Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современный уровень знаний о раково-тестикулярных генах 11
1.1. Основные характеристики раково-тестикулярных генов 12
1.2. Раково-тестикулярные гены и их экспрессия в гематологических опухолях 17
1.3. Характеристика раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME 19
1.4. Опыт использования методов иммунотерапии для лечения онкогематологических заболеваний 42
1.5. Некоторые представления о регуляции экспрессии раково-тестикулярных антигенов 43
1.6. Возможность использования раково-тестикулярных антигенов в качестве мишеней для иммунотерапии 48
1.7. Диагностическое значение экспрессии раково-тестикулярных генов при гемабластозах 50
1.8. Заключение 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Исследованные больные 52
2.2. Клеточные линии и методика их культивирования 53
2.3. Здоровые доноры 53
2.4. Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F 53
2.5. Системы для определения мРНК целевого гена в исследуемых образцах 54
2.6. Предварительная подготовка клеточного материала к выделению общей РНК 55
2.7. Выделение РНК 56
2.8. Получение кДНК 56
2.9. Проверка специфичности работы систем 57
2.10. Проведение количественной полимеразно-цепной реакции в реальном времени 57
2.11. Обработка экспериментальных данных 58
2.12. Проверка воспроизводимости результата 58
2.13. Методы статистического анализа полученных данных 59
Глава 3. Результаты 60
3.1. Активность раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 в клетках крови здоровых доноров 60
3.2. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках крови у больных в дебюте ХМЛ и Ph’-негативных хМПЗ 60
3.3. Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом 61
3.4. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных острым промиелоцитарным лейкозом 62
3.5. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом диффузная В-крупноклеточная лимфома 65
3.6. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом лимфома Ходжкина 66
3.7. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом фолликулярная лимфома 68
3.8. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках линий К562 и WI38 69
3.9. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клеточных линиях меланомы 69
Глава 4. Обсуждение 71
4.1. Экспрессия раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 у здоровых доноров 71
4.2. Профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEAl, PASD, SCP1, SLLP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и FRAME у больных ХМЛ и хМПЗ 71
4.3. Значение величины уровня экспрессии генов FRAME и PML/RARa в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза 74
4.4. Прогностическая значимось уровня экспрессии гена HAGE в дебюте диффузной В-крупноклеточной лимфомы 77
4.5. Результат исследования профиля экспрессии раково-тестикулярных генов в у больных с диагнозом лимфома Ходжкина 77
4.6. Влияние уровня экспрессии гена FRAME у больных фолликулярной лимфомой 77
4.7. Особенности активности раково-тестикулярных генов в клеточных линиях К562, WI-38 и семи линий меланомы 78
4.8. Заключение 81
Глава 5. Выводы 84
Список сокращений 85
Список литературы 87
- Характеристика раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME
- Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F
- Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом
- Профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEAl, PASD, SCP1, SLLP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и FRAME у больных ХМЛ и хМПЗ
Характеристика раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME
Сперматогенез осуществляется в семенных канальцах, представляющих собой функциональную единицу семенной железы. Результатом эффективного сперматогенеза является образование активных сперматозоидов у мужчин [2]. В течение дня в организме взрослого мужчины формируется свыше 100 миллионов сперматозоидов. Этот процесс осуществляется непрерывно с момента наступления полового созревания в возрасте 12-14 лет, и под влиянием фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов гипофиза продолжается в течение десятков лет [2-4]. Рецептором к фолликулостимулирующему гормону обладают только клетки Сертоли, расположенные в эпителии семенников [5-7]. Клетки Лейдинга, расположенные в промежуточном пространстве между семенными канальцами, в ответ на стимуляцию лютеинизирующим гормоном вырабатывают тестостерон и эстрадиол-17 [8-11]. Активность гипофиза, в свою очередь, регулируется тестостероном и эстрадиолом, а также гормонами, вырабатываемыми гипоталамусом, и в результате сложных функциональных взаимосвязей формируется система, известная как гипоталамно-гипофизарно-гонадная ось [12 17]. Гормональные и детальные морфологические изменения, происходящие в эпителии семенников, были подробно описаны уже 80 лет назад [18]. Однако на сегодняшний день остаются малоисследованными молекулярные и биохимические механизмы регуляции процессов сперматогенеза [18-25].
