Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Эпидемиология возрастной катаракты 12
1.2 Структура, ультраструктура и химический состав нормально функционирующего хрусталика 13
1.3 Современные представления об этиологии и патогенезе возрастной катаракты 16
1.3.1 Патоморфологическая картина помутнения хрусталика 16
1.3.2 Химический состав мутнеющего хрусталика 18
1.3.3 Факторы риска возрастной катаракты 19
1.3 Л Свободнорадикальная концепция катарактогенеза 21
1.3.5 Агрегация водорастворимых белков хрусталика 24
1.4 Современное состояние проблемы медикаментозного лечения возрастной катаракты 25
1.5 Биохимические предпосылки применения комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) для предупреждения развития УФ-индуцированной катаракты 27
1.6 Экспериментальные модели катаракт 36
Глава 2 Материал и методы исследования
2.1 Общая структура исследований 41
2.2 Моделирование экспериментальной катаракты 42
2.3 Методы клинических исследований в эксперименте 43
2.3.1 Субъективная клиническая оценка 43
2.3.2 Объективная клиническая оценка 45
2.4 Методы гистологического исследования 46
2.5 Методы биохимических исследований в эксперименте 47
2.5.1 Выделение основных белков хрусталика 47
2.5.2 Гель-проникающая хроматография белков хрусталика 49
2.5.2.1 Гель-проникающая хроматография водорастворимых белков хрусталика 49
2.5.2.2 Гель-проникающая хроматография водонерастворимых белков хрусталика 50
2.5.3 Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) 51
2.5.3.1 Электрофорез в ПААГ водонерастворимых белков хрусталика 51
2.5.3.2 Электрофорез в ПААГ водорастворимых
белков хрусталика 52
2.6 Методика статистического анализа 52
Глава 3 Результаты собственных исследований
3.1 Клиническое течение УФ-индуцированной катаракты 54
3.2 Результаты применения комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты по данным метода экспертных оценок...58
3.3 Результаты применения комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты по данным микроденситометрического анализа 59
3.4 Результаты применения комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты по данным гистологического исследования 61
3.5 Влияние комбинации препаратов на состояние основных белков хрусталика крысы на модели УФ-индуцированной катаракты 66
3.5.1 Результаты разделения водорастворимых белков хрусталиков глаз животных из разных экспериментальных групп при помощи гель-проникающей хроматографии 67
3.5.2 Результаты электрофореза водорастворимых белков в ПААГ 70
3.5.3 Определение количества водонерастворимых белков целого хрусталика 71
3.5.4 Результаты разделения водонерастворимых белков при помощи гель-проникающей хроматографии 73
3.5.5 Результаты электрофореза водонерастворимых белков в ПААГ 77
3.6 Результаты воздействия комбинации препаратов на передний и задний отрезок глаза в условиях ультрафиолетового облучения по данным гистологического исследования 79
Заключение 88
Выводы 98
Список литературы 100
- Структура, ультраструктура и химический состав нормально функционирующего хрусталика
- Моделирование экспериментальной катаракты
- Клиническое течение УФ-индуцированной катаракты
- Результаты применения комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты по данным гистологического исследования
Введение к работе
В структуре слепоты и слабовидения возрастная катаракта занимает одно из ведущих мест в мире [26, 27, 63, 140]. В то же время, возрастная катаракта приобретает все большее социальное значение благодаря отмечаемым в последние годы сдвигам дермографических показателей в сторону постарения населения.
