Введение к работе
Актуальность проблемы
Межклеточные адгезионные контакты (АК) образованы кадхеринами, которые через сложный белковый комплекс адгезионной бляшки ассоциированы с актиновыми микрофиламентами. АК нормальных эпителиальных клеток играют важнейшую роль в поддержании целостности эпителиальных пластов, обеспечивая механическое соединение клеток. При опухолевой трансформации клеток эпителиального происхождения разрушается стабильная межклеточная адгезия. Одним из следствий нарушений межклеточной адгезии является приобретение трансформированными клетками способности к инвазии. Во многих карциномах наблюдается эпигенетическое подавление экспрессии гена Е-кадхерина CDH1. Однако описаны некоторые опухоли эпителиального происхождения, в которых сохраняется экспрессия E-кадхерина. Из этого можно сделать вывод, что межклеточная адгезия может нарушаться без подавления экспрессии E-кадхерина. Исследования трансформированных эпителиальных линий, клетки которых экспрессируют E-кадхерин, могут прояснить механизмы нарушения межклеточной адгезии при опухолевой трансформации.
Хорошо известны различия в организации актинового цитоскелета и АК клеток двух тканевых типов: эпителиоцитов и фибробластов. АК эпителиоцитов образованы Е-кадхерином, имеют тангенциальную организацию и связаны с периферическим актиновым пучком. Нормальные фибробласты имеют радиальную организацию АК, ориентированных перпендикулярно межклеточной границе и ассоциированных с прямыми актиновыми пучками (Yonemura et al., 1995). Формирование АК фибробластов существенным образом зависит от контрактильности актина-миозина (Gloushankova et al., 1998, Miyake, 2006). Вместе с тем до сих пор не были исследованы закономерности формирования АК трансформированных эпителиоцитов, не были исследованы межклеточные взаимодействия эпителиоцитов, сохранивших при трансформации экспрессию Е-кадхерина. Помимо этого остаётся невыясненным функциональное значение изменений актинового цитоскелета, особенно потери краевого актинового пучка, в ослаблении межклеточной адгезии при трансформации эпителиоцитов.
На современном этапе общепризнанной считается роль малых ГТФаз семейства Rho в регуляции перестроек актинового цитоскелета (Heasman and Ridley, 2008). Имеются также данные о вкладе Rho ГТФаз в построение АК эпителиальных клеток. Сравнительные исследования роли ГТФаз Rho и Rac в нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитах могут прояснить их вклад в разрушение стабильной межклеточной адгезии при трансформации.
В последнее время использование рекомбинантных внутриклеточных белков, меченных флуоресцентными красителями, позволило проводить исследования динамики формирования АК и структур актинового цитоскелета в живых клетках. Изучение распределения меченых белков АК трансформированных и нетрансформированных эпителиоцитов при формировании межклеточных контактов может предоставить важные данные о самых ранних этапах формирования АК. Также, это может выявить различия в белковой организации АК нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток.
Таким образом, изучение динамики формирования АК, её связи с перестройками актинового цитоскелета и малыми ГТФазами семейства Rho и её изменений в результате неопластической трансформации является одной из важнейших задач современной экспериментальной онкологии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является выявление различий в организации, динамике, формировании и регуляции АК нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток в культуре.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительные исследования организации актинового цитоскелета и АК нетрансформированных эпителиоцитов линии IAR-2, и эпителиоцитов линии IAR-6-1, трансформированных диметилнитрозамином.
2. Сравнить динамику АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов.
3. Изучить особенности формирования АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов.
4. Изучить аккумуляцию актина и зиксина в АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов.
5. Исследовать роль малых ГТФаз семейства Rho (Rac и Rho) и их эффекторов в формировании АК.
Научная новизна и практическая значимость работы
В настоящей работе впервые обнаружены различия в организации, динамике, формировании и регуляции сборки АК малыми ГТФазами семейства Rho в нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клетках.
В работе впервые установлено, что при неопластической трансформации в культурах эпителиальных клеток IAR, несмотря на сохранение экспрессии Е-кадхерина, утрата краевого актинового пучка сопровождается изменением пространственной организации E-кадхерин-содержащих АК. При трансформации эпителиоцитов непрерывные тангенциальные АК заменяются радиальными АК. Было показано, что подобное изменение пространственной организации АК сопровождается разрушением стабильной межклеточной адгезии. В трансформированных эпителиальных клетках IAR-6-1 стабильные АК замещаются динамичными АК.
В настоящей работе впервые было выявлено, что АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов формируются по-разному. Начальные точечные АК нетрансформированных эпителиальных клеток IAR-2 претерпевают латеральное расширение и формируют зрелый тангенциальный АК вдоль межклеточной границы. В случае трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1, в перекрывающихся ламеллах контактирующих клеток начальные точечные АК растут и превращаются в индивидуальные радиальные АК, ориентированные перпендикулярно межклеточной границе и ассоциированные с прямыми актиновыми пучками.
Было обнаружено, что формирование АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR требует активности малой ГТФазы Rho. При этом формирование тангенциальных АК нетрансформированных эпителиальных клеток зависит от активности эффектора Rho mDia1 и не зависит от активности другого эффектора Rho ROCK. Впервые обнаружено, что формирование радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток, напротив, не зависит от активности mDia1 и требует активности ROCK и индуцируемой ею контрактильности актина-миозина. Помимо этого было показано, что формирование тангенциальных АК нетрансформированных эпителиальных клеток зависит от активности малой ГТФазы Rac. Напротив, формирование радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток может происходить и в условиях ингибирования активности Rac.
Полученные результаты выявляют неизвестные ранее закономерности реорганизации Е-кадхерин-содержащих АК при неопластической трансформации и их взаимосвязь с функционированием малых ГТФаз семейства Rho и перестройками актинового цитоскелета. Наряду с теоретическим, полученные данные имеют научно-практическое значение при разработке подходов в диагностике ранних стадий злокачественных опухолей эпителиального происхождения. Перестройки актинового цитоскелета и АК могут использоваться в качестве признаков, которые помогут в выявлении клеток, находящихся на ранних этапах неопластической трансформации.
Апробация работы
Диссертация апробирована на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и отдела математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 29 сентября 2010 г.
Материалы диссертационной работы были представлены на XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006); на всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009), а также на международной школе-конференции «Биология – наука XXI века (Пущино, 2009).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 112 страницах, содержит 24 рисунка и состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список литературы включает 251 цитируемый источник.
