Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Структура межклеточных адгезионных контактов 12
1.2. Регуляция организации актинового цитоскелета 21
1.3. Роль малых ГТФ-аз семейства Rho в регуляции динамики актинового цитоскелета 28
1.4. Ras-трансформация 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
ГЛАВА 3. Морфология и цитоскелет нормальных и трансформированных клеток 49
3.1. Состояние проблемы. 49
3.2. Собственные исследования. 51
3.2.1. Актиновый цитоскелет и система микротрубочек нормальных эпителиоцитов IAR-2 и трансформированных эпителиоцитов С4 и С5 51
3.2.2. Изменения морфологии и актинового цитоскелета трансформированных эпителиоцитов и фибробластов как результат экспрессии мутантов гена р53 66
3.3 .Обсуждение. 74
ГЛАВА 4. Динамика активных ламелл нормальных и трансформированных эпителиоцитов 78
4.1. Состояние проблемы. 78
4.2. Собственные исследования. 79
4.2.1. Псевдоподиальная активность нормальных и трансформированных эпителиоцитов 79
4.2.2. Актин-зависимые перемещения латексных частиц по поверхности нормальных и трансформированных эпителиоцитов 81
4.3. Обсуждение. 84
ГЛАВА 5. Два типа контактного торможения движения в культурах клеток 88
5.1. Состояние проблемы. 88
5.2. Собственные исследования. 89
5.2.1. Контактное торможение движения в культурах нормальных эпителиоцитов IAR-2 89
5.2.2. Контактное торможение движения в культурах нормальных фибробластов 96
5.2.3. Контактное торможение движения в культурах трансформированных фибробластов 100
5.2.4. Изменение типа контактного торможения движения при неопластической трансформации эпителиальных клеток 103
5.3. Обсуждение. 107
ГЛАВА 6. Роль актинового цитоскелета в межклеточной адгезии 112
6.1. Состояние проблемы. 112
6.2. Собственные исследования. 113
6.2.1. Перестройки актинового цитоскелета при формировании межклеточного контакта нормальными эпителиоцитами IAR-2 113
6.2.2. Организация актинового цитоскелета контактирующих фибробластов AGO 1523 и Rat-1 117
6.2.3. Организация актинового цитоскелета в зоне контакта трансформированных клеток 126
6.3. Обсуждение. 130
ГЛАВА 7. Два типа пространственной организации межклеточных адгезионных контактов 134
7.1. Состояние проблемы. 134
7.2. Собственные исследования 135
7.2.1. Межклеточные тангенциальные контакты эпителиальных клеток IAR-2 135
7.2.2. Межклеточные радиальные контакты фибробластов AG01523 и Rat-1 135
7.2.3. Нарушения межклеточных контактных взаимодействий при неопластической трансформации эпителиоцитов и фибробластов 145
7.3. Обсуждение. 149
ГЛАВА 8. Изменения межклеточных контактных взаимодействий при перестройках актинового цитоскелета 156
8.1. Состояние проблемы. 156
8.2. Собственные исследования. 156
8.2.1. Изменения организации актинового цитоскелета эпителиоцитов IAR-2
при индукции эпителиально-мезенхимального перехода под действием ТРА 157
8.2.2. Межклеточные коллизии эпителиоцитов, обработанных ТРА 160
8.2.3. Радиальные межклеточные адгезионные контакты эпителиоцитов, обработанных ТРА, их взаимодействие с актиновыми пучками 162
8.2.4. Влияние деполимеризации микротрубочек на организацию межклеточных адгезионных контактов эпителиоцитов IAR-2 172
8.3. Обсуждение. 175
Заключение 178
Выводы 184
Список литературы 187
- Роль малых ГТФ-аз семейства Rho в регуляции динамики актинового цитоскелета
- Актиновый цитоскелет и система микротрубочек нормальных эпителиоцитов IAR-2 и трансформированных эпителиоцитов С4 и С5
- Актин-зависимые перемещения латексных частиц по поверхности нормальных и трансформированных эпителиоцитов
- Контактное торможение движения в культурах нормальных фибробластов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Как известно, в ходе неопластической трансформации в значительной степени изменяются как пролиферативные характеристики клеток, так и их клеточный фенотип (феномен так называемой морфологической трансформации). В настоящее время наиболее полно изучены два основных типа морфологической организации нормальных клеток: клетки с поляризованной псевдоподиальной активностью (фибробласты), имеющие вытянутую форму и способные к направленному перемещению по поверхности подложки, а также неполяризованные дискоидные клетки (эпителиоциты). Экспрессия мутантного онкогена ras приводит к превращению неполяризованных эпителиальных клеток в фибробластоподобные. При неопластической трансформации фибробластов также наблюдается изменение морфологии клеток, и в частности, уменьшение размера и изменение формы активных ламелл -структур, играющих ведущую роль в клеточной