В настоящее время нет эффективного медикаментозного лечения возрастной катаракты, поэтому основными способами лечения являются хирургические вмешательства [63]. В России ежегодно выполняется 180 тыс. операций по поводу катаракты, но это охватывает лишь десятую часть от общего количества больных [35]. В то же время, хирургическое лечение не является патогенетически обоснованным, в отличие от медикаментозного. Несомненно, что знание этапов патогенеза развития возрастной катаракты явилось бы основой для эффективной медикаментозной терапии. Однако патофизиологические процессы начала этого заболевания еще далеко не полностью установлены. Поэтому в исследовании этиологии катаракты уже многие годы заняты не только представители медицинской науки, но и исследователи в области молекулярной биологии, биохимии и биофизики [24]. Существенным достижением является сформулированная в последние годы свободнорадикальная теории катарактогенеза. Подтверждением ее справедливости является факт того, что в офтальмологической практике применяют препараты, обладающие антиоксидантными (АО) свойствами [6, 29, 50, 116, 153, 187, 215]. В то же время, катаракта - это многофакторное и многостадийное заболевание, поэтому существует возможность воздействия и на другие этапы процесса катарактогенеза. Например, на стадию образования водонерастворимых белковых агрегатов, образование которых признано одной из ключевых стадий процесса развития катракты [47, 72, 120, 129, 158].
Действительно оказалось, что усиление шаперон-подобных свойств а-кристаллина, то есть его способности предупреждать агрегацию поврежденных белков, лежит в основе механизма антикатарактального действия тетрапептида D-пантетина. Как известно, это соединение эффективно тормозит развитие экспериментальных катаракт (радиационной, селенитовой, галактозной, стрептозотоциновой и др.) [101, 119].
Последние исследования показали, что N-ацетил карнозин, обладающий антикатарактальным действием [82], способен тормозить ультрафиолет-индуцированную агрегацию р\-кристаллина in vitro как молекулярный шаперон [40]. Более того, смесь этих пептидов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) in vitro более эффективно тормозит процесс агрегации кристаллинов под воздействием ультрафиолетового излучения (УФ), чем каждый из них в отдельности [59, 186].
Полученные результаты дали основания для разработки новой комбинации антикатарактальных препаратов, действующей по шаперон-подобному механизму.
Условия формирования помутнений хрусталиков in vitro полностью не могут повторить условия развития катаракты в живом организме, поэтому, чтобы дать окончательный ответ об эффективности предложенной комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина), необходимо изучение ее антикатарактальных свойств in vivo.
Для постановки такого эксперимента необходима легко воспроизводимая и адекватная модель возрастной катаракты. По данным литературы, катаракта, индуцированная низкими дозами ультрафиолетового облучения (УФО) приближена к возрастной. Действительно, под влиянием УФ и видимого света в хрусталике происходят процессы фотоокисления и агрегации водорастворимых белков, что является одним из основных этапов патогенеза возрастной катаракты [80, 120, 129, 130, 149].
Таким образом, актуальность изучения воздействия комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в эксперименте несомненна.
Целью работы является изучение воздействия комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в эксперименте на крысах.
Задачи исследования
1. Разработать легко воспроизводимую пролонгированную экспериментальную модель УФ-индуцированной катаракты;
2. Разработать шкалу субъективной оценки степени прозрачности хрусталика крысы вида Wistar для этой модели;
3. Изучить особенности клинической картины УФ-индуцированной катаракты на разных этапах ее формирования;
4. Изучить влияние УФ на передний и задний отрезок глаза;
5. Исследовать эффективность применения различных доз комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на развитие УФ-индуцированной катаракты на основе клинико-морфологических и биохимических методов исследования;
6. Определить эффективность применения различных способов введения комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина).
Научная новизна работы
1. Разработана пролонгированная модель УФ-индуцированной катаракты, что открывает перспективы для контролирования ближайших и отдаленных результатов медикаментозного воздействия на развитие возрастной катаракты у крыс (положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2007118210 от 16.05.2007 «Способ моделирования катаракты»);
2. Изучены этапы формирования УФ-индуцированной катаракты в различных слоях хрусталика в эксперименте на крысах;
3. Впервые в условиях in vivo произведено исследование действия комбинации препаратов нового класса (N-ацетил карнозина и D-пантетина) - шаперон-подобных соединений на модели УФ-индуцированной катаракты и доказана антикатарактальная эффективность комбинации препаратов, как препаратов нового поколения (заявка на выдачу патента на изобретение «Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты)» № 2007144339 от 3.12.2007);
4. Впервые, на основе клинико-морфологических и биохимических методов исследования определен наиболее эффективный способ введения комбинации препаратов, содержащей N-ацетил карнозин и D-пантетин.
