Содержание к диссертации
Введение 6
Глава 1 Литературный обзор 9
Особенности структурной организации хрусталика 9
Биохимические аспекты помутнения хрусталика 17
Экспериментальные модели катарактогенеза; факторы, вызывающие 19 развитие катаракты и механизмы их повреждающего действия
Типы катаракт у человека 25
Современные методы лечения катаракты у человека 34
Регуляторные белки межклеточного пространства, биологически 40 активные в сверхмалых дозах
Глава 2 Экспериментальная часть. Материалы и методы исследования 44
Используемые реактивы и оборудование 44
Объект исследования 45
Выделение регуляторного белка из хрусталика глаза быка, его очистка и 45 исследование дозовой зависимости
Получение тканевого экстракта 45
Высаливание тканевого экстракта хрусталиков сернокислым аммонием 46
Изоэлектрофокусирование 46
Электрофорез в полиакриламидном геле 46
Определение вторичной структуры с помощью метода кругового дихроизма 47
Определение гидродинамического радиуса частиц фракции кислый 48 регуляторноый белок хрусталика в водном растворе
Определение радиуса частиц, присутствующих в растворе фракции кислый 49 регуляторный белок хрусталика, методом атомно-силовой микроскопии
Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 49
Биотестирование регуляторного белка хрусталика 49
Определение концентрации белка во фракциях регуляторного белка 50 хрусталика
Экспериментальные модели катарактогенеза in vitro - органотипические 51 культуры хрусталиков глаз позвоночных животных
Дозовая зависимость химических агентов, индуцирующих катаракто генез у 51 позвоночных животных in vitro
Влияние регуляторного белка хрусталика на модели катарактогенеза in vitro 52
Модели катарактогенеза на культурах хрусталиков глаз 52 лягушки Xenopus levis
Модели катарактогенеза на культурах хрусталиков глаз быка 53
Модели катарактогенеза на культурах хрусталиков глаз крысы Wistar 54
2.11 Влияние регуляторного белка хрусталика на модели катарактогенеза, 54
разработанные на крысах Wistar in vivo
Модель травматической катаракты 54
Модель лучевой катаракты 5 5
Гистологический метод исследования 55
Иммунологический метод исследования 56
Определение степени помутнения хрусталиков позвоночных животных 58 методом спекторофотометрии
Глава 3 Результаты и их обсуждение 59
Выделение, очистка регуляторного белка хрусталика глаза быка; 59 определение дозовой зависимости его биологического действия
Исследование фракции кислый регуляторный белок хрусталика методом 64 кругового дихроизма
Исследование методами динамического светорассеяния и атомно-силовой 66 микроскопии размеров частиц регуляторного белка хрусталика, присутствующих в водном растворе
Определение локализации регуляторного белка в хрусталике позвоночных 70
Изучение дозовой зависимости химических агентов, индуцирующих 73 катарактогенез у позвоночных животных in vitro
Исследование влияние регуляторного белка хрусталика на 84 экспериментальные модели катарактогенеза in vitro
Модели катарактогенеза на культурах хрусталиков глаз лягушки 84 Xenopus laevis
Модели катарактогенеза на культурах хрусталиков глаз быка 85
Модели катарактогенеза на культурах хрусталиков глаз крысы Wistar 85
3.7 Исследование влияния регуляторного белка хрусталика на 99
экспериментальные модели катарактогенеза, разработанные на крысах
Wistar in vivo
3.1 Л Модель травматической катаракты in vivo 99
3.7.2 Модель лучевой катаракты in vivo 106
Заключение Н 4
Выводы 116
Список литературы 117
Список использованных сокращений АТФ - аденозинтрифосфат БАД - биологически активные добавки ВКМ - внеклеточный матрикс Гл-6Ф-ДГ - глюкозо-бфосфат-дегидрогеназа ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИФК - инфракрасное излучение ИЭФ - изоэлектрофокусирование КРС - крупный рогатый скот
КРБХ - кислый регуляторный белок хрусталика (фракция после ИЭФ) КРБХ-Э - кислый регуляторный белок хрусталика (фракция после ПААГ) мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота НПВС - нестероидные противовоспалительные средства ПААГ - полиакриламидный гель ПОЛ - перекисное окисление липидов ПФП - пентозофосфатный путь РБ - регуляторный белок СД - сахарный диабет СМД - сверхмалые дозы СК - стволовая клетка УФО - ультрафиолетовое облучение цАМФ - циклический аденозинмонофосфат ЦНС - центральная нервная система ЦТК - цикл трикарбоновых кислот GSH-tr - глутатионтрансфераза GSH-per - глутатаионпероксидаза GSH-red - глутатионредуктаза
Введение к работе
В настоящее время в мире насчитывается около 50 миллионов больных с помутнением хрусталика, более половины из них требуется хирургическое вмешательство, приблизительно 67% людей преклонного возраста страдают этой патологией, а после 80 лет - практически все [Мальцев Э.В., Павлюченко К.П., 2002]. Велико желание врачей, а тем более больных, избежать оперативного вмешательства, несмотря на современную технику хирургии, а также на полученные в этой области офтальмологии блестящие результаты. Применяемые в повседневной практике антикатарактальные фармакологические препараты не обладают желаемым клиническим эффектом. В связи с этим разработка новых медикаментозных средств для профилактики развития катаракты, также ее рассасывания, продолжает оставаться актуальной проблемой современной офтальмологии.