локомоции и межклеточной адгезии. Несмотря на то, что большое количество исследований было посвящено описанию изменений формы клеток при неопластической трансформации, до настоящего времени не было проведено сравнительного анализа динамических характеристик активных ламелл нормальных и трансформированных клеток. Весьма важным, в этой связи, представляется изучение функциональной роли цитоскелетных структур, и в частности системы микротрубочек, в обеспечении динамики клеточных ламелл. Изменения динамических характеристик активных ламелл, определяемые подлежащими структурами актинового цитоскелета и системы микротрубочек, могут вносить существенный вклад в нарушения тканевого морфогенеза, наблюдаемые при трансформации. Одним из главных проявлений неопластической трансформации является способность опухолевых клеток инвазировать окружающие ткани. До
настоящего времени существовала широко распространенная точка зрения о том, что в основе инвазивных характеристик опухолевых клеток лежит утрата так называемого контактного торможения движения. В связи с этим представляется актуальным детально, используя современные методы видеомикроскопии, исследовать динамику межклеточных взаимодействий в культурах нормальных и трансформированных фибробластов и эпителиоцитов.
Результатом взаимодействия клеток является формирование межклеточных контактов, важнейшими из которых являются кадхерин-содержащие адгезионные контакты. Недавние исследования показали, что молекулы межклеточной адгезии вовлечены в сигнальные пути, регулирующие экспрессию генов, связанных с изменениями тканевой организации, регуляцией клеточной пролиферации и дифференцировкой клеток. В литературе таюке имеются данные об изменении экспрессии и аккумуляции адгезионных молекул при неопластической трансформации. Адгезионные контакты клеток тесно связаны со структурами актинового цитоскелета. Вместе с тем, до сих не изучена динамика построения межклеточных контактов различных клеток, роль актинового цитоскелета в механизме формирования и определении структуры адгезионных контактов. До сих пор оставался полностью неисследованным вопрос, как связана пространственная организация (геометрия) межклеточных адгезионных контактов с организацией актинового цитоскелета, значительно различающейся в клетках двух тканевых типов -эпителиоцитах и фибробластах.
В связи с этим, для изучения закономерностей, определяющих
взаимодействие актиновых структур с межклеточными адгезионными
контактами, представляется также важным исследовать изменения,
происходящие во время эпителиально-мезенхимального перехода,
обусловленного действием опухолевого промотора 12-0-
тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТРА). Изучение перестроек актинового цитоскелета, изменений межклеточных контактных взаимодействий в ходе
эпителиально-мезенхимального перехода позволит приблизить нас к пониманию событий, сопровождающих ранние этапы неопластической трансформации.
Цели и задачи работы.
В связи с вышесказанным настоящая работа преследовала главные цели:
Изучить принципы построения и роль системы микротрубочек в организации и динамике актинового цитоскелета культуральных клеток, влияние экспрессии экзогенного онкогена г as и антионкогена р53.
Детально исследовать гомотопические коллизии нормальных и трансформированных эпителиоцитов и фибробластов, описать межклеточные адгезионные контакты, изучить роль актинового цитоскелета в формировании и поддержании контактов между клетками.
Исследовать особенности цитоскелета, межклеточных контактных взаимодействий и адгезионных контактов как результат эпителиально-мезенхимального перехода.
Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:
С помощью ретровирусного переноса получить линии клеток, экспрессирующие экзогенный онкоген ras, а также антионкоген р53, описать морфологию и цитоскелет полученных линий.
С помощью видеомикроскопии с компьютерным усилением контрастности изображения и метода лазерной ловушки исследовать динамику активных ламелл в культурах нормальных и трансформированных клеток. Оценить роль интегрирующей системы клетки - системы микротрубочек в динамике клеточных ламелл с использованием агентов, избирательно угнетающих сборку микротрубочек.
Исследовать динамику межклеточных взаимодействий в культурах нормальных и ras-трансформированных эпителиоцитов и фибробластов.
Используя лазерную сканирующую (конфокальную) микроскопию, описать
распределение молекул межклеточной адгезии Е-кадхерина и [3-катенина при установлении контакта между клетками.