Полученные данные в эксперименте на крысах, касающиеся антикатарактальной эффективности комбинации N-ацетил карнозина и D-пантетина при УФ-индуцированной катаракте, дают теоретическое обоснование для клинического изучения антикатарактальных свойств комбинации этих препаратов при возрастной катаракте.
Практическая значимость работы
1. Доказана возможность клинического изучения комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина);
2. Представленные в работе данные об антикатарактальном действии комбинации препаратов обосновывают перспективность поиска эффективных комбинаций аналогов этих соединений, обладающих более выраженной шаперон-подобной антикатарактальной активностью.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Клинико-морфологическая картина, установленная на модели УФ-индуцированной катаракты, достоверно отражает степень патологических нарушений, происходящих в хрусталике, и может использоваться для контроля эффективности медикаментозной терапии возрастной катаракты;
2. Длительное введение смеси ди- и тетрапептидов в экспериментально-терапевтических дозах (по 25, 150 мг/кг внутрибрюшинно и 5 % раствора инстилляционно каждого из пептидов) оказывает тормозящее действие на развитие УФ-индуцированной катаракты;
3. Наиболее выраженный антикатарактальный эффект комбинации препаратов по результатам клинико-морфологических и биохимических методов исследования выявлен при инстилляционном пути введения;
4. Комбинация пептидных препаратов в виде инстилляций и внутрибрюшинных инъекций оказывает выраженное протекторное действие на роговицу.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на Конференции молодых ученых (Клинические и экспериментальные исследования в офтальмологии) — М., 2005, где доклад получил призовое место; на II Всероссийской научной конференции молодых ученых (Актуальные проблемы офтальмологии) - М., 2007, где доклад был отмечен первой премией; на Юбилейной научно-практической конференции (Федоровские чтения) - М., 2007; на Научно-практической конференции (Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры) - М., 2007.
Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии «Терапевтическая офтальмология и офтальмофармакология» ГУ НИИ глазных болезней РАМН (Протокол № 3/1 от 21 марта 2008 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 5 в центральной печати. Подано 2 заявки на выдачу патентов на изобретения: положительное решение о выдаче патента по заявке № 2007118210 от 16.05.2007 «Способ моделирования катаракты»; приоритетная справка № 2007144339 от 3.12.2007 «Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя использованной литературы.
Работа иллюстрирована 6 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель содержит 217 источников, из них 70 отечественных и 147 зарубежных авторов.
Автор работы выражает свою искреннюю благодарность заведующему отделением терапевтической офтальмологии и офтальмофармакологии Научно-исследовательского института глазных болезней Российской академии медицинских наук, профессору Геннадию Серафимовичу Полунину и действительному члену Российской академии наук, заведующему лабораторией Физико-химических основ рецепции Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Михаилу Аркадиевичу Островскому.
Структура, ультраструктура и химический состав нормально функционирующего хрусталика
Хрусталик - прозрачное полутвердое бессосудистое тело в форме двояковыпуклой линзы, с оптической точки зрения представляющее собой часть преломляющего аппарата глаза. С течением времени хрусталик претерпевает последовательные возрастные изменения. У новорожденных хрусталик мягкой консистенции, прозрачный, бесцветный. Начиная с 40-45 лет центральная часть (ядро хрусталика) становится плотной за счет потери воды, и только периферические его части (корковый слой) остаются мягкими. В хрусталике человека присутствует желтый пигмент (хромофор), накопление которого является нормальным проявлением процесса старения. За счет пигмента устраняются хроматические аберрации, достигается больший контраст изображения при освещении ярким светом и обеспечивается защита сетчатки от УФ и синего света [42 ,43, 46, 200].
Гистологически хрусталик состоит из эластичной капсулы, в которой различают передний и задний отделы, однослойного эпителия, расположенного под передней капсулой, и веретеновидных, волокнистых клеток (фибрилл), плотно прилежащих друг к другу [57, 147].