При описании протекания сперматогенеза различают несколько стадий: (1) самоподдерживающее митотическое деление сперматогониальной стволовой клетки и сперматогониев, (2) митотическая пролиферация и дифференцировка сперматогония в сперматоциты I и II порядка, (3) мейотическое деление сперматоцита II порядка, (4) сперматогенез (трансформация круглых сперматидов в вытянутые), и (5) созревание, сопровождающиеся выходом сперматозоида в семенной канал [26, 27]. Схема, описывающая развития половых клеток, поддерживаемых клетками Сертоли, выстилающими слизистую оболочку семенного канала, выглядит следующим образом.
Tunica propria состоит из базальной мембраны (содержащей в основном коллаген типа IV) и слоя коллегановых волокон I типа, под которым находятся перитубулярные миоидные клетки (миофибробласты) и тянется лимфатический сосуд [28]. Кроме того, с внутренней стороны гемато-тестикулярного барьера эпителий семенника разделён на апикальный и базальный отсеки. Гемато тестикулярный барьер формируется за счёт образования между клетками
Сертоли комплекса плотных и щелевых контактов, демосом и ещё одного специализированного клеточного контакта, характерного только для семенников. Эта ультраструктура создаёт внутри организма гемато-тестикулярный барьер, внутри которого в изоляции от собственной иммунной системы осуществляются процессы сперматогенеза [29]. Фазы митотического деления I и II, и последующее созревание сперматозоидов происходит в специфическом микроокружении, названным адлюминальным компартментом [30].
Изоляция этой иммунопривилегированной зоны поддерживается не только пассивно, с помощью плотных клеточных контактов [31]. Клетки Сертоли несут на своей поверхности Fas-лиганд для запуска процессов апоптоза у лимфоцитов, случайно оказавшихся рядом. Кроме того, клетки Сертоли выделяют интерлейкины и интерфероны, затрудняющие развитие иммунного ответа в окрестностях семенных канальцев [32-34].
Барьер имеет огромное физиологическое значение, так как половые клетки на всех стадиях сперматогенеза экспрессируют разнообразные антигены, некоторые из которых локализованы на внешней мембране [35-37]. Биологический смысл данной изоляции заключается в предотвращении развития аутоиммунных реакций, направленных непосредственно против половых клеток, и его отсутствие быстро приводило бы к бесплодию.
Исследования, начатые не так давно, показали, что при своём развитии герминогенные клетки экспрессируют большое количество генов. Многие из этих генов были открыты в качестве онко-, или протоонкогенов, которые не активны, или же экспрессируются на очень низком уровне в немалигнизированных клетках. Однако, здоровые семенные железы per se не являются раком. К тому же, герминогенные клетки, проходящие конкретные стадии своего развития при сперматогенезе, экспрессируют эти гены в течение короткого времени, меня общий профиль экспрессии от стадии к стадии. Таким образом, экспрессия раково-тестикулярных генов в герминогенных клетках является нормальным процессом, и этот процесс подчинён жёсткому контролю. Более того, некоторые временно экспрессирующиеся белки имеют очень важные функции при сперматогенезе. В частности, они отвечают за слияние гамет. Такие белки, предназначенные для взаимодействия сперматозоида с яйцеклеткой, часто экспрессируются на поверхности клеток, выделенных из опухолевого метастаза. Из этих белки могут индуцировать спонтанную выработку антител, за что получили название раково-тестикулярных антигенов. Коротко, семенники не являются раком per se, однако отличается активностью онкогенов, экспрессия которых характерна только для малигнизированных клеток. [38-40].
Ниже приведена компиляция некоторых результатов последних исследований, касающихся роли раково-тестикулярных антигенов в сперматогенезе и канцерогенезе. Сбор базовых знаний об этой группе генов способствует не только пониманию процессов, происходящих при сперматогенезе, но и позволит быстрее развить подходы иммунотерапии рака, разработанные на основе раково-тестикулярных антигенов.
Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F
Ген, кодирующий белок PASD1, локализован в кластере Xq28. С этого гена считывается мРНК, с которой транслируется полипептидная цепь, состоящая из 639 аминокислотных остатков. При фолдинге полипептид не подвергается процессингу и не гликозилируется, образуя зрелый белок PASD1. Была найдена изоформа этого белка, названная PASD2. Эта изоформа также состоит из единственной полипептидной цепочки, длинна которой составляет 773 аминокислотных остатка. Из них первые 638 остатков являются общими для обоих белков. Существование белка PASD2 можно объяснить спонтанной ошибкой сплайсинга, при которой не происходит вырезание 14го интрона из информационной РНК. Эта информация должна быть принята к сведению при планировании исследования транскрипционной активности гена PASD. Можно специально подобрать экспериментальные системы (например, для анализа на белковых чипах), способные распознавать присутствие как PASD1 и PASD2 одновременно, так и наличие одного белка PASD2.
Следует отметить, что ген PASD расположен в локусе, содержащим семейство Х-хромосомных РТГ MAGE. Очень часто при раковых заболеваниях экспрессии PASD сопутствует экспрессия некоторых представителей семейства MAGE. Кроме MAGE, в том регионе найдены последовательности других опухоль-ассоциированных антигенов. В их числе антигены NY-ESO-1, семейство антигенов LAGE, Траг-3, CSAGE и SAGE [49].
Белок PASD1 содержит в себе домен PAS. Белки, содержащие этот домен, являются регуляторами циркадного ритма у эукариот [142, 143]. Кроме того белок содержит последовательность ядерной транслокации. Этот рецептор способен взаимодействовать с рецептором эстрогена. Подобное взаимодействие может оказывать влияние на клеточную пролиферацию [144, 145].
Синтез белка PASD1 осуществляется на ранних стадиях сперматогенеза. Методом иммуноблотинга удалось установить, что белок имеет исключительно ядерную локализацию [146], и это не опровергает предположение о том, что PASD1 каким-то образом может запускать транскрипцию генов.
У здорового человека экспрессия этого белка обнаружена в семенниках. Ни в одной другой ткани PASD1 или PASD2 не были найдены.
Экспрессии белка PASD1 был обнаружена во многих клеточных линиях, полученных из гемопоэтических злокачественных новообразований. Особенно тщательно изучена роль этого белка в прогрессировании множественной миеломы [146]. При данном заболевании изоформы PASD (чаще экспрессируется только PASD1) обнаруживаются у 50% пациентов [75]. В клетках, содержащих мРНК PASD1, часто обнаруживают активность гена MAGE-A6. Несколько реже происходит коэкспрессия гена MAGE-A2, а также генов MAGE-A3 и NY-ESO-1 [146].
Экспрессия PASD1 обнаруживается не только при гематологических заболеваниях. мРНК PASD1 была найдена в образцах опухолевых тканей кишечника, мозга, лёгких и шейки матки. Были исследованы образцы гистологически нормальных тканей, полученных от тех же пациентов. В клетках этих тканей также была выявлена активность гена PASD. Отсюда следует, что необратимой опухолевой трансформации предшествует активация этого онкогена. Факторы, вызывающие активацию, пока остаются неизвестными [145].
Опираясь на имеющуюся информацию о белке PASD1 можно начинать лабораторные исследования для испытания этого антигена как мишени для иммунотерапии. Работы можно производить только с изоформой PASD1, поскольку PASD2 является очень похожим белком, и будет участвовать в тех же иммунологических реакциях.
Ген SCP1 (synaptonemal complex protein 1). Белок синаптонемального комплекса, экспрессирующийся во время профазы мейоза (начиная со стадии зиготена до стадии диплотена) человеческих сперматоцитов [147]. Является одним из структурных компонентов синаптонемального комплекса [74]. В норме белок SCP1 предназначен для связывания гомологичных хромосом во время их кроссинговера. В отличие от многих РТГ, находящихся на Х-хромосоме, ген SCP1 локализован в хромосоме 1, и не имеет гомологичных генов. Спонтанная экспрессия SCP1 обнаружена в неопластических клетках различных типов. В частности, этот ген активен при злокачественной глиоме, раке молочной железы, почки и яичников [148].
Замечено, что повышение уровня экспрессии SCP1 при раке яичника связано с неблагоприятным исходом заболевания. Предпринимаются попытки проведения анти-SCP1 иммунотерапии данного заболевания [149].
При сперматогенезе экспрессия гена SCP1 строго ограничена стадиями профазы мейоза. Однако в трансформированных клетках экспрессия этого гена происходит при любой фазе митоза [74]. Влияние экспрессии гена SCP1 на опухолевую клетку требует детальных исследований.