Проанализировать распределение актиновых микрофиламентов в зоне межклеточных взаимодействий нормальных и трансформированных эпителиоцитов и фибробластов.
С помощью ингибитора АТФ-азы миозина BDM и ингибитора Rho-киназы НА-1077 оценить роль контрактильности актинового цитоскелета в организации и поддержании межклеточных контактов.
Используя ТРА в качестве индуктора эпителиально-мезенхимально превращения, описать изменения динамики межклеточных контактных взаимодействий, а также пространственную организацию адгезионных структур в культуре нормальных эпителиоцитов, приобретающих фибробластоподобный фенотип.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Нами впервые были изучены и сопоставлены динамические характеристики активных ламелл нормальных и трансформированных эпителиоцитов, как-то, псевдоподиальная активность и актин-зависимое перемещение латексных частиц по поверхности клетки. Впервые показана также роль системы микротрубочек в организации и аккумуляции актин-зависимой активности в небольших ламеллярных областях, характерных для трансформированных эпителиоцитов, определяющая их направленное перемещение по подложке.
В работе впервые показана роль системы микротрубочек в морфологической организации нормальных и трансформированных онкогеном ras эпителиальных клеток.
Дополнительное введение в гау-трансформированные клетки различных мутантов гена р53 позволило нам впервые описать частичную реверсию морфологии и актинового цитоскелета, обусловленную экспрессией гена р53 с мутацией в локусе His273.
Использование современных методов видеомикроскопии с компьютерным усилением контрастности изображения позволило нам детально исследовать гомотипические столкновения нормальных и трансформированных клеток и показать, что в культурах трансформированных клеток также существует контактное торможение движения. Мы показали, что существует два типа контактного торможения движения: характерный для эпителиальных клеток и характерный для фибробластоподобных клеток, включающих в себя нормальные и трансформированные фибробласты, а также трансформированные эпителиоциты.
Нами впервые была исследована динамика псевдоподиальной активности при установлении контакта между клетками и показано угнетение псевдоподиальной активности в ходе формирования стабильного межклеточного контакта нормальных эпителиоцитов. Изучение движений латексных частиц, помещенных в область контакта двух эпителиоцитов с помощью лазерной ловушки, позволило впервые описать прекращение центростремительного тока актина и формирование нового тангенциального вектора натяжения, обеспечивающего латеральное расширение межклеточного контакта.
Было показано, что при межклеточных контактах фибробластоподобных клеток динамика псевдоподиальной активности и характер движения латексных частиц не изменялся.
С помощью флуоресцентной микроскопии нам удалось впервые описать перестройки актинового цитоскелета в ходе установления межклеточного контакта нормальных эпителиальных клеток, и в частности, разрушение краевого актинового пучка и формирование из его сегментов арко-подобных пучков. Была высказана гипотеза о том, что контрактильность арко-подобных пучков определяет возникновение нового вектора натяжения, направленного вдоль границы устанавливающегося контакта, что, в свою очередь, стабилизирует контакт и организует молекулы межклеточной адгезии в линии вдоль границы этого контакта. Линейное
расположение Е-кадхерина и р-катенина в межклеточных контактах нормальных эпителиоцитах было показано нами с помощью лазерной сканирующей (конфокальной) микроскопии. Контакты нормальных эпителиальных клеток нами были определены как тангенциальные. Напротив, в культуре нормальных фибробластов был охарактеризован другой тип адгезионных контактов, содержащих Р-катенин, - радиальные контакты. Нами обнаружено взаимодействие радиальных контактов с прямыми актиновыми пучками, характерными для фибробластов. Использование ингибитора АТФ-азы миозина BDM позволило нам впервые показать тесную связь контрактильности актинового цитоскелета и пространственной организации межклеточных контактов фибробластов. Показано также, что в ходе неопластической трансформации изменений динамики актинового цитоскелета, перестройки актиновых структур и концентрации адгезионных молекул в зоне межклеточных взаимодействий не происходит.