Известно, что состояние межклеточных адгезионных взаимодействий в тканях является важнейшим фактором, определяющим регуляцию гомеостаза у позвоночных на органно-тканевом уровне [Васильев, Маленков, 1968; Anderson, 1990; Turner, 1992]. Ранее было показано, что в различных тканях животных, в том числе и в тканях глаза, содержатся регуляторные белки, которые характеризуются способностью в сверхмалых дозах, соответствующих 10~10 - 10"16мг белка/мл, оказывать влияние на ход и направленность основных биологических процессов, протекающих в тканях: адгезию, миграцию, дифференцировку и пролиферацию клеток [Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Гундорова и др., 1997; Ямсков и др., 1999; Краснов и др., 2003а]. В основе молекулярного механизма биологического действия регуляторных белков этой группы лежит их способность стимулировать резервный клеточный отдел соответствующей ткани за счет регуляторного воздействия на микроокружение его клеток и, таким образом, регулировать распространение и прохождение регуляторного сигнала в ткани [Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003а]. Было показано, что регуляторные белки данной группы локализованы в межклеточном пространстве соответствующей ткани взрослых особей позвоночных животных [Краснов и др., 2003а; Маргасюк и др., 2005]. Биологическая активность данных регуляторных белков характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности [Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003а].
На основе регуляторных белков, обнаруженных ранее в тканях млекопитающих, были разработаны фармакологические препараты нового поколения, которые обладают рядом позитивных свойств, таких как отсутствие побочных воздействий на организм,
способность в сверхмалых дозах стимулировать восстановительные и репаративные процессы в патологически измененных тканях Цундорова и др., 1997; Ямсков, Ямскова, 1998; Романова и др., 2004]. Одним из таких препаратов является созданный на основе регуляторного белка, выделенного из сыворотки крови быка, Адгелон - глазные капли, в настоящее время применяемый для лечения ряда кератопатий [Романова и др., 2004].
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния нового, ранее не известного регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на развитие катарактогенеза у позвоночных животных в эксперименте in vitro и in vivo.
В отдельные задачи данного исследования входило:
Идентификация регуляторного белка, биологически активного в сверхмалых дозах, в хрусталике глаза млекопитающих; его очистка, изучение физико-химических свойств, а также изучение дозовой зависимости биологического действия.
Исследование локализации изучаемого регуляторного белка в хрусталике глаза позвоночных животных.
Разработка экспериментальных моделей катарактогенеза у позвоночных животных in vitro и in vivo, отражающих различные механизмы возникновения данной патологии.
Изучение протекторного действия регуляторного белка хрусталика на экспериментальных моделях катарактогенеза in vitro и in vivo.
Научная новизна.
Впервые в хрусталике глаза млекопитающих идентифицирован ранее не изученный регуляторный белок (РБ), действующий в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10"12 - 10"15 мг белка/мл. Показано, что данный РБ является низкомолекулярным белком, вторичная структура которого характеризуется преимущественным содержанием р-структур и статистического клубка. Установлено, что молекулы РБ хрусталика образуют в водных растворах наноразмерные частицы. Для изучения специфической активности РБ хрусталика были применены экспериментальные модели катарактогенеза in vitro и in vivo, различающиеся по механизму развития патологического процесса и отражающие наиболее часто встречаемые типы -катаракт у человека: травматическая, некоторые формы сенильной катаракты, диабетическая и др. Была впервые разработана экспериментальная модель катарактогенеза in vitro, в основе которой лежит механизм нарушения электролитного баланса в хрусталике позвоночных животных — аналог диабетической катаракты человека. На данных экспериментальных моделях катарактогенеза у позвоночных животных in vitro и in vivo было проведено исследование РБ хрусталика и
впервые было показано, что данный белок в СМД тормозит развитие катаракт, в основе которых лежит нарушение работы Са -зависимых ферментных систем, а также систем перекисного окисления липидов.
Практическая значимость работы.
На основании результатов проведенного исследования, свидетельствующих о способности изучаемого РБ хрусталика проявлять в эксперименте протекторное свойство, представляется возможной разработка нового фармакологического препарата для профилактики, а также лечения катаракты у человека.
Положения, выносимые на защиту:
Идентификация биологически активного в сверхмалых дозах РБ в хрусталике глаза позвоночных.
Локализация исследуемого белка в хрусталике глаза позвоночных.
Влияние РБ, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез в экспериментальных моделях у позвоночных животных in vitro и in vivo, отражающих различные механизмы данной патологии.
Отсутствие видовой специфичности биологического действия РБ хрусталика.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 134 страницах, содержит 235 литературных источников (62 отечественных, 173 зарубежных), 43 рисунка и 8 таблиц и состоит из: Введения;
Литературного обзора; Главы "Материалы и методы исследования"; Главы "Экспериментальная часть"; Главы "Результаты и их обсуждение"; Выводов.
