Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 4
1.1 Актуальность темы 4
1.2 Научная новизна работы 8
1.3 Практическая значимость 9
1.4 Апробация работы 9
1.5 Публикации 10
1.6 Личный вклад соискателя 10
1.7 Объём и структура диссертации 10
2 Обзор литературы 12
2.1 Физико-химические свойства фуллеренов 12
2.2 характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов в экспериментах in vitro и in silico 15
2.3 Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов in vivo 26
2.4 Изучение биораспределения и метаболизма фуллеренов в экспериментах in vivo 37
2.5 Краткое заключение 44
3 Материалы и методы 46
3.1 Животные, состав экспериментальных рационов 46
3.2 Характеристика используемых материалов и реактивов 48
3.2.1 Фуллерен с60 и фуллеренол с60(он)24 48
3.2.2 Прочие материалы и реактивы 49
3.3 Список использованного оборудования 50
3.4 Схемы экспериментальных моделей использованные в биологических экспериментах 51
3.4.1 Токсикологический эксперимент с фуллереном с60 продолжительностью 28 дней 51
3.4.2 Токсикологический эксперимент с фуллереном с60 продолжительностью 92 дня 53
3.4.3 Токсикологический эксперимент с фуллеренолом с60(он)24 продолжительностью 28 дней 54
3.4.4 Методика острого эксперимента по введению дисперсии фуллерена с60 в изолированную петлю тонкой кишки крысы 55
3.4.5 Исследование стабильности фуллерена с60 в биологических субстратах с использованием модельных систем in vitro 56
3.5 Методы отбора субстратов и пробоподготовки биологических образцов используемые в подострых токсикологических экспериментах 58
3.6 Биохимические и гематологические методы исследования 59
3.7 Метод определения проницаемости кишечной стенки для антигенного белка ова 60
3.8 Метод изучения биораспределения фуллерена с60 по органам и тканям животных с использованием вэжх 62
3.9 Метод определения содержания селена в биологических образцах 65
3.10 Метод лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии 66
3.11 Методы статистической обработки экспериментальных данных 68
4 Результаты исследований 69
4.1 Характеристика размера частиц фуллерена с60 и фуллеренола с60(он)24 69
4.2 Токсиколого-гигиеническая характеристика немодифицированного фуллерена с60 в эксперименте продолжительностью 28 дней 73
4.2.1 Влияние фуллерена с60 на интегральные показатели и массу внутренних органов 73
4.2.2 Влияние фуллерена с60 на содержание гемоглобина цельной крови и небелковых тиолов печени 76
4.2.3 Влияние фуллерена с60 на проницаемость кишечного барьера для ова 79
4.3 Токсиколого-гигиеническая характеристика немодифицированного фуллерена с60 в эксперименте продолжительностью 92 дня 80
4.3.1 Влияние фуллерена с60 на интегральные показатели и на массу внутренних органов 80
4.3.2 Влияние фуллерена с60 на содержание гемоглобина цельной крови и небелковых тиолов печени 83
4.3.3 Влияние фуллерена с60 на проницаемость кишки для ова 85
4.3.4 Влияние фуллерена с60 на содержание селена в организме крыс 86
4.3.5 Изучение биомаркеров токсического действия фуллерена с60 методом конфокальной флуоресцентной микроскопии 87
4.4 Изучение биораспределения фуллерена с60 по органам и тканям в токсикологических экспериментах 96
4.5 Токсиколого-гигиеническая характеристика фуллеренола с60(он)24 в эксперименте продолжительностью 28 дней 97
4.5.1 Влияние фуллеренола с60(он)24 на интегральные показатели и на массу внутренних органов 97
4.5.2 Влияние фуллеренола с60(он)24 на содержание гемоглобина цельной крови и небелковых тиолов печени 99
4.5.3 Влияние фуллеренола с60(он)24 на проницаемость кишечного барьера для ова 102
4.6 Эксперимент по исследованию стабильности фуллерена с60 в биологических Субстратах с использованием модельных систем in vitro 102
5 Обсуждение результатов 106
6 Выводы 116
7 Список сокращений 118
8 Список литературы 119
- характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов в экспериментах in vitro и in silico
- Токсикологический эксперимент с фуллереном с60 продолжительностью 28 дней
- Токсиколого-гигиеническая характеристика немодифицированного фуллерена с60 в эксперименте продолжительностью 28 дней
- Влияние фуллеренола с60(он)24 на содержание гемоглобина цельной крови и небелковых тиолов печени
Введение к работе
1.1 Актуальность темы
Характеристика потенциального риска наночастиц и наноматериалов, полученных
искусственным путём, для здоровья человека и состояния окружающей среды обитания является обязательной (Онищенко Г.Г., Тутельян В.А., 2007; Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Тутельян В.А., 2009). Важность оценки потенциальных рисков наноматериалов для здоровья человека отмечается в приказе Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 340 от 30.11.2007 г. За рубежом, безопасности нанотехнологий и наноматериалов уделяется большое внимание в рамках исследований, проводимых под эгидой Европейской комиссии, US FDA, OECD, ФАО-ВОЗ, ILSI и других правительственных и международных органов (Gmoshinski I.V., Khotimchenko S.A., Popov V.O. et al., 2013).