Использование ТРА в качестве индуктора эпителиально-мезенхимального превращения позволило ещё раз продемонстрировать тесную связь пространственной организации межклеточных контактов, характера межклеточных взаимодействий с общей организацией актинового цитоскелета в клетке. Разборка кольцевого актинового пучка и формирование радиальной схемы организации актиновых филаментов приводило к изменению типа контактного торможения движения и превращению тангенциальных Е-кадхериновых контактов в радиальные. Ингибиторы контрактильности актинового цитоскелета В ДМ и НА-1077 вновь реорганизовывали радиальные контакты в тангенциальные. Мы также впервые показали, что модуляция контрактильности актинового цитоскелета при действии нокодазола изменяет организацию межклеточных адгезионных контактов фибробластов и эпителиоцитов. Таким образом, теоретическое значение диссертационной работы состоит в том, что выявлены два способа осуществления контактного торможения движения и два типа межклеточных адгезионных контактов, основанных
на различиях в общей организации актинового цитоскелета нормальных эпителиоцитов и фибробластов. Показано, что га?-трансформация вызывает опосредованные системой микротрубочек изменения морфологии клетки и функциональных свойств актинового цитоскелета, изменение типа контактного торможения, а также нарушения экспрессии и аккумуляции молекул межклеточной адгезии.
Наряду с теоретическим полученные данные имеют научно-прикладное значение, поскольку расширяют понимание механизмов, лежащих в основе приобретения неподвижными неполяризованными клетками способности к направленному перемещению, что, в конечном итоге, приводит к инвазии и метастазированию.
Представленные в работе данные о возможности нормализации фенотипа и
цитоскелетных структур трансформированных клеток при экспрессии
антионкогена р53 могут служить основой для изыскания методов
направленного изменения морфогенетических свойств
трансформированных клеток с целью их нормализации. Важное научно-практическое значение имеет описание двух типов пространственной организации межклеточных контактов эпителиоцитов и фибробластов. Как известно, на первых этапах неопластической трансформации эпителиоциты могут сохранять адгезионные контакты друг с другом. Тем не менее, с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии после окрашивания на р-катенин можно выявить первые признаки трансформации - изменение типа пространственной организации адгезионных структур с тангенциального на радиальный.
Роль малых ГТФ-аз семейства Rho в регуляции динамики актинового цитоскелета
Ключевыми регуляторами динамических перестроек актинового цитоскелета являются малые ГТФ-азы семейства Rho (см. обзор Hall, 1998). Семейство Rho включает в себя семь белков: Rho (изоформы А, В, С), Rac (изоформы 1 и 2), Cdc42 (изоформы Cdc42Hs и G25K), RhoD, RhoG, RhoE и ТС 10 (Mackay and Hall, 1998). Эти белки имеют два конформацонных состония при связывании с ГДФ или с ГТФ. Факторы обмена нуклеотидов (GEFs) способствуют диссоциации ГДФ, что приводит к присоединению молекулы ГТФ и активации белков Rho. Белки, активирующие ГТФ-азную активность Rho (GAPs), переводят белки Rho в неактивное состояние. Активированные Rho белки взаимодействуют с эффекторными белками в клетке, тем самым запуская множество событий, включая перестройки актина и изменения транскрипции генов. Наиболее изученными на настоящее время являются белки Racl, RhoA и Cdc42, действие которых исследовалось главным образом на фибробластах млекопитающих. Микроинъекция конститутивно активного Racl в фибробласты ЗТЗ, так же, как и добавление к клеткам некоторых ростовых факторов (инсулина и PDGF) приводит к сборке сети микрофиламентов на периферии клетки, что в свою очередь индуцирует образование ламеллоподий и раффлов (Ridley et al., 1992). С другой стороны, микроинъекция RhoA или добавление лизофосфатидной кислоты вызывает образование мощных актиновых пучков в цитоплазме фибробластов ЗТЗ (Ridley and Hall, 1992). Показано также участие Rho белка в перестройках актинового кортекса во время цитокинеза (O Connell et al, 1999). Микроинъекция фактора обмена нуклеотидов Cdc42 FGD1 приводила к формированию многочисленных филоподий (Nobes and Hall, 1995). Сходные эффекты реорганизации различных компонентов актинового цитоскелета были также описаны для клеток нейробластомы, макрофагов (см. Hall, 1998).
