Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Основные патогенетические механизмы повышения внутриглазного давления при первичной открытоугольной глаукоме 11
1.2 Роль реакций свободнорадикального окисления в повреждении тканей дренажного аппарата глаза 13
1.3 Терапия метаболических нарушений при глаукоме 21
1.4 Общая характеристика и фармакологические свойства липоевой кислоты 27
Собственные исследования:
Глава 2. Материал и методы исследования 40
2.1 Исследуемый материал 40
2.1.1 Материал экспериментальных исследований 40
2.1.2 Клинический материал 43
2.1.3 Состав и технология изготовления глазной лекарственной формы липоевой кислоты 46
2.2 Методы исследования 48
2.2.1 Гистологический метод определения токсичности на ткани глаза инстилляций 1% липоевой кислоты 48
2.2.2 Гистоморфологический метод определения влияния истилляций глазной лекарственной формы 1% липоевой кислоты на паренхиматозные органы экспериментальных животных (острая и хроническая токсичность) 49
2.2.3 Определение антиокислительной активности водянистой влаги передней камеры глаза хемилюминесцентным методом 50
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Влияние инстилляций глазной лекарственной формы 1% липоевой кислоты на ткани глаз экспериментальных животных (кроликов) 53
3.2 Влияние инстилляций глазной лекарственной формы 1% липоевой кислоты на паренхиматозные органы экспериментальных животных (кроликов) (острая и хроническая токсичность) 54
3.3 Влияние липоевой кислоты на антиокислительную активность водянистой влаги кроликов при различных режимах инстилляций 54
3.3.1 Антиокислительная активность влаги передней камеры глаза кроликов после однократной инстилляций липоевой кислоты 0,1 и 1% концентрации 54
3.3.2 Антиокислительная активность влаги передней камеры глаза кроликов после инстилляций липоевой кислоты ОД и 1% концентрации в течение 4-х дней 58
3.3.3 Антиокислительная активность влаги передней камеры глаза кроликов после инстилляций липоевой кислоты 1% концентрации в течение 16 дней 61
3.3.4 Сравнение антиокислительной активности влаги передней камеры глаз кроликов после однократной инстилляций 1% липоевой кислоты и 1% эмоксипина 62
3.3.5 Сравнение антиокислительной активности влаги передней камеры глаз кроликов после инстилляций в течение 16 дней 1% липоевой кислоты и 1% эмоксипина 64
3.4 Изучение влияния липоевой кислоты на антиокислительную активность водянистой влаги в опытах in vitro 67
Заключение 71
Выводы 79
Практические рекомендации 80
Список литературы
- Роль реакций свободнорадикального окисления в повреждении тканей дренажного аппарата глаза
- Клинический материал
- Влияние инстилляций глазной лекарственной формы 1% липоевой кислоты на паренхиматозные органы экспериментальных животных (кроликов) (острая и хроническая токсичность)
- Сравнение антиокислительной активности влаги передней камеры глаз кроликов после однократной инстилляций 1% липоевой кислоты и 1% эмоксипина
Роль реакций свободнорадикального окисления в повреждении тканей дренажного аппарата глаза
Липамид представляет собой светло-желтый кристаллический порошок без вкуса и запаха, плохо растворимый в воде и хорошо - в органических растворителях. Температура плавления 119-120С
По химическому строению и биохимическим свойствам липамид весьма близок к ЛК, но имеет ряд преимуществ перед ней: отсутствие вкуса и запаха, лучшие органолептические свойства, более быстрое всасывание из кишечника, благодаря чему препарат предпочтительнее для приема внутрь.
ЛК была официально выделена и описана Reed и соавт. в 1957 году [150,184,185,192,195], хотя о соединениях, проявляющих биологическую активность, которая приписывается ЛК, сообщалось примерно двадцатью годами раньше.
Воздействие липоевой и дигидролипоевой кислоты (ДГЛК) на продуцирование свободных радикалов в нормальных фагоцитах и в подверженных оксидативному стрессу, изучено еще не полностью [128,154,160,178,200,203]. Однако, уже доказан положительный эффект применения ЛК при ведении патологий, сопровождаемых вторичным иммунодефицитом, например, в результате химио- и радиотерапии, хронической инфекции и диабета [60,165,169,179].
ЛК способствует увеличению содержания глутатиона в эритроцитах и повышению уровня SH-групп в крови соматических больных, получавших этот препарат [8,9]. Установлено, что пероральный прием ЛК по 0,025 г. 3 раза в день в течение 2 мес. сопровождался повышением уровня глутатиона в эритроцитах больных ОУГ [28].