Среди разнообразных видов продукции наноиндустрии особое место занимают фуллерены, представляющие собой новую аллотропическую форму углерода (Пиотровский Л.Б., Киселёв О.И., 2006). Области практического применения фуллеренов постоянно расширяются и включают химический синтез и катализ, электронику, оптику, полиграфическую, лакокрасочную промышленность, фармакологию, производство парфюмерно-косметической продукции, биосенсоров, упаковочных материалов, средств защиты растений и т.д. (Michalitsch R., Kallinger C., Verbandt Y. et al., 2008). Поиск среди производных фуллеренов новых биологически-активных соединений, обладающих антиоксидантным, гепатопротекторным, радиопротекторным и другими видами защитного действия на организм человека привёл к разработке водорастворимых форм фуллеренов, одним из представителей которых является фуллеренол С60(ОН)24. Результатом расширения производства фуллеренов и содержащей их продукции становится превращение фуллеренов в значимые контаминанты окружающей среды и возрастание рисков экспозиции человека фуллеренами при различных путях их поступления (кожном, пероральном, ингаляционном) на этапах их производства, использования и утилизации образующихся отходов. Актуальным на сегодняшний день является вопрос экотоксичности фуллелернов и возможности их переноса по трофическим цепям в биосфере (Navarro D.A., Kookana R.S., Kirby J.K., 2013; Yue F.N., Luo S.M., Zhang C.D., 2013). К сожалению, все эти опасения до настоящего времени не сопровождаются нигде в мире какими-либо попытками регуляции фуллеренов; в частности, полностью отсутствует их гигиеническое нормирование в продукции и объектах окружающей среды.
Оценка безопасности новых наноматериалов в Российской Федерации осуществляется по единому плану в соответствии с утверждёнными Роспотребнадзором нормативно-3
методическими документами. При этом ни один из представителей семейства фуллеренов до настоящего времени не был тестирован в достаточном объёме. Наибольшую значимость и актуальность в свете возможных сценариев воздействия фуллеренов на организм человека имеет их токсиколого-гигиеническая оценка при естественных путях поступления в организм, то есть, в первую очередь, через желудочно-кишечный тракт, а также при ингаляции и эпикутанном воздействии.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НИИ питания» РАМН в рамках тем №108 «Оценка безопасности различных видов наноматериалов, предлагаемых для использования в пищевой промышленности (наночастицы металлического серебра, оксидов железа, кремния, цинка и другие)» и №140 «Разработка критериев и определение биомаркеров воздействия искусственных наночастиц на организм при пероральном пути поступления».
Целью настоящей работы являлась оценка возможных воздействий важнейших представителей семейства фуллеренов – немодифицированного фуллерена С60 и его водорастворимого производного фуллеренола С60(ОН)24, на показатели состояния организма лабораторных животных при поступлении через желудочно-кишечный тракт.
1.2 Задачи исследования
1. Разработка методов введения фуллерена животным в составе коллоидных систем,
стабилизированных биологически совместимыми полимерами и поверхностно-активными веществами.
-
Адаптация метода количественного определения фуллерена С60 в составе биологических образцов с использованием ВЭЖХ.
-
Изучение поступления фуллерена С60 во внутреннюю среду организма через пищеварительный тракт, биораспределение и бионакопление в условиях острых и подострых экспериментов.