Кроме того известно, что Cdc42 может активировать Rac (Ridley et al., 1992, Nobes and Hall, 1995). С другой стороны, активация Rac и Cdc42 при стимуляции фибробластов PDGF, а также введение в фибробласты конститутивно-активного V12Rac уменьшает активность Rho. Вместе с тем эффекторные мутанты Rac, неспособные индуцировать цитоскелетные изменения или неактивирующие JNK каскад, также снижают активность Rho. Считается, что баланс между активностью Rac и Rho определяет морфологию и локомоторные характеристики фибробластов. Высокая активность Rac и низкая активность Rho характерны для фибробластов, имеющих эпителоидную форму и низкую двигательную активность. Напротив, для активно мигрирующих фибробластов свойственны повышенная активность Rho и Rac (Sander et al., 1999). С другой стороны, в эпителиальных клетках, имеющих Е-кадхериновые контакты, малые ГТФ-азы Rac и Rho необходимы для построения межклеточных адгезионных структур. Так, активация Rac приводила к аккумуляции актина в кольцевых пучках, ассоциированных с адгезионными контактами (Eaton et al., 1995, Hordjik et al., 1997). Напротив, микроинъекция доминантно-негативного Rac или СЗ-трансферазы, ингибирующей эндогенный Rho, препятствовала установлению адгезионных контактов при переносе культуры кератиноцитов из низкого Са в среду с высоким Са (Braga et al., 1997). В опытах Браги с использованием латексных частиц, конъюгированных с антителами к кадхерину, было показано, что именно Rac, но не Rho, отвечает за рекрутирование актина при образовании Е-кадхериновых контактов. Между тем, в фибробластах L и ЗТЗ, экспрессирующих экзогенный Е-кадхерин, ингибирование Rac не препятствовало межклеточной адгезии. В этих клетках ингибитор Rho СЗ-трансфераза нарушала образование межклеточных Е-кадхерин-содержащих контактов (Braga et al., 1999). Таким образом, можно предположить, что роль малых ГТФ-аз в динамике актина и формировании адгезионных контактов в значительной степени зависит от организации актинового цитоскелета в клетке. Малые ГТФ-азы семейства Rho таюке задействованы в активизации псевдоподиальной активности, разборке межклеточных контактов, перестройках актинового цитоскелета эпителиальных клеток, обусловленных действием ТРА и HGF/SF (Ridley et al., 1995, Imamura et al., 1998, Royal et al., 2000, Zondag et al., 2000). Так, приобретение подвижного фенотипа эпителиоцитами МДСК (скэттеринг), при действии HGF/SF, не происходит при ингибировании активности Rac, Rho и Cdc42 (Ridley et al., 1995, Royal et al., 2000). Исследование активности Rac и Rho в эпителиальных клетках при стимуляции HGF/SF показало, что уже через 5 мин после добавления HGF/SF наблюдается кратковременная активация Rac, после чего активируется Rho. Повышение активности Rho, продолжающееся несколько часов, по-видимому, ответственно за скэттеринг эпителиоцитов (Zondag et al., 2000).
Кроме хорошо известной роли малых ГТФ-аз в регуляции функций актинового цитоскелета имеются данные об участии Rho, Rac и Cdc42 в JNK/p38 - сигнальных путях (см. Mackay and Hall, 1998). Показано также, что Rho, Rac и Cdc42 могут активировать транскрипционный фактор NFkB (Sulciner et al., 1996), активируют транскрипцию в ответ на стимуляцию факторами роста сыворотки (Hill et al., 1995), необходимы для вхождения в фазу G1 клеточного цикла за счет активации гена циклина Dl (Westwick et al., 1997). Кроме того, активация Rac является существенным сигналом, необходимым для Ras-индуцируемой неопластической трансформации (Qiuetal.,1995).
Актиновый цитоскелет и система микротрубочек нормальных эпителиоцитов IAR-2 и трансформированных эпителиоцитов С4 и С5
При анализе цитоскелетных структур, контролирующих форму и клеточную подвижность, мы рассматривали два главных типа морфологической организации культуральных клеток: 1) клетки с поляризованной псевдоподиальной активностью (клетки, имеющие вытянутую форму и выбрасывающие псевдоподии преимущественно на одном, ведущем крае) - фибробласты и фибробластоподобные клетки (нейроны) и 2) неполяризованные клетки (клетки, имеющие дискоидную форму и образующие псевдоподии по всему краю) - эпителиоциты. Ранее было показано, что система микротрубочек играет ведущую роль в организации клеток первого типа - фибробластов и нейронов; разрушение микротрубочек колцемидом или нокодазолом, так же как и нарушение интегральности системы таксолом, превращало эти клетки в неполяризованные (см. Bershadsky and Vasiliev, 1988). Агенты, разрушающие микротрубочки, также резко угнетали псевдоподиальную активность фибробластов, что, по-видимому, связано с активацией Rho и угнетением Rac (Bershadsky et al., 1991, Waterman-Storer et al., 1999). С другой стороны, долгое время было принято считать, что микротрубочки не играют существенной роли в морфогенезе эпителиальных клеток, уже исходно имеющих дискоидную неполяризованную форму. Действительно, в экспериментах по деполимеризации микротубочек не было найдено существенных изменений формы эпителиоцитов при воздействии этих агентов (Vasiliev and Gelfand, 1981, Middleton et al., 1988). Исследователи отмечали лишь некоторое удлинение этапа распластывания клеток при посадке их на подложку в присутствии колцемида (Domnina et al., 1985). До настоящего времени не было проведено систематического изучения роли системы микротрубочек в организации эпителиальных клеток.