Ген SEMG1. Белок, кодируемый геном SEMG1 является главным компонентом спермы, и присутствует в высокой концентрации в выделениях семенных желёз. Состоит из единственной полипептидной цепи длинной 439 аминокислотных остатков. Общая масса зрелого белка равна 50 кДа [150].
Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом
В зависимости от вида исследуемого материала применялись различные подходы к выделению мРНК.
Периферическую кровь или костный мозг (объём 5 ml и 2 ml, соответственно), полученный от больного, или периферическую кровь здорового донора перед выделением мРНК обрабатывали гемолизирующим раствором (0,8% NH4Cl) для удаления эритроцитов. Для этого кровь (или костный мозг) смешивали с гемолизирующим раствором в объёмном соотношении 1:14. Смесь инкубировалась в течение 15 мин. при температуре +4C. После этого смесь центрифугировали в течение 10 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 1 ml гемолизирующего раствора, затем снова центрифугировали в течение 5 мин. При 2400 об/мин. Супернатант удаляли, а выпавший осадок был готов к выделению общей РНК.
Лимфатические узлы, полученные от больных, переносились на предметное стекло и измельчали скальпелем. После измельчения образец лимфатические узлы были готовы к выделению из них РНК.
Клетки, инкубируемые в виде суспензионной культуры, центрифугировались в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 ml физиологического раствора, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а полученный осадок был готов к выделению РНК.
Клетки, инкубируемые в виде прикреплённой культуры, освобождались от среды и снимались со стенки культурального флакона 2 ml 0,02% раствором Версена, содержащем 0,25% трипсина. Обработка клеток трипсином занимала 2 мин. при непрерывном наблюдении за состоянием культуры под бинокуляром при увеличении в 100 раз. После отделения клеток от стенки флакона к ним добавляли 10 ml 0,02% раствора Версена, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 ml физиологического раствора, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. После удаления супернатанта полученный осадок клеток был готов к выделению РНК.
Выделение РНК из предварительно обработанных образцов производилось по протоколу, предложенному Chomczynski и Sacchi [208]. Кратко: подготовленный клеточный материал лизировали в 0,5 ml гуанидин-тиоционатного буфера (4M гуанидан-тиоционата, 25mM цитрата Na, 0,5% N-лаурилсаркозила Na и 0,1M меркаптоэтанола). Во время лизиса материал пропускали через иглу 19G не менее 20 раз. Далее в пробирку добавляли 0,5 ml водонасыщенного фенола (pH 5,2), и 0,125 ml раствора ацетата Na (pH 4,2), встряхивали, и добавляли 0,25 ml хлороформа. Полученную смесь встряхивали до молочно-белого цвета и центрифугировали в течение 10 мин. при 1200 об/мин при охлаждении до +4C. После центрифугирования отбирали 0,5 ml верхней водной фазы, содержащей клеточную РНК, и смешивали с 0,5 ml изопропанола. Инкубация РНК в изопропаноле проводилась в течение 20 часов при температуре -20C. После инкубации РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин. при 12000 об/мин., удаляли супернатант, и дважды промывали в 80% этаноле. После промывок осадок РНК высушивали в термостате, растворяли в деионизованной воде, и измеряли концентрацию раствора.
Матричная РНК, выделенная на предыдущем этапе, использовалась для синтеза кДНК с использованием ревертазы. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием фермента RevertAid Reverse и набора реактивов (Fermentas, США) в условиях, предложенных фирмой-производителем. Для отжига использовали смесь случайных шестичленных праймеров (Синтол, Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления РНК, пробу доводили до конечного объема деионизованной водой.
Проверка специфичности работы систем Если транскрипция генома и обратная транскрипция мРНК прошли безошибочно, то полученная кДНК представляет собой непрерывную последовательность гена, лишённую интронов. Теоретически, системы для проведения количественной ПЦР могут сработать и на геномной ДНК, содержащей интроны. Данная особенность потребовала проведения серии экспериментов, в которых вместо кДНК использовались пробы очищенной геномной ДНК и выделенной тотальной РНК. В результате были найдены условия, в которых не происходило неспецифического срабатывания систем праймеров и зондов. Оптимальные условия постановки реакции количесвтенной ПЦР в реальном времени изложены в следующем разделе.
Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием двукратной реакционной смеси (40 мM трис-HCl, 100 мM KCl, 4 мM MgCl2, 1 мM каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов и 0.2 мM 2-меркаптоэтанола) и TaqДНК-полимеразы (Fermentas, США). В каждую пробу было добавлено 5 l кДНК, 350 nM прямого, 350 nM обратного праймера и 140 nM флуоресцентного зонда (таб. 2)
Профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-l, MAGEAl, PASD, SCP1, SLLP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и FRAME у больных ХМЛ и хМПЗ
Высокий уровень экспрессии генов оказался характерным для двух низкодифференцированных и двух умереннодифференцированных линий. В то же время более низкий уровень экспрессии РТГ выявлен у низко-, умеренно- и высокодифференцированных линий. Следует отметить, что разделение на три группы по признаку уровня экспрессии и частоты активации РТГ оказался невозможным в силу статистической недостоверности полученных результатов.
Таким образом, мы получили данные о том, что для низкодифференцированных клеток меланомы характерен как высокий, так и более низкий уровень экспрессии РТГ. При этом у высокодифференцированной линии обнаружен достоверно более низкий уровень экспрессии РТГ, чем у низкодифференцированных линий. Поскольку для человека, страдающего от меланомы, низкодифференцированные опухолевые клетки являются плохим прогностическим фактором, может иметь значение и профиль экспрессии РТГ.
Для подтверждения этого вывода требуется провести работу по определению профиля экспрессии РТГ в клеточных образцах, полученных непосредственно от больных, и не прошедших ни единой стадии культивирования.
Наши результаты открывают широкие возможности для использования транскриптов раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME для первичной диагностики и последующего мониторинга некоторых хронических и острых форм онкогематологических заболеваний.
Мы показали сходство на молекулярном уровне впервые выявленных случаев хронических миелопролиферативных заболеваний и хронического миелоидного лейкоза. Мы выявили молекулярные различия между хронической фазой и фазой акселерации и бластным кризом при хроническом миелоидном лейкозе. Активация экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в хронической фазе хронического миелоидного лейкоза может быть первым предвестником трансформации заболевания в терминальную стадию.
Мы определили, что в дебюте заболевания В-клеточными лимфомами (диффузная В-крупноклеточная лимфома, лимфома Ходжкина и фолликулярная лимфома) профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME очень разнообразен, и целом является практически индивидуальным для каждого больного. С другой стороны, несмотря на это разнообразие, для диффузной В-крупноклеточвной лимфомы уровень экспрессии гена И AGE в клетках костного мозга удалось установить в качестве прогностического фактора. Для фолликулярной лимфомы в качестве важного прогностического установлен высокий уровень экспрессии гена PRAME в лимфатических узлах.
Ещё никем в мире не сообщалось, что существует онкологическое заболевание, при котором с такой с частотой, близкой к 100% рассмотренных случаев, экспрессируется какой-либо представитель из группы раково-тестикулярных генов. Согласно нашим результатам всех исследованных РМ/Ж4Да-положительных больных острым промиелоцитарным лейкозом в костном мозге экспрессируется ген PRAME. Интересно, что, несмотря на высокую агрессивность, присущую острому промиелоцитарному лейкозу, в дебюте заболевания совершенно не характерна множественная экспрессия РТГ. Это говорит о существовании некого высокоспецифичного механизма, срабатывающего при остром промиелоцитарном лецкозе, и приводящем к экспрессии РТГ PRAME.
Важно отметить, что экспрессия гена PRAME была либо очень интенсивной, сопоставимой с уровнем экспрессии изоформ гена PML/RARa, либо наблюдалась на низком уровне относительно химерного гена. Во втором случае, – при низком уровне экспрессии, у больных с высокой частотой развивался гематологический рецидив заболевания. Этого достаточно, чтобы рекомендовать определение уровня экспрессии гена PRAME у вех больных в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза.
Мы исследовали клеточные линии, в частности, линии клеток меланомы. Показано, что множественная экспрессия РТГ больше характерна для линий, охарактеризованных ранее как низко- и умереннодифференцированные, но не высокодифференцированные. В случае высокодифференцированных линий, наблюдался существенно более низкий уровень экспрессии генов при меньшем количестве активированных генов.