-
Изучение в подостром эксперименте на лабораторных животных продолжительностью от 1 до 3 месяцев возможного токсического действия фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24, в том числе на интегральные показатели организма, состояние защитного барьера желудочно-кишечного тракта, некоторые биохимические и гематологические показатели.
-
Изучение в модельных экспериментах возможности биодеградации и биотрансформации фуллелерена С60, под действием ферментных систем организма лабораторных животных.
1.3 Научная новизна
Впервые проведена систематическая токсиколого-гигиеническая оценка фуллерена
С60 в подостром 28- и 92-дневном эксперименте на лабораторных животных с определением показателей, характеризующих возможное общетоксическое действие данного соединения, включая интегральные, физиологические, биохимические, гематологические и иммунологические показатели. Впервые показано, что при пероральном введении наноразмерной дисперсии фуллерена С60 в дозе от 0,1 до 10 мг/кг массы тела в течение 28 и 92 дней данное соединение обладает общетоксическим действием на организм животных, что проявляется в частности в дозозависимом повышении проницаемости стенки тонкой кишки для макромолекул белка, увеличении числа CD106+ гранулярных клеток в паренхиме печени. На основании полученных данных определена максимальная недействующая доза фуллерена С60 при подостром пероральном поступлении, находящаяся в интервале от 1 до 10 мг/кг массы тела/сут. В подостром эксперименте продолжительностью 28 дней впервые в нанотоксикологии проведена токсиколого-гигиеническая оценка перорально вводимого фуллеренола С60(ОН)24 с определением показателей, характеризующих предполагаемое общетоксическое действие этого соединения. На основании полученных результатов исследований фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24 впервые определена величина максимальной недействующей дозы этого вещества при многократном поступлении через желудочно-кишечный тракт, находящаяся в интервале от 0,1 до 1 мг/кг массы тела/сут. В модельных экспериментах in vitro, воспроизводящих условия биотрансформации и биодеградации фуллерена С60 в организме, впервые установлена быстрая деградация этого вещества под действием ферментных систем организма с образованием недетектируемых при хроматографическом анализе производных. С использованием этих данных объяснены причины противоречий в имеющихся данных литературы относительно процессов бионакопления, биотрансформации и физиологического действия фуллеренов в организме.
1.4 Практическая значимость
С использованием результатов проведенных исследований были разработаны,
утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации и внедрены в работу учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, следующие нормативно-методические документы:
МУ 1.2.2876-11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в растениях»;
МР 1.2.0048-11 «Порядок и методы определения органотропности и токсикокинетических параметров искусственных наноматериалов в тестах на лабораторных животных»;
МР 1.2.0052-11 «Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета;
- МР 1.2.0054-11 «Порядок и методы оценки воздействия искусственных наночастиц и
наноматериалов на токсическое действие химических веществ»;
- МР 1.2.0053-11 «Оценка воздействия наноматериалов на протеомный профиль и
биосинтетические процессы в тестах на лабораторных животных».
1.5 Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XII
Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2010); XIII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» с международным участием (Москва, 2011); XIV Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» с международным участием (Москва, 2012); IV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые ученые за устойчивое развитие страны в глобальном мире» с международным участием (Москва, 2012); Пленуме по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Научно-методологические и законодательные основы совершенствования нормативно-правовой базы профилактического здравоохранения: проблемы и пути их решения» (Москва, 2012); X научно-практической конференции с международным участием «Экспертиза, оценка качества, подлинности и безопасности пищевых продуктов» на базе ГОУ ВПО МГУПП (Москва, 2012); IX научно-практической конференции «Нанотехнологии производству» (Фрязино, 2013); 4 съезде токсикологов России (Москва, 2013).
1.6 Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых
научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1 методические указания и 4 методических рекомендаций.
1.7 Личный вклад соискателя
Планирование, организация, проведение экспериментов и исследований на
лабораторных животных, работа с методами гравиметрии, спектрофотомерии, ВЭЖХ, ИФА, лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии, спектроакусического исследования, динамического рассеяния света, статистическая обработка полученных данных и их интерпретация. Все изложенные в диссертации материалы получены непосредственно самим соискателем, или при его участии.