Мы поставили своей задачей исследовать роль микротрубочек в организации клеток эпителиального происхождения, имеющих различную морфологию, используя при этом колцемид и таксол, избирательно нарушающие целостную систему микротрубочек. В качестве нормальных эпителиальных клеток мы использовали линию эпителиоцитов печени крыс IAR-2, полученную Montesano et. al. (1973). Кроме того были исследованы характеристики трансформированных эпителиоцитов стабильных линий С4 и С5, полученных нами из клеток IAR-2 методом ретровирусного переноса N-ras AspU к ДНК. Экспрессия экзогеного мутантного онкогена ras приводила к превращению дискоидных эпителиоцитов IAR-2 в поляризованные фибробластоподобные клетки. Подобные изменения морфологии и приобретение трансформированными клетками способности к направленному перемещению по поверхности подложки наблюдали и ранее в культурах эпителиоцитов после трансформации онкогеном ras (Schoenenberger, et al., 1991). В наших экспериментах были использованы колцемид и таксол, агенты, различным образом разрушающие целостную систему микротрубочек клетки. Так, колцемид, так же, как и некоторые другие агенты (колхицин, нокодазол). ингибирует полимеризацию микротубочек in vitro, связываясь с молекулами тубулина (Margolis and Wilson, 1977). Результатом нарушения полимеризации микротрубочек при действии высоких концентраций этих агентов является быстрая разборка большинства микротрубочек в клетке. Таксол стабилизирует микротрубочки, угнетая их динамическую нестабильность, которая заключается в чередовании фаз роста и укорочения на концах микротрубочек (Jordan et al., 1993). На клеточном уровне добавление таксола в культуральную среду фибробластов приводит к замещению целостной системы микротрубочек, расходящихся из перинуклеарной зоны к периферии, на неорганизованное сообщество стабильных микротрубочек, располагающихся случайным образом в клетке и несвязанных с центросомой (см. Bersadsky and Vasiliev, 1988). В этой серии экспериментов мы исследовали влияние колцемида и таксола на морфологию и актиновый цитоскелет нормальных дискоидных эпителиоцитов линии IAR-2 и их трансформированных производных (клеток линий С4 и С5), имеющих поляризованную фибробластоподобную морфологию. Эпителиальные клетки линии IAR-2 при культивировании на плоском субстрате, каковым является поверхность стекла и культурального флакона, формировали островки и пласты (монослои) (Рис. 6). Изолированные клетки IAR-2 были хорошо распластаны на субстрате, имели характерную для эпителиоцитов дискоидную форму и образовывали псевдоподии по всему клеточному периметру (Рис. 7). Окрашивание актина родамин-фаллоидином с последующей флуоресцентной микроскопией показало, что в большинстве клеток имелся типичный для эпителиоцитов кольцевой (краевой) пучок микрофиламентов, расположенный на периферии, а также прямые актиновые пучки, располагавшиеся в цитоплазме случайным образом (Рис. 8А). Иммунофлуоресцентная микроскопия эпителиоцитов IAR-2 с использованием антител к тубулину выявила сеть микротрубочек, выходящих из центра и заполняющих всю цитоплазму (Рис. 8Б). Виментиновые промежуточные филаменты также формировали плотную сеть в цитоплазме (Рис. 8В), кератиновые филаменты в клетках IAR-2 не были обнаружены.
Актин-зависимые перемещения латексных частиц по поверхности нормальных и трансформированных эпителиоцитов
В нашем распоряжении имелась линия трансформированных фибробластов Rat-1/ras, морфология и актиновый цитоскелет которых существенным образом отличались от морфологии исходных трансформированных клеток Rat-1. Фибробласты Rat-1/ras имели узкую веретеновидную форму. На переднем крае клетки образовывали сравнительно небольшую подвижную ведущую ламеллу, здесь же образовывались многочисленные раффлы. Тело клетки не было прикреплено к субстрату, и в густой культуре наблюдались многочисленные подползания одной клетки под тело другой. В целом, псевдоподиальная активность, а также клеточная подвижность Rat-1/ras трансформированных фибробластов была выше, нежели их трансформированных предшественников Rat-1.