Капсула состоит из коллагенов, ламинина и мукополисахарида гепаран-сульфата. Важная роль последнего заключается в организации структуры матрикса и поддержании прозрачности капсулы [28, 118]. При световой и фазово-контрастной микроскопии капсула представляет собой гомогенную бесструктурную мембрану, на внутренней задней поверхности которой располагаются углубления, куда входят волокна хрусталика [173].
В эпителии хрусталика выделяют три популяции клеток. Поверхностный слой клеток содержит органеллы и обеспечивает активный транспорт ионов, аминокислот, предшественников синтеза липидов в хрусталик, а также облегченную диффузию глюкозы. Рост хрусталика происходит путем удлинения дифференцирующихся эпителиальных клеток (вторая популяция), которые превращаются в хрусталиковые волокна в области экватора [128, 152]. Третья группа клеток представляет собой зрелые хрусталиковые волокна, в которых отсутствует большинство клеточных органелл [85, 136, 180].
Волокна хрусталика контактируют друг с другом посредством шаравидно-гнездовых, языковидных соединений и десмосом [84].
В нормально функционирующем хрусталике содержится высокая концентрация белка и коэффициент преломления цитоплазмы клеток равен коэффициенту преломления мембран [89], за счет чего хрусталик прозрачен. Кроме того, на органном уровне относительная прозрачность хрусталика обеспечивается также за счет отсутствия в нем кровеносных сосудов, ограничения числа внутриклеточных органелл хрусталиковых волокон, меньшей ширины межклеточных пространств относительно длины световой волны [142]. Однако, прозрачность хрусталика определяется как клеточным, так и субклеточным уровнем его организации. Приведенный ниже анализ данных литературы посвящен химическому составу нормально функционирующего хрусталика.
Белки хрусталика составляют 35 % массы хрусталика и более 85 % его сухого веса [105]. СТ. Мбгпег (1894) [148] впервые идентифицировал в хрусталике белки нескольких типов: водорастворимые а-, 0- и у-кРисталлины (80-90 %) и водонерастворимые белки (10-20 % сухой массы).
Кристаллины являются главными структурными белками клеточных волокон, образуя упорядоченный гель с низким содержанием воды. Накапливаясь по мере созревания волокон, они составляют до 30 % сырого веса клетки [137]. В прозрачных хрусталиках человека содержится 17,5 % а-, 65 % р- и 17,5 % у-кристаллинов [89]. а-кристаллины — полидисперсные глобулярные частицы с молекулярной массой около 800 кД [197]. Молекула а-кристаллина состоит из нескольких десятков субъединиц двух типов А и В. аА-кристаллины имеют молекулярную массу 19,909 кД, аВ-кристаллины - 20,159 кДа [193]. р-кристаллины составляют более 50 % кристаллинов хрусталика взрослых животных и человека. Это белковые частицы разного размера, подразделяющиеся на две фракции: с молекулярной массой от 50 до 300 кД [182]. В молекуле Р-кристаллина выделяют три разновидности основных (РВ1, РВ2, РВЗ) и четыре разновидности кислых (РАЬ РА2, РА3, РА4) полипептидов [185].
Одиночные цепи у-кристаллина имеют среднюю молекулярную массу 17 кД разделяются на 5 фракций [160].
Водонерастворимые белки хрусталика состоят из растворимых и не растворимых в растворе мочевины белков. Большинство растворимых в мочевине водонерастворимых белков как в прозрачных, так и катарактальных хрусталиках, представляют собой комплексы аА- и аВ-кристаллинов с Р-кристаллинами или а- и Р-кристаллинов с филензимом и виментином. Водонерастворимые не растворимые в мочевине белки прозрачных хрусталиков содержат аА- и аВ-кристаллины, в катарактальных хрусталиках аА-кристаллины отсутствуют [120, 121].
Распределение белков в хрусталике неравномерное. Отмечается относительное преобладание а- и Р-кристаллинов в коре, а водонерастворимых белков в ядре хрусталика [159]. у-кристаллин также преобладает в ядре, а именно в центральных волокнах, которые располагаются вдоль оптической оси хрусталика [160].
