Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. РОЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЭНДОГЕННЫХ ИНТОКСИКАЦИЙ
1.1. Роль БЭТ в патогенезе эндогенных интоксикаций неопухолевого происхождения 9
1.2. Роль БЭТ в патогенезе эндогенных интоксикаций при опухолевом росте 13
1.3. Основные принципы лечения эндотоксемии 17
ГЛАВА 2. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ
2.1. Иммунологические аспекты действия БЭТ на организм 22
2.2. Модифицирующее влияние БЭТ на развитие опухолевого процесса 31
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Модель опухолевого роста 39
3.2. Оценка влияния БЭТ на опухолевый рост 40
3.3. Оценка функциональной активности Т- и В-клеток в тест-системе in vivo 41
3.4. Система локального адоптивного переноса 43
3.5. Методы количественного определения БЭТ 43
3.6. Определение эффективности сорбции БЭТ углеродными сорбентами 47
3.7. Методика карбоперитонеума 48
3.8. Статистическая обработка полученных результатов 49
ГЛАВА 4. ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ В УСЛОВИЯХ ОРГАНИЗМ 51
ГЛАВА 5. МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНГИБИРУЮЩЕГО И СТИМУЛИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ НА РОСТ ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫХ САРКОМ 73
ГЛАВА 6. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДУЛИРУЮЩЕГО
ВЛИЯНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ НА РОСТ
ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫХ САРКОМ 83
ГЛАВА 7. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ДЕТОКСИЦИРЩЕЙ
СПОСОБНОСТИ УГЛЕРОДНЫХ СОРБЕНТОВ 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 121
ВЫВОДЫ 132
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 135
- Роль БЭТ в патогенезе эндогенных интоксикаций неопухолевого происхождения
- Иммунологические аспекты действия БЭТ на организм
- Модель опухолевого роста
- ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ В УСЛОВИЯХ ОРГАНИЗМ
- МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНГИБИРУЮЩЕГО И СТИМУЛИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ НА РОСТ ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫХ САРКОМ
Роль БЭТ в патогенезе эндогенных интоксикаций неопухолевого происхождения
В последние годы сформулирована концепция синдрома эндогенной интоксикации как универсального патологического состояния, которое является важным фактором в патогенезе ряда заболеваний, в том числе и онкологических /43,76,273/. Относительная независимость клинической картины и механизмов развития эндотоксико-зов различной природы может быть обусловлена БЭТ, являющимися своеобразными универсальными медиаторами системных токсических реакций /43,73/. Такое понимание роли БЭТ при эндогенных интоксикациях базируется на убиквитарности грамотрицательных бактерий, составляющих основу кишечной флоры и в то же время являющихся причиной разнообразных инфекционных процессов /31,44/. Нарушение нормальных барьерных функций по отношению к бактериям и их продуктам при тяжелых заболеваниях закономерно приводит к их попаданию во внутренние среды организма и последующей реализации их многогранного патогенного действия.
БЭТ являются компонентом наружной клеточной мембраны грамотрицательных бактерий. Препаративное выделение БЭТ, осуществленное Буавеном, позволило выяснить их общую структуру /22/. Макромолекула БЭТ представляет собой полисахаридно-белково-ли-пидный комплекс с молекулярной массой, колеблющейся от 400 тысяч до 4 миллионов дальтон /97/. Три основных структурных компонента БЭТ - гидрофильный (о) полисахарид, кор-олигосахарид (корзона или базисная часть) и гидрофобная липидная часть (ли-пид А) - связаны в молекулы ковалентними связями /40/. Структура (о) полисахаридной цепи определяет серологическую специфичность БЭТ различных штаммов бактерий /63,279/. Композиция кор-зоны и липидной области является относительно постоянной /114/. Проявление многих биологических свойств БЭТ, в частности токсических, детерминировано, как полагают, липидной составляющей молекулярного комплекса БЭТ /113,121,191,282/.
Иммунологические аспекты действия БЭТ на организм
Исходя из накопленных в настоящее время данных по феноменологии действия БЭТ, можно с уверенностью сказать, что одним из основных биологических свойств БЭТ является их выраженная способность влиять на иммунокомпетентную систему /70,124,285/. Так как интересующие нас модифицирующие эффекты БЭТ при опухолевом росте реализуются, по мнению большинства исследователей, в первую очередь благодаря активации и-или супрессии соответствующих звеньев иммунной системы /61,156,170/, ниже мы остановимся на общеиммунологических представлениях о возможных механизмах модулирующего действия БЭТ и рассмотрим их влияние на В-клеточ-ные, Т-клеточные и макрофагальные функции.
В опытах in vitro и in vivo установлено, что БЭТ проявляют митогенную активность по отношению к В-лимфоцитам /154, 195,216,223/, инициируя пролиферацию не только коммитированных, но и других клонов В-лимфоцитов независимо от антигенного сти-муля /56,193,228/. Индукция митогенеза и появления антитело-образующих клеток под действием БЭТ исследовались в культуре лимфоцитов, полученных из лимфоидных органов мышей с нормально функционирующим тимусом или от бестимусных мышей nude /185, 198/. Было установлено, что БЭТ в равной степени усиливают синтез ДНК в культурах, содержащих и не содержащих Т-лимфоциты, а также вызывают появление среди культивируемых лимфоцитов клеток синтезирующих антитела к эритроцитам барана и лошади, к различным гаптенам (ДНФ, ТНФ, BJP ).