В экспериментах с узкой раной мы исследовали столкновения фибробластов Rat-1/ras «голова к голове». После начального соприкосновения ведущих ламелл двух клеток происходило наползание одной ламеллы на ламеллу другой клетки (Рис. 34А), при этом глубина перекрывания ведущих ламелл трансформированных фибробластов составляла 3-5 мкм, а продолжительность движения одной клетки по поверхности другой не превышала 3-5 мин. Непродолжительный этап перекрывания ламелл двух трансформированных клеток быстро сменялся следующим этапом, во время которого происходило формирование новой боковой ламеллы, а также ретракция верхней клетки с поверхности нижней, что, в свою очередь, приводило к изменению направления движения фибробластов и их миграции друг от друга (см. Рис. 34Б). Видеомикроскопические исследования трансформированных фибробластов Rat-1/ras показали, что, как и в случае нормальных фибробластов после установления контакта между клетками в области перекрывания ламелл продолжается центростремительное движение латексных частиц (см. Рис. 33). Таким образом, полученные нами результаты доказывают существование контактного торможения движения у трансформированных фибробластов. Действительно, нетрансформированные и гая-трансформированные фибробласты Rat-І обнаруживали качественно сходные реакции в ходе межклеточных взаимодействий. Как мы описывали ранее (см. Гл. 3), эпителиоциты линии IAR-2 вследствие трансформации мутантным онкогеном ras приобретали фибробластоподобный фенотип. В серии экспериментов мы исследовали коллизии трансформированных эпителиоцитов С4 в узкой ране. Нами были проанализированы псевдоподиальная активность клеток С4 до и во время установления контакта, а также движение латексных частиц в зоне контакта двух клеток. Проведенные эксперименты продемонстрировали существенные различия в поведении трансформированных и нетрансформированныхэпителиоцитов. raw-трансформированные эпителиоциты С4 в культуре не дают плотного монослоя. В густой культуре клетки подползают друг под друга, образуя так называемые крис-кроссы. В ране поляризованные клетки С4 быстро мигрировали на свободную поверхность, разрывая при этом контакты с соседними клетками.
При гомотипических столкновениях в культуре трансформированные эпителиоциты не образовывали стабильный межклеточный контакт. Напротив, при таких столкновениях трансформированные эпителиоциты С4 проходили все стадии взаимодействий, характерные для клеток фибробластного происхождения (Рис. 35). После соприкосновения ведущих ламелл двух клеток в течение 15-30 мин продолжалось выбрасывание псевдоподий, что приводило к значительному перекрыванию ламелл контактирующих клеток (площадь перекрывания ламелл через 10 мин после установления начального контакта составляла 57,19+13,91 мкм , что было в 7 раз выше, чем в культуре клеток IAR-2. Никакого угнетения псевдоподиальной активности как в зоне контакта двух клеток С4, так и на свободном крае по обе стороны от контакта, не происходило. Если до контакта средняя скорость протрузий составляла 1,08+0,18 мкм/мин, а средняя скорость ретракций - 1,20+0,20 мкм/мин, то после установления контакта и перекрывания ламелл эти скорости составили 1,43±0,28 мкм/мин и 0,84+0,18 мкм/мин соответственно. Перекрывание ламелл контактирующих клеток С4 продолжалось 10-15 мин, после чего верхняя ламелла начинала ретрактировать с поверхности нижней клетки. Одновременно с ретракцией происходило формирование новой латеральной ламеллы, что приводило к изменению направления движения клеток и их уходу от места контакта (Рис. 35Б).
Исследование перемещений латексных частиц в зоне контакта двух трансформированных эпителиоцитов также подтвердило принципиальные различия в динамических характеристиках актинового цитоскелета нормальных и трансформированных эпителиоцитов. Мы сравнили движение 10 латексных частиц, помещенных с помощью лазерной ловушки на свободный край неконтактирующих клеток С4, а также на поверхность клеток в области перекрывания двух ламелл. На свободном крае клеток С4 средняя скорость центростремительного перемещения частиц составляла 1,54+0,23 мкм/мин. В зоне контакта двух клеток частицы также двигались центростремительно (Рис. 36), при этом средняя скорость движения составляла О,97±0Д0 мкм/мин.