1.8 Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, разделов
материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 194 источника, из них 21 российских и 173 зарубежных источников. Объем работы составляет 138 страниц машинописного текста, содержит 22 рисунка и 25 таблиц.
характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов в экспериментах in vitro и in silico
Опасности для здоровья человека, связанные с воздействием фуллеренов, в данный момент недостаточно охарактеризованы, и необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы количественно охарактеризовать эти эффекты в целях полноценной оценки риска. Характеристика токсических свойств фуллеренов и их разнообразных химически модифицированных производных имеет большое значение в свете существующих попыток использования фуллеренов в качестве пищевых добавок и ингредиентов [154], в косметической продукции [88], перспектив применения фуллеренов в медицине [29, 106], в частности, в качестве радиопротекторных агентов [80, 38], антиоксидантов и акцепторов свободных радикалов [19, 74, 140, 153, 86], в качестве компонентов лекарственных препаратов, обладающих в некоторой степени антипролиферативными [59, 190], противоопухолевыми [75, 73, 72, 180, 183], противовирусными [150, 139] и нейропротекторными свойствами [148, 149, 184], а также для эффективной доставки лекарственных средств [96, 104, 50]. Следует также иметь в виду, что по мере расширения производства и промышленного применения фуллеренов их определённые количества смогут поступать в окружающую среду и становиться значимыми контаминантами экосистем и пищевой продукции [25].
Как показали исследования на клетках E.coli, фуллерен С60 не был генотоксичен в SOS-хромотесте [8]. Этим результатам, однако, противоречат данные работы [54], в которой воздействие водных дисперсий С60 на клетки бактерий Pseudomonas putida и Bacillus subtilis в концентрации 0,01 - 0,5 мг/л, вызывало значительную модификацию свойств клеточных мембран и значимое ингибирование их роста. Согласно [36] солюбилизированный поливинилпирролидоном фуллерен вызывал повреждение клеток E.coli по механизму развития оксидантного стресса.
В основе наблюдаемой токсичности фуллерена лежат фотоиндуцированные физико-химические и клеточные процессы, включая окислительные, генотоксические [97, 175] и цитотоксические реакции, одной из главных причин которых является образование фуллеренами активных форм кислорода [91]. В исследовании [36] на бесклеточных системах немодифицированный фуллерен С60, солюбилизированный поливинилпирролидоном, обладал способностью генерировать синглетный кислород и супероксид анион, но не радикалы гидроксила. Аналогичная активность установлена для фуллеренола.
Для выяснения параметров токсичности коллоидных частиц фуллерена С60 и С70 [83] проводили эксперименты в бесклеточной системе, содержащей фуллерен и молекулы белков (БСА). С использованием метода ядерного магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля, метода асимметрического фракционирования течением под влиянием поля (AFFFF) и метода динамического лазерного светорассеяния (фотонная корреляционная спектроскопия, ФКС) показано, что наночастицы комплексов фуллеренов с белком в культуральной среде не принимают жесткую сферическую структуру, а имеют скорей гибкую структуру. Поскольку углеродные наноматериалы одинакового химического состава, но с различными геометрическими структурами обладают абсолютно разной биологической активностью и цитотоксичностью, это может оказывать разнообразные воздействия на процессы поглощения этих частиц клетками, что имеет немаловажное значение для оценки токсичности in vitro.
В исследовании [93] с использованием методов пространственного компьютерного моделирования показано, что фуллерены могут выступать в качестве блокаторов или модуляторов мембранных K+ каналов. Данный эффект, сопряжённый с возможным цитотоксическим действием, послужил основанием для другого исследования методом компьютерного моделирования, где были выявлены наиболее благоприятные белки-мишени для производных фуллерена [66].