С возрастом содержание в хрусталике низкомолекулярной фракции а-кристаллина уменьшается. Количество у-кристаллина также имеет тенденцию к снижению [72, 103, 211]. К возрастным особенностям относится и такая модификация белков, как образование дисульфидных связей между молекулами белка и глутатионом (ГЛУ) или цистеином [139].
Моделирование экспериментальной катаракты
Эксперимент проведен на 33 крысах самцах вида Wistar (66 глаз) в возрасте от 20 до 23 дней с массой тела 39-41 гр. Срок наблюдения составил 10 месяцев (43 недели). К концу исследования масса тела животных достигала 400-450 г.
Экспериментальные животные находились в стандартных условиях содержания в виварии ММА им. Сеченова на типовых рационах летнего и зимнего периода для лабораторных крыс. Животных выводили из эксперимента через 10 месяцев методом передозировки хлороформного наркоза согласно «Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research» [216].
В работе использовали растворы D-пантетина (C22Ht2N40gS2, мол. масса (FW) - 554,72), производитель «Sigma-Aldrich» (USA) и растворы N-ацетил карнозина (CnHi6N404, FW - 268), полученного путем ацетилирования L-карнозина (C9H14N4O3, FW - 226) с замещением Р-аланила на остаток 2,3-диаминопропионовой кислоты, любезно предоставленный С.Л. Стволинским (ГУ Научный центр неврологии РАМН), рН растворов -7,0. Все животные были разделены случайным образом на 5 групп (Табл. 2.1). Первую группу составили животные, которым инициировали формирование УФ-индуцированной катаракты, но не вводили комбинацию препаратов;
Вторую (контрольную) группу составили 7 крыс, которые не подвергались воздействию УФ и не получали комбинацию препаратов; -42 В третьей группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию препаратов в виде инстилляций в оба глаза 5 % раствора каждого; В четвертой группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию препаратов в виде внутрибрюшинных инъекций в дозе 25 мг/кг ПТ и 25 мг/кг NAC; В пятой группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию пептидов в виде внутрибрюшинных инъекций в дозе по 150 мг/кг каждого из пептидов.
Инстилляций и внутрибрюшинные инъекции проводили однократно каждый день в течение всего периода наблюдения (10 месяцев). В те дни, когда животных облучали, комбинация препарата вводилась за 45 минут до облучения.
Хрусталики фиксировали в 2 % растворе глютаральдегида в течение суток. Затем проводили обезвоживание ткани по батарее спиртов восходящей концентрации и заливали в эпон-аралдит. Полутонкие срезы толщиной 1-1,5 мкм готовили на ультрамикротоме («LKB», Швеция). Полученные срезы окрашивали полихромным красителем (метиленовый синий + фуксин). Готовые препараты исследовали методом световой микроскопии. Светооптическое и морфометрическое исследование препаратов проводили на «Фотомикроскопе III» («Opton», Германия) с помощью аппаратно-программного комплекса автоматической морфоденситометрии компании «ДиаМорф» («ДиаМорф Объектив»). Фоторегистрация осуществлялась на цифровую фотовидеокамеру «ДиаМорф» в составе комплекта. Гистологические исследования выполнены на базе патогистологической лаборатории ГУ НИИ глазных болезней РАМН.
Биохимические исследования проводили на базе Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук.
После остановки сердца при передозировке хлороформного наркоза экспериментальным животным проводили энуклеацию и, разрезав по экватору капсулу, выделяли хрусталик. Выделение основных белков хрусталика проводили по модифицированной нами методике Чиоу [99]. Затем хрусталик гомогенизировали, при этом на один хрусталик приходилось 1 мл фосфатного буфера с добавлением ингибиторов протеаз (20 мМ NaH2P04, 20 мМ Na2HP04, ЭДТА, NaN3, Ю-3 М PMSF, Ю-3 М йодацетамид).
Затем определяли концентрацию белка в гомогенате по методу микробиурета [11]. Для этого разводили гомогенат в 20 раз (10 мкл гомогената +190 мкл буфера=200 мкл образца). К образцу добавляли 400 мкл 6 % NaOH и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Добавляли 20 мкл реактива Бенедикта, инкубировали 5 минут при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность при 330 нм. Затем по калибровочному графику, полученному с помощью стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина, рассчитывали концентрацию белка в гомогенате.