Контактное торможение движения в культурах нормальных фибробластов
Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание монослоя клеток IAR-2, обработанных ТРА, на Е-кадхерин и (3-катенин с последующей конфокальной микроскопией показало исчезновение непрерывного адгезионного пояса (adhesion belt) - тангенциальных межклеточных контактов, характерных для эпителиальных клеток. Вместо этого адгезионные белки обнаруживались в многочисленных радиально ориентированных межклеточных контактах в зонах перекрывания ламелл соседних клеток (Рис. 73А, Б).
Мы также исследовали влияние ТРА на образование свежих контактов в узкой ране. При коллизиях ведущих ламелл клеток в узкой ране вновь образованные межклеточные контакты, в отличие от тангенциальных контактов контрольных эпителиоцитов, имели радиальную организацию (Рис. 74А, Б). Как показало двойное окрашивание на (3-катенин и актин, такие радиальные контакты были тесно связаны с концами прямых актиновых пучков, расходившихся из центра клеток (Рис. 75). В серии экспериментов мы решили проверить сформулированную нами гипотезу об определяющей роли контрактильности актинового цитоскелета при формировании радиальных межклеточных контактов. Мы использовали ингибитор АТФ-азы миозина BDM и ингибитор Rho-киназы НА-1077, который ингибирует фосфорилирование легкой цепи миозина, регулируя активность фосфатазы миозина (Uehata et al., 1998). Через ЗО мин после того, как в монослое клеток IAR-2 была сделана узкая рана, в среду на 2 часа добавляли ТРА, после чего добавляли на 40 мин ингибитор АТФ-азы миозина BDM (40 мМ) или ингибитор Rho-киназы НА-1077 (20 мкМ). После установления контактов между клетками культуры фиксировали, окрашивали на актин и (3-катенин и исследовали с помощью конфокальной микроскопии.
Результатом действия обоих ингибиторов было исчезновение актиновых пучков в клетках. Клетки в присутствии ТРА и ингибиторов контрактильности продолжали выбрасывать псевдоподии, в которых окрашивалась тонкая сеть микрофиламентов (Рис. 76А). При окрашивании на Е-кадхерин и Р-катенин мы выявили исчезновение радиальных межклеточных адгезии (Рис. 76Б). [3-катенин и Е-кадхерин аккумулировались в виде волнистых линий на периферии клеток в области соприкосновения с соседней клеткой, хотя, в отличие от тангенциальных контактов эпителиоцитов контрольной культуры IAR-2, такие контакты были не ровными, а извитыми и располагались в основании псевдоподий. Полученные результаты свидетельствуют о решающей роли контрактильности прямых актиновых пучков при формировании радиальных межклеточных контактов эпителиоцитов, обработанных ТРА. Таким образом, изменение морфологии и актинового цитоскелета эпителиальных клеток под действием ТРА радикальным образом изменяет пространственную организацию содержащих Е-кадхерин межклеточных адгезионных структур.
Как известно, разрушение микротрубочек нокодазолом усиливает Rho-опосредованную миозин-зависимую контрактильность актинового цитоскелета фибробластов. Мы исследовали влияние короткой инкубации (1 час) большой дозы нокодазола (10 мкг/мл) на геометрию межклеточных адгезионных контактов эпителиоцитов IAR-2 в монослое. При такой постановке опыта нокодазол вызывал практически полную деполимеризацию микротрубочек, что было подтверждено иммунофлуорецентной микроскопией.
В отличие от действия ТРА, в присутствии нокодазола эпителиоциты IAR-2 не приобретали фибробластоподобную форму и в монослое сохраняли вертикальную организацию актинового цитоскелета. В то же время окрашивание на Е-кадхерин выявило резкое отличие морфологии межклеточных адгезионных контактов клеток, обработанных нокодазолом от тангенциальных контактов контрольной культуры. Как показала конфокальная микроскопия, в присутствии нокодазола между клетками располагались многочисленные радиальные контакты (Рис. 77). Апикальные актиновые пучки после добавления нокодазола выглядели утолщенными на концах, прикрепленных к кольцевому актиновому пучку (Рис. 78). Двойная флуресцентная микроскопия с использованием родамин-фаллоидина и антител к Р-катенину показала колокализацию радиальных межклеточных контактов с утолщенными концами апикальных актиновых пучков. Удлинение инкубации культуры с нокодазолом до 6 часов приводило к восстановлению тангенциальной организации межклеточных контактов эпителиоцитов IAR-2.