По современным представлениям для фуллеренов характерна способность к взаимодействию с биологическими макромолекулами с возможной модификацией их свойств. Путем компьютерного моделирования в работе [189] установили, что молекулы С60 могут препятствовать репарации ДНК. Для взаимодействия фуллеренов с белками характерен, по-видимому, эффект их солюбилизации в гидрофобном ядре глобулы таких крупных белков, как сывороточный альбумин (M=67кД). По данным [49] в растворе сывороточного альбумина удалось получить стабильную дисперсию С60 концентрацией 9,3 10-6 М (6,7 мкг/мл). Этот результат может означать, что, несмотря на практически полную нерастворимость фуллеренов в воде, во внутриклеточной среде в определенных условиях концентрация этих веществ в молекулярной форме может быть довольно значительной. Существует значительное число экспериментальных результатов, показывающих, что немодифицированные фуллерены, как в виде индивидуальных молекул, так и мультимолекулярных коллоидных частиц, могут поглощаться различными клетками высших животных в культуре. Так, кератиноциты человека быстро захватывали 14С-меченный фуллерен С60, вводимый в виде мультимолекулярных ассоциатов диаметром 3 мкм [145]. По мнению авторов работы после адгезии этих ассоциатов (не относящихся с точки зрения их размера к НЧ) к плазматической мембране клетки может происходить диффузия отдельных молекул фуллерена C60 через липидный бислой. Согласно данным [110] наблюдается активный фагоцитоз полиморфноядерными нейтрофилами мультимолекулярных коллоидных частиц фуллерена C60. Авторы исследования [162] наблюдали поступление молекул фуллерена С60 в клетки зачатков конечностей эмбриона крысы; в качестве формы введения использовали дисперсию частиц фуллерена C60, стабилизированную поливинилпирролидоном. Как показано в работах [129, 130] агрегированные частицы фуллерена С60 захватываются макрофагами человека и выявляются затем методом просвечивающей электронной микроскопии в цитоплазме, лизосомах и, что наиболее существенно, в ядре клеток.
Токсикологический эксперимент с фуллереном с60 продолжительностью 28 дней
Дизайны токсикологических экспериментов были разработаны в соответствии с МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов». Условия содержания и работы с животными соответствовали «Правилам лабораторной практики» (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.2010 г. № 708н).
Токсикологический эксперимент с фуллереном С60 продолжительностью 28 дней Исследование проведено на 60 крысах исходной массой тела 111±2 г (M±m). Животные были разделены на 4 группы по 15 крыс в каждой. Группа 1 (контроль) получала на протяжении всего эксперимента ежедневно внутрижелудочно дистиллированную воду. Животные группы 2 получали дисперсионную среду (носитель) (см. п. 3.2.1). Крысам группы 3 вводили дисперсию фуллерена С60 в указанной дисперсионной среде в дозе 1 мг/кг массы тела в расчёте на С60, а крысам группы 4 – в дозе 10 мг/кг массы тела (Таблица 6).
Энергетическая ценность носителя фуллерена (дисперсионной среды), с учётом возможности частичной ферментации его углеводного компонента микроорганизмами толстой кишки, не превышала в группах 2 - 4 0,2 % от энергетической ценности дневного рациона животных. После приготовления дисперсии фуллерена и на протяжении всего времени её введения животным, препарат перемешивали с помощью магнитной мешалки.
В ходе эксперимента крыс всех групп взвешивали на электронных весах с точностью ±0,5 и оценивали динамику прироста массы тела. Продолжительность эксперимента составила 28 суток.
Интегральные показатели (внешний вид, поведение, двигательная активность, состояние шерстяного покрова, потребление корма) изучали на протяжении всего эксперимента и по его окончании. За 3 часа до завершения эксперимента 9 животным из каждой группы внутрижелудочно через зонд вводили по 2 г/кг массы тела крысы лиофилизированный белок куриного яйца в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. Затем этих крыс умерщвляли путем глубокого обескровливания под эфирной анестезией. Всех остальных животных после окончания эксперимента (через 28 суток опыта) умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию. На секции согласно методам забора в ходе эксперимента биологических образцов (согласно МУ 1.2.2745-10) отбирали кровь и внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие, селезенку, надпочечники, семенники, тимус, головной мозг, внутрибрюшинную жировую клетчатку). После вскрытия оценивали абсолютную и относительную массу внутренних органов, определяли содержение небелковых тиолов печени и концентрацию гемоглобина в цельной крови. У животных, которые получали куриный белок, кроме перечисленных выше показателей, с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного метода определяли в сыворотке крови антигенный овальбумин.
Кроме отмеченных исследований, в органах и тканях крыс с помощью системы Agilent 1200 для ВЭЖХ (с колонкой «ZORBAX C18», размер 4,6150 мм, заполненной С18 фазой с размером гранул 5 мкм) проводили количественное определение фуллерена С60.
