММР, как показал ряд исследований, могут участвовать в активации фактора некроза опухолей альфа или инактивации интерлейкина 1бета также играющих важную роль в опухолевой прогрессии (Kubota S., Ito Н., Ishibashi Y., Seayama Y., 1997, Dolo V., Ginestra A., Gassara D.,1998, Deryugina E.I., Ratnikov V., Monosov е., et al., 2001). Кроме наиболее полно изученных к настоящему времени желатиназ А и В, выявлена экспрессия ММР-13 в плоскоклеточном раке вульвы, ММР-7 - в аденокарциномах эндометрия, желудка, мочевого пузыря (Bostrom P.J., Ravanti L, Reunanen N., et al., 2000).
Изучение иммуногистохимических характеристик плоскоклеточного рака шейки матки
Имеется связь между CD44 и внутриклеточными структурами, такими как актиновые микрофиламенты, обеспечивающими подвижность и миграцию клеток (GoodisonS., Urquidi V., Tarin D., 1999). Для ряда опухолей (светлоклеточный рак почки) характерна прямая зависимость увеличения количества молекул CD44 и наличия опухолеых эмболов в сосудах (Yildiz E.,Gokce G.,Kilicarslan Н., et al 2004). Но при исследовании корреляции экспрессии CD44 с клиническими данными (продолжительностью безрецидивного периода, наличием или отсутствием метастазов) при раке толстой кишки разными группами исследователей были получены противоположные результаты (Делекторская В.В, Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е.,2005). При исследовании экспрессии CD44 в уротелиальном раке показано, что фокальная потеря экспрессии CD44v3,v6 коррелирует с высоким риском перехода от неинвазивной стадии к инвазивной (Toma V., et al 1999). Изучение экспрессии CD44v6 на разных стадиях переходноклеточного рака мочевого пузыря от рТа до рТ2-4 выявило уменьшение числа образцов с экспрессии от 43% до 10% изученных случаев. Такие неоднозначные результаты, полученные на небольших выборках и разных формах и локализациях карцином еще раз указывают на необходимость продолжения исследований CD44 в комплексе с другими показателями.
Обсуждая проблему инвазии и метастазирования опухолевых клеток нельзя не упомянуть еще раз о цитокинах, ростовых факторах и их рецепторах. Указанные вещества через посредство специфических рецепторов участвуют в различных сигнальных путях и влияют на интенсивность метаболизма клеток на всех уровнях, на подвижность клеток и на многие другие стороны их функционирования. Неопластическая трансформация практически всегда связана с изменениями функционирования факторов роста и их рецепторов и, вероятно, они вместе с цитокинами являются регуляторами синтеза и активности ММР и их ингибиторов (Robache-Gallea S., Bruneau J.M., Robbe Н, et al 1997, Rouger J.P., Moullier P., Piedagnel R., Ronco P.M.,1997, Danen E.H.J., Sonnenberg A., 2003, De Weber 0., Mareel M., 2003), что указывает на очень сложную связь внешних воздействий на клетку и ее ответ на эти воздействия. Цитокины и факторы роста -это высокопотентные белки, обеспечивающие ответ на внедрение чужеродных тел, иммунное повреждение, участвующие в воспалении, репарации, регенерации. Кроме того, многочисленные исследования доказали их важную регуляторную роль в пролиферации, клеточной дифференцировке и миграции. Цитокины, которые могут секретироваться или в свободном виде или в виде мембраноассоциированных молекул на поверхности стимулированных клеток, связываются со специфическими рецепторами на клетках-мишенях, запуская сложные каскады физиологических клеточных ответов (Заридзе Д.Г.,2004, Cotran S., Kumar V., Collins Т., 1999). Исследованиям роли цитокинов посвящена многочисленная литература, в данном обзоре только хочется подчеркнуть их важное влияние на способность клеток к миграции и на состояние компонентов ВКМ. Помимо цитокинов многие функции клеток регулируются так называемыми факторами роста, являющимися полипептидами с молекулярной массой 5000 -50000Д. Эти факторы обладают широким спектром действия: стимулируют или ингибируют дифференцировку, изменяют структуру цитоскелета клеток и их подвижность, влияют на большинство функций клетки. Факторы роста, как и цитокины, обладают аутокринным, паракринным и эндокринным действием. Описанные к настоящему времени факторы роста разделены на несколько семейств: инсулиноподобные факторы роста, факторы роста фибробластов, тромбоцитарные факторы роста, эпидермальные факторы роста, трансформирующий фактор роста бета и колониестимулирующий фактор. Проведенные исследования обнаружили гомологию между факторами роста и их рецепторами и вирусными и цитоплазматическими онкогенами и протоонкогенами, выявили роль факторов роста в канцерогенезе. Многие онкогены кодируют мутационные формы ростовых факторов, их рецепторов или сигнальных молекул в митогенном пути, активированном ростовыми факторами (Mendelsohn J.etal.,2001, Пальцев MA, Иванов А.А.. Северин СЕ.,2003). Рецепторы ростовых факторов по механизму сигнальной трансдукции разделяются на три класса: рецепторы, использующие, ионные каналы, рецепторы, использующие G-белки, рецепторы, использующие протеинкиназы. Последние обладают собственной тирозинкиназной или серин/треонинкиназной активностью или взаимодействуют с киназами цитозоля клетки (Neves S.R.,Ram Р.Т., Iyengar R.,2002, AttisanoL, Wrana J.,L,2002.) В канцерогенезе важную роль играет эпидермальный фактор роста - он может индуцировать протоонкогены с-fos и с-тус и вызывать малигнизацию клеток (Mendelsohn J.etal.,2001, Gamboa-Dominques A., Dominques-Fonseca С, Quintanilla-Martines L., etal., 2004). Рецептор эпидермального фактора роста хорошо изучен. Это трансмембранный гликопротеид, обладающий тирозинкиназной активностью. Он является членом семейства ЕгЬВ-рецепторов, так же называемых HER-рецепторами, и состоящего из четырех функционально связанных рецепторных молекул, играющих важную роль в клеточной дифференцировке, пролиферации и апоптозе (Jacobs T.W., Gown A.M., Yaziji H., et al.,1999). Большое внимание сейчас привлекает рецептор HER2, особенно в связи с созданием и клиническим внедрением препарата «Герцептин», применяющимся при лечении рака молочной железы и исследующийся для использования при других злокачественных новообразованиях (Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., 2002, Cobleidh М., Vogel C.L., Tripathy D., et al., 1999, Birner P., Oberhuber G., Stani J., et al., 2001). Под действием лигандов HER2/neu образует гетеродимеры с другими рецепторами этого семейства и регулирует работу соответствующих сигнальных каскадов.