На следующем этапе производили разделение водорастворимых и водонерастворимых белков. Гомогенат центрифугировали при 20000g в течение 25 минут (Beckman-Coulter L7, USA). После центрифугирования надосадочная жидкость содержала фракцию водорастворимых белков, оставшийся осадок - фракцию водонерастворимых белков. Концентрацию водорастворимых белков определяли также по микробиурету. Зная концентрацию водорастворимых белков, оценивали концентрацию водонерастворимых белков.
Для определения соотношения фракций белков в настоящее время используются современные методы исследования протеомики белка: электрофорез, хроматография и масс-спектрометрия. Но, так как согласно результатам ряда исследований мы ожидали, что основной биохимический эффект при развитии возрастной катаракты будет выражаться в агрегации водорастворимых белков [89, 100, 111, 120], то для наших целей, то есть оценки состояния фракций водорастворимых и водонерастворимых белков, было достаточно двух методов: электрофореза и хроматографии.
Клиническое течение УФ-индуцированной катаракты
Биомикроскопическое исследование хрусталиков (метод экспертных оценок) позволило установить, что до начала эксперимента хрусталики всех животных, как в контрольной, так и в облучаемой группе имели прозрачные кортикальные и ядерные слои.
Статистически достоверные различия прозрачности хрусталиков 1-й (облучаемой) и 2-й (контрольной) групп впервые в ходе эксперимента были выявлены после оценки, проведенной через месяц после начала облучения. Наблюдая в ходе эксперимента в динамике формирование помутнений хрусталиков у животных этих групп, мы выявили, что скорость развития и величина помутнения хрусталика в контрольной группе меньше, чем в облучаемой группе. Достоверность различия сохранялись в течение всего периода наблюдения. В тоже время, отмечена схожесть клинической картины помутнения, развивающегося с разной скоростью, в этих двух группах экспериментальных животных. Наши наблюдения показали, что в облучаемой группе оптическая прозрачность кортикальных слоев и ядра, оцениваемая методом экспертных оценок, сохраняется до полутора месяцев, затем развивается слабовыраженное диффузное помутнение в ядре и появляется зернистость в передних и задних кортикальных слоях. Далее, под воздействием УФО помутнения в ядре прогрессируют быстрее, чем в коре. К концу эксперимента через 10 месяцев в облучаемой группе диагностируется однородное облакоподобное помутнение ядра средней степени, менее выраженное однородное помутнение отмечается в передних и задних кортикальных слоях (катаракта 5 баллов). Зрелая катаракта при этом способе моделирования катаракты не образуется.
-Через полтора месяца после начала эксперимента в контрольной группе определяются помутнения хрусталиков в виде незначительного уплотнения наружного кортикального слоя под передней капсулой. К концу эксперимента хрусталик контрольной группы в значительно большей степени, по сравнению с облучаемой группой, сохраняет свою прозрачность (катаракта 2-3 балла), обнаруживается только умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре и однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях хрусталика. Результаты бальной оценки динамики помутнений хрусталика представлены на рис. 3.1.
Данные микроденситометрии свидетельствуют, что оптическая плотность всех слоев хрусталика у животных облучаемой группы значительно увеличивается в первые три месяца от начала облучения, после чего темпы этого прироста несколько снижаются (Рис. 3.2.).
Облучение УФ светом, дни Рис. 3.2. Динамика развития помутнений в передних кортикальных слоях хрусталика у животных облучаемой и контрольной группы в единицах показателя оптической плотности (метод микроденситометрии). Данные представлены в виде среднего значения по группе с указанием 95 % доверительного интервала.
Динамика развития помутнения, таким образом, может быть описана логарифмической функцией (см. линии на рисунках экстраполирующие экспериментальные точки). Следует отметить, что показатель оптической плотности (ПОП) передней капсулы хрусталика за все время эксперимента практически не меняется, увеличиваясь всего на 10 ед. как в опытной, так и в контрольной группе, что офтальмоскопически проявляется в виде уплотнения капсулы.