Исследование проведено на 75 крысах исходной массой тела 100±5 г (M±m). Животные были разделены на 5 групп по 15 крыс в каждой. Животным 1 группы (контроль) на протяжении всего эксперимента (92 дня) ежедневно вводили внутрижелудочно дистиллированную воду. Животные 2 опытной группы в течение того же времени ежедневно внутрижелудочно получали 1 мл раствора дисперсионной среды (носителя) фуллерена (см. п.3.2.1) Как и в 1-ом эксперименте, расчётная энергетическая ценность носителя, с учётом возможности частичной ферментации его углеводного компонента в толстой кишке, не превышала 0,2% от энергетической ценности дневного рациона животных. Крысы 3, 4 и 5 опытных групп получали ежедневно внутрижелудочно через зонд фуллерен С60 в виде дисперсии в носителе в дозе 0,1; 1,0 и 10,0 мг/кг массы тела соответственно. Объем вводимого раствора фуллерена С60 для всех животных 3 – 5 групп равнялся 1 мл раствора на каждые 100 г массы тела животного. На протяжении всего времени введения животным дисперсии фуллерена перемешивали с помощью магнитной мешалки. Вводимые дозы фуллерена С60 по группам животных представлены в таблице 7. Общая продолжительность введения составила 92 суток.
Токсиколого-гигиеническая характеристика немодифицированного фуллерена с60 в эксперименте продолжительностью 28 дней
Как показало еженедельное взвешивание животных, крысы контрольной группы достоверно отставали в развитии от крыс из групп 2, 3, 4 только в первую неделю эксперимента; в дальнейшем средние приросты массы различались недостоверно (Таблица 9).
Прирост массы тела крыс за 28 дней (в %% от исходного уровня) представлен в таблице 10, все различия между группами недостоверны (р 0,05).
Масса внутренних органов (селезенка, почки, гонады, сердце, тимус, легкие, надпочечники, головной мозг), выраженная в % от массы тела, не различалась достоверно между группами и находилась в пределах нормальных значений для крыс данного возраста (Таблица 11). Исключение составила относительная масса печени (Рисунок 11), которая составила в группе 4, получавшей фуллерен в высокой дозе, 3,25±0,06 %, что было достоверно меньше (р 0,05, критерий Манна-Уитни) чем в группах 1-3 (3,53±0,05; 3,56±0,05 и 3,61±0,13 % соответственно).
Содержание гемоглобина цельной крови у животных групп 1-4, составило соответственно, 140,9±4,0; 129,3±2,4; 130,0±2,5 и 134,3±3,9 г/л и было достоверно (р 0,05) снижено в группах 2 и 3 по сравнению с контролем. Однако, различие групп, получавших фуллерен, от группы 2, было недостоверно (Рисунок 12).Содержание гемоглобина цельной крови у животных групп 1-4, составило соответственно, 140,9±4,0; 129,3±2,4; 130,0±2,5 и 134,3±3,9 г/л и было достоверно (р 0,05) снижено в группах 2 и 3 по сравнению с контролем. Однако, различие групп, получавших фуллерен, от группы 2, было недостоверно (Рисунок 12).
Как следует из данных рисунка 12, определение показателя всасывания в кишке животных макромолекул куриного овальбумина показало достоверное снижение этого показателя во всех трёх опытных группах по сравнению с контрольной, в которой он хотя и был максимальным, но находился в пределах физиологической нормы для животных данного возраста. Таким образом, неблагоприятное воздействия фуллерена, вводимого в желудочно-кишечный тракт на протяжении 28 дней, на всасывание в нем макромолекул белка отсутствует, а наблюдаемое изменение, по-видимому, связано с эффектом применяемого носителя.На протяжении всего 3-месячного эксперимента животные всех опытных групп имели нормальный внешний вид, какие-либо изменения в состоянии шерстяного покрова и поведения, выявлены не были; летальность среди животных отсутствовала. Как следует из данных рисунка 13, крысы контрольной и всех опытных групп прибавляли в массе тела одинаково. По окончании периода кормления животных, каких-либо различий между группами по показателю абсолютного прироста массы тела за всё время эксперимента выявлено не было (Таблица 13). Относительная масса внутренних органов крыс всех опытных групп находилась в пределах интервала нормальных значений и достоверно не отличалась от контроля (Таблица 14). Таким образом, 3-месячное внутрижелудочное введение фуллерена С60 во всех дозах не выявило признаков токсического действия по изученным интегральным показателям.