Доказательства преимущественного действия БЭТ на В-лимфо-циты были получены и в экспериментах с использованием лимфоцитов селезенки взрослых тимэктомированных мышей, восстановленных сингенным костным мозгом после летального облучения /НО/. Обработка спленоцитов анти-ТІіу-І»2-сьгоороткой и комплементом не влияла на пролиферацию, индуцированную БЭТ.
Необходимо отметить, что- по механизму неспецифического воздействия на В-клетки БЭТ несколько отличаются от других Т-незавиеимых антигенов /80,155,196,220/. Если поликлональную активность и митогенное действие таких антигенов, как ПОЛ и
III можно с достаточной уверенностью приписать размеру и полимерному характеру их молекул, то неспецифическая активность БЭТ зависит, в первую очередь, от неполимерной части молекулы -липопротеина /55,113,196,282/. Значение липопротеиновой части комплекса БЭТ для реализации митогенного действия было выявлено в экспериментах на мышах линии СЗН/HeJ .
Модель опухолевого роста
Модель опухолевого роста была выбрана, исходя из необходимости строгого контроля иммунологической специфичности феноменов, в связи с чем мы остановились на линейноспецифических штаммах трансплантируемых фибросарком (3-6 пассажи), первично индуцированных 20-метилхолантреном у сингенных мышей /42/.
Для получения взвести опухолевых клеток у животных в асептических условиях извлекали опухолевые узлы, тщательно очищали их от некротических участков, промывали раствором Хенкса, после чего измельчали ножницами и подвергали трипсинизации. Для этого измельченную опухоль заливали 0,05% раствором трипсина в растворе Хенкса, переносили в плоскодонную колбу и помещали на магнитную мешалку при температуре 37С. Через 10-30 минут пастеровской пипеткой отсасывали раствор трипсина с клетками, помещали в центрифужную пробирку и разводили холодной культураль-ной средой, состоящей из 45$ среды 199, 45$ гидролизата лакталь-бумина и 10% инактивированной бычьей сыворотки и центрифугировали при 425g в течение 5 минут. Осадок ресуспендировали в культу-ральной среде и фильтровали через несколько слоев капронового фильтра. Процедуру трипсинизации повторяли 2-3 раза в зависимое-ти от консистенции опухоли и нужного количества опухолевых клеток. Полученную таким образом клеточную взвесь дважды отмывали в культуральной среде центрифугированием при указанном выше режиме. Для подсчета живых клеток использовали трипановый синий. Раствор краски представлял собой смесь, состоящую из 4 частей 0,2% раствора трипанового синего и I части 4,25% раствора NaCl. После подсчета клеток в камере Горяева расчитывали их концентрацию в суспензии. Перевивались опухолевые клетки подкожно в об-ласть спины в дозе 1 10 кл./мышь.
Оценка иммунологических эффектов бактериальных эндотоксинов в условиях организм
В данной главе представлены результаты исследований, целью которых явилось изучение иммунологических особенностей ряда препаратов БЭТ и выбор наиболее активного для дальнейшей экспериментальной работы, а также детальный анализ действия этого препарата при различных условиях эксперимента.
В качестве критерия для количественной оценки иммунологической активности препаратов БЭТ была использована способность БЭТ вызывать пролиферативную реакцию лимфоцитов in vivo /ПО, 143/.
Было протестировано три группы препаратов БЭТ: Е. coli 055 (I), Е. coli 0Ш:В4 (II), брюшного тифа и паратифа В (ИХ). Их выбор был обусловлен тем, что для первых двух групп мы располагали стандартными коммерческими препаратами, благодаря чему имели возможность сравнивать с ними БЭТ, полученные в лабораторных условиях из сходных, но отличающихся по некоторым параметрам культивирования, штаммов микроорганизмов. Препараты БЭТ брюшного тифа и паратифа В были выделены относительно малораспространенным методом протеолиза и подвергнуты высокой степени очистки, поэтому уровень иммунологической активности таких эн-дотоксиновых комплексов также вызывал определенный интерес.
Полученные данные продемонстрировали вариабельность активности препаратов как внутри каждой из групп, так и между группами (рис 4.1). Среди коммерческих препаратов максимальной способностью вызывать пролиферацию лимфоцитов мышей in vivo обладал БЭТ Е. coli 0Ш:В4 В фирмь Difсо(препарат 7).
Моделирование ингибирующего и стимулирующего эффектов бактериальных эндотоксинов на рост трансплантированных сарком
Для понимания иммунологических механизмов, лежащих в основе разнонаправленного действия БЭТ на неопластический процесс, важным представляется изучение и сравнение характера изменений в функциональном состоянии Т- и В-систем иммунитета при замедленном и ускоренном БЭТ опухолевом росте. Решение этого вопроса требует, прежде всего, адекватных моделей ингибирующего и стимулирующего эффектов БЭТ на рост бластом. Объективная сложность разработки моделей обусловлена тем, что в зависимости от количества и химического состава БЭТ, путей и динамики их введения в организм, БЭТ способны вызывать различного рода изменения в функциональном состоянии иммунной системы и, как следствие, в развитии новообразований. При этом существенную роль в реализации эффектов БЭТ могут играть и такие факторы, как иммуногенность, локализация и размеры бластомы /61,70,108,192/. Поэтому целью наших исследований явилась отработка экспериментальных условий, позволяющих добиться максимального для выбранной нами модели опухолевого роста (трансплантированная фибросаркома, первично индуцированная 20-МХ у мьшей линии ВА1В/с) замедления и ускорения течения опухолевого процесса, что включало в себя выбор препарата БЭТ и оценку эффективности различных способов, доз и схем его введения.