К концу срока наблюдения максимальные значения ПОП отмечены в ядерных слоях (прирост составил 117±5 ед.). -Динамика изменения ПОП в передних и задних кортикальных слоях хрусталика повторяла график, описанный выше, однако прирост показателя был несколько меньше, чем ядре и достигал 97±3 ед. (Рис. 3.3.).
Динамика развития помутнений в средних ядерных слоях хрусталика у животных облучаемой и контрольной группы в единицах показателя оптической плотности (метод микроденситометрии). Данные представлены в виде среднего значения по группе с указанием 95 % доверительного интервала.
Во 2-й (контрольной) группе в течение всего периода наблюдения диагностировано незначительное равномерное увеличение ПОП во всех слоях (прирост составил 37±4 ед.), что может являться свидетельством естественного процесса развития возрастных изменений хрусталика у крыс вида Wistar. В сравнении с 1-й группой различия в показателях достоверны при каждом наблюдении (р 0,001) (Рис. 3.2., 3.3.).
Сравнивая оценку динамики развития катаракты методом экспертных оценок и посредством микроденситометрии биомикроскопических оптических срезов можно отметить высокую корреляцию полученных результатов. Ранговый коэффициент корреляции Спирмана для оценки в баллах и величины ПОП разных отделов хрусталика составил величину от 0,65 до 0,74. При этом максимальное значение R=0,74 наблюдали для пар «баллы — передние кортикальные слои» и «баллы — средние ядерные слои».
Результаты применения комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты по данным гистологического исследования
Для определения полипептидного состава белковых фракций, собранных в процессе гель-проникающей хроматографии, было проведено исследование фракций с помощью метода электрофореза в ПААГ. На рис. 3.13. представлена электрофореграмма, полученная при анализе фракций
Электрофореграмма разделения водорастворимых белков хрусталика облучаемой группы животных в ПААГ (12,5 %). Нумерация треков: 4 - стандарты; 1 и 5 - высокомолекулярные белки, 2 и 6 - а-кристаллины, 7 - pY-кристаллины, 3 и 8 - рн-кристаллины, о, - у-кристаллины, 10 - низкомолекулярные продукты гидролиза белков.
Анализ полипептидного состава белков исследованных фракций, показал, что водорастворимая фракция белков хрусталика во всех экспериментальных группах животных практически неизменна. Данные вследствие экономии места не приводятся.
После гомогенизирования выделенных их глаз животных хрусталиков, опеределения концентрации белка в гомогенате и разделения гомогената на водорастворимые и водонерастворимые белки посредством центрифугирования было определено количество водонерастворимого осадка в хрусталиках различных групп крыс. Данные представлены в табл. 3.2.
При сравнении контрольной и облучаемой групп животных наблюдается преобладание количества водонерастворимого осадка в группе крыс, которых облучали ультрафиолетовым светом, что свидетельствует о способности УФ вызывать агрегацию водорастворимых белков с образованием водонерастворимых белковых комплексов.
Сравнивая группы животных, получавших комбинацию препаратов различными способами, следует отметить, что различие в массе водонерастворимых белков между этими группами меньше, чем между каждой из этих групп и облучаемой группой. Наименьшая масса водонерастворимых белков установлена в 4-ой группе (комбинация NAC и ПТ внутрибрюшинно по 25 мг/кг).
Таким образом, комбинация препаратов способна уменьшить образование водонерастворимых белковых соединений как при инстилляционном, так и при внутрибрюшинном способе введения. -Учитывая то, что каждый образец является смесью белка от четырех хрусталиков, можно допустить, что представленные данные являются средним из четырех измерений. А так как точность взвешивания на аналитических весах составляет + 0,1 мг, то разброс данных невелик.
На рис. 3.14. представлены хроматограммы разделения образцов водонерастворимых белков разных экспериментальных групп. Ясно видно, что образцы содержат три основные фракции со временем удерживания 15, 25 и 35 минут.
Данные, полученные при разделении водонерастворимого осадка гомогенизированного хрусталика при помощи гель-проникающей хроматографии, позволили определить соотношение фракций белка (Табл. 3.3.).