Содержание гемоглобина цельной крови у животных групп 1-5 составило: 145,4±3,5; 148,7±4,0; 147,4±4,2; 149,9±4,9 и 160,3±7,1 г/л. Средняя концентрация гемоглобина у крыс, получавших фуллерен Сбо в наибольшей из доз, достоверно отличается от значений контрольной группы 1, но у животных получавших носитель, различия с группой 5 были недостоверны, так же как и у животных групп 3 и 4 (Рисунок 14).
Содержание в печени крыс небелковых тиолов, представленных, в основном, восстановленным глутатионом представлено в таблице 15. Единственная тенденция, состоящая в некотором снижении этого показателя у животных в группе 4, оказалась недостоверной (р 0,05), при сравнении с тем же показателем, который обнаруживается у животных групп 1 и 2. Таким образом, фуллерен С60, по-видимому, не влияет при длительном приёме на этот важный показатель тканевого окислительно-восстановительного гомеостаза.
Влияние фуллеренола с60(он)24 на содержание гемоглобина цельной крови и небелковых тиолов печени
Средняя концентрация гемоглобина цельной крови у крыс групп 1-4 составила: 130,71±2,34; 128,86±5,53; 129,49±4,38 и 130,67±2,23 г/л. Статистически достоверных различий, между опытными и контрольными животными, выявлено не было (Рисунок 21). Ежедневное введение фуллеренола Сбо(ОН)г4 крысам в дозах от 0,1 до 10 мг/кг, не оказывало негативного влияния на этот гематологический показетель.
В таблице 22 представлены данные о содержании небелковых тиолов печени у крыс, получавших фуллеренол на протяжении 28-ми дней. Видно, что различия в значениях между группами 1-4 отсутствуют (р 0,05). Таким образом, фуллеренол на величину пула небелковых тиолов достоверного воздействия не оказывает, что свидетельствует об отсутствии влияния на состояние red/ox гомеостаза.Величина всасывания в желудочно-кишечном тракте антигенного ОВА куриного яйца, определяемая по его концентрации в сыворотке крови, не имела достоверных различий между группами 1-4 (Рисунок 22). Таким образом, в 28-дневном эксперименте, фуллеренол С60(ОН)24 не оказывает негативное влияние на степень всасываемости в кишечнике макромолекул белка, аналогично с результатом, полученным в 28-дневном исследовании с немодифицрованным фуллереном С60.Как показано в таблице 23, фуллерен С60, вносимый в образцы цельной крови, в ходе ее инкубации при температуре тела животного подвергается быстрой деградации. При максимальной начальной концентрации его содержание в крови снижается через 3 часа в 25 раз по сравнению с исходным уровнем, при больших временах инкубации фуллерен в крови не выявляется. При меньших концентрациях наблюдается его полная (в пределах чувствительности метода ВЭЖХ) элиминация в образце крови уже через 3 часа.
При добавлении фуллерена в цельный гомогенат ткани печени, как следует из данных, представленных в таблице 24, наблюдается также снижение его концентрации, хотя и не такое быстрое, как в случае образцов цельной крови. При наибольшей из доз фуллерена достоверное (в пределах погрешности определения) снижение его содержания отмечается только при 24 часа опыта, а при меньших дозах - значительно быстрее, при 3 часах инкубации.
Результаты анализа, приведенные в таблице 25, показывают, что зависимость концентрации фуллерена в объёме микросомальной фракции печени от времени оказывается немонотонной (отмечается как снижение, так и возрастание этого показателя). С целью анализа этих зависимостей проведён их регрессионный анализ в соответствии с уравнением C=C0-Pt, где Со - исходная, С - текущая концентрация фуллерена, t - время, Р - эмпирический угловой коэффициент. Результаты (Таблица 25) показывают, что для среднего и низкого добавляемого количества фуллерена коэффициент Р достоверно не отличается от нуля, что свидетельствует об отсутствии зависимости объёмной концентрации фуллерена от времени в пределах погрешности данных эксперимента. Однако, при наибольшем из добавляемых количеств отмечается статистически достоверное возрастание концентрации фуллерена в объёме водной фазы (р 0,05). Причиной этого, возможно, является неспособность микросомальной фракции обеспечить диспергирование значительной части вносимого фуллерена, так как, в отличие от гомогената ткани и цельной крови, фракция микросом содержит мало растворенного (не связанного с мембранными везикулами) белка, выполняющего функцию стабилизатора дисперсии фуллерена [49]. По мере инкубации, дополнительные количества фуллерена, адгезированного к стенкам пластиковых пробирок, могут постепенно переходить в объём водной фазы, что, в отсутствие его значимой биодеградации создаёт эффект кажущегося увеличения концентрации. Таким образом, использованная нами экспериментальная модель не позволила выявить эффект биотрансформации фуллерена С60 под действием микросомальной фракции печени.
В задачи настоящей работы входило систематическое изучение по единому плану возможных токсических эффектов, вызываемых пероральным введением фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24 лабораторным животным (крысам), в подостром эксперименте длительностью 28-92 суток с осуществлением контроля набора показателей, характеризующих состояние организма животного в соответствии с действующими в Российской Федерации методическими указаниями по оценке безопасности наночастиц и наноматериалов, утверждёнными в установленном порядке (МУ 1.2.2520-09).
Первая проблема, которую следовало разрешить при проведении исследований, относилась к выбору формы введения и доз фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24. Как показал анализ данных литературы, различные методические подходы, основанные на получении дисперсий фуллерена с использованием систем вода-органические растворители, являются непригодными для целей настоящего исследования, поскольку не позволяют гарантировать отсутствие грубого токсического воздействия носителя, содержащего практически неудаляемые примеси органического растворителя, на организм животных. Альтернативные подходы, стоящие в получении чисто водных «растворов» фуллерена с помощью длительного перемешивания, растирания, ульразвуковой обработки были также признаны непригодными, поскольку не позволяли получить на практике дисперсии фуллерена достаточно высокой концентрации и в достаточно больших количествах, а также не исключали возможности неконтролируемых окисления и химической модификации обрабатываемого фуллерена. В результате был сделан выбор в пользу сравнительно простой, воспроизводимой и высокопроизводительной методики получения стабильных дисперсий фуллерена в растворе биополимера -кукурузного крахмала, являющегося нутриентом (частично расщепляемый под действием амилаз слюны и панкреатического секрета, и частично ферментируемый кишечной микрофлорой сложный углевод), а также малотоксичным, разрешенным к применению в составе пищевых продуктов в качестве пищевой добавки, поверхностно-активным веществом Твин 80.
Доза фуллерена Сбо и фуллеренола Сбо(ОН)24 в проведенных исследованиях, составляла до 10 мг/кг массы тела лабораторного животного, что в пересчёте на массу тела человека соответствует приёму 0,7-0,9 г этих веществ в день и является значительной аггравацией в условиях реально возможных сценариев экспонирования человека этими веществами в составе пищевых продуктов или косметических средств (при их случайном приёме внутрь).
Анализ размеров частиц фуллерена Сбо, получаемых путём его диспергирования в системе крахмал - Твин 80 был проведен методом спектроакусического исследования и показал, что основная часть частиц дисперсной фазы фуллерена представлена частицами в нанометровом диапазоне размеров средним диаметром около 31 нм. Следует отметить, что каждая такая частица состоит из значительного числа молекул фуллерена, средний диаметр которых составляет около 0,7 нм. Приблизительный подсчёт показывает, что число молекул фуллерена Сбо в объёме одной частицы при условии их плотной сферической упаковки может составлять прядка (5-8)xl О4 штук. Тем не менее, для наночастиц такого размера имеется значительный объём данных литературы, свидетельствующий о возможности и трансэпителиального транспорта (проникновения) через слизистую оболочку тонкой кишки, по механизмам эндоцитоза и персорбции [167, 79, 32, 136]. На основе анализа данных литературы, полученных с использованием преимущественно радиоизотопных меток можно было предположить, что биодоступность нанодисперсной (мицеллярной) формы фуллерена Сбо является сравнительно низкой (по-видимому, около 3% от однократно введённой дозы), что, тем не менее, является физиологически значимым, особенно с учётом липофильности этого соединения и возможности его кумуляции в различных органах и тканях (в первую очередь, в печени).