Исследовалось также влияние ЛК на уровень SH-групп в слезной жидкости больных ОУГ [83,115]. После приема препарата в течение 2 мес. концентрация SH - групп в слезе у больных ОУГ I стадии повышалась в 31% глаз, II стадии - в 61,5% глаз. Эффект ЛК в значительной степени связан с ее антиокислительной активностью [110,111,113,114,155]. Уже доказано, что ЛК положительно действует на работоспособность головного мозга, увеличивает скорость зрительно-моторной реакции, устраняет нарушения углеводного и жирового обмена, обладает гипогликемическим и натрий уретическим эффектом, улучшает функции печени, оказывает детоксицирующее действие [8,9,59,79,80,101,163]. ЛК восстанавливает глутатион из глутатион-дисульфида и способствует восстановлению радикалов токоферола. ЛК и ДГЛК ингибируют пероксидакцию липидов, а также элиминируют супероксид и гидроксильный радикал. Благодаря чему эту кислоту относят к антиоксидантам [110,111,119,121,145]. В связи с тем, что основные процессы, приводящие к ретенции, происходят в передней камере, представляется вполне целесообразным повышение антиокисидантнои защиты путем непосредственного воздействия на продукты ПОЛ, находящиеся в камерной влаге больных глаукомой. Фармакологические свойства ЛК
Биохимические свойства ЛК и липамида определяются наличием дисульфидной связи двух атомов серы. В животном организме ЛК, присоединяя два атома водорода, трансформируется в ДГЛК. В биологической среде ЛК и ДГЛК образуют обратимую окислительно-восстановительную систему, тесно сопряженную с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД). Реакции этой системы катализируются дегидрогеназой дигидролипоевой кислоты. Многочисленные исследования по изучению роли ЛК в процессах обмена веществ в организме животных и человека позволили отнести это соединение к группе коферментов. Основной коферментной функцией ЛК является ее участие в окислительном декарбоксилировании пировиноградной, ос-кетоглутаровой, а-кетомасляной и других а-кетокислот. Эти метаболические реакции входят в состав важнейшего биоэнергетического цикла превращения углеводов в организме (цикл трикарбоновых кислот - цикл Кребса).
Работу ЛК и ДГЛК можно рассмотреть на примере окисления пирувата до ацетил-коэнзима-А, происходящего в митохондриях. ЛК является постоянным донатором и акцептором водородных ионов при окислении пирувата и других кетокислот. Исходя из этих данных, можно предположить, что антиокислительные свойства ЛК связаны с наличием SH-групп в молекуле ЛК.
Весьма вероятно, что ЛК в составе пируватдегидрогеназного комплекса способна обратимо взаимодействовать с системой аскорбиновая-дигадроаскорбиновая кислота, т.е. намечается возможность объяснения некоторых метаболических эффектов липоата и через эту реакцию [141].
Экзогенная ЛК оказывает положительное влияние на скорость основного обмена, повышая потребление кислорода и гликолиз в мозговой ткани, стимулируя функции ретикулоэндотелиальной системы, а также принимает участие в процессах ацетилирования ароматических аминов. Устраняя нарушения углеводного обмена, она увеличивает накопление гликогена в печени и синтез ацетилуксусной кислоты. При некоторых патологических состояниях ЛК тормозит накопление жира в тканях печени, повышает активность цитохромоксидазы и щелочной фосфатазы. Являясь донором и акцептором ацетильных групп, эти соединения участвуют в образовании ацетилкоэнзима А, который играет роль в метаболизме белков, жиров и углеводов, тем самым нормализуя эти обмены при патологических состояниях. В экспериментах на животных и при наблюдениях над больными обнаружено гипогликемическое действие этих препаратов. ЛК и липамид влияют на промежуточный обмен углеводов, а также снижают содержание пировиноградной и молочной кислот в крови больных [1].
Под воздействием отечественных препаратов ЛК наблюдалось статистически достоверное снижение уровня холестерина при гиперхолестеринемии, циррозах печени и хронических гепатитах и увеличение содержания холестерина до нормы при гипохолестеринемии [55,125].
Препараты ЛК применяют в качестве детоксицирующих средств при отравлениях различными органическими и неорганическими соединениями. Применение препаратов эффективно при интоксикациях снотворными средствами (барбитуратами), алкоголем, а также при длительном употреблении антибиотиков. По мнению ряда авторов, ЛК является одним из лучших средств борьбы с последствиями ионизирующей радиации. Считается, что антидотные свойства ЛК обусловлены наличием в их структуре тиоловых групп. Через свои активные SH-группы кислота соединяется с токсическими веществами, имеющими сродство к этим группам, и таким образом предохраняет SH-группы других ферментов организма, давая им возможность нормально функционировать.
Ввиду того, что ЛК содержится во многих пищевых продуктах, не удается создать модель ее недостаточности. При дефиците этого кофермента у больных происходит насыщение тканей пировиноградной кислотой и другими а-кетокислотами. В результате этого возникают выраженные неврологические нарушения, спазматические состояния, атония кишечника, полиневрит, снижения кислотности желудочного сока [1,60,164].
Клинический материал
Совместно с Центральной патологоанатомической лабораторией МО РФ (Начальник - пол-к мед. службы В.Филатов) было проведено гистологическое исследование микропрепаратов паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки) подопытных животных для определения острой и хронической токсичности глазной лекарственной формы 1% ЛК. В каждом случае использовали по 3 опытному и 1 контрольному - интактному — животному (те же кролики, что и в гл. 2.2.1.).
В глаза опытных животных производили инстилляций указанного выше лекарственного препарата однократно и в течение 6 месяцев соответственно. Все манипуляции проводились в соответствии с рекомендациями Фармкомитета Минздрава России. Гибели животных в течение наблюдаемого периода не регистрировалось. По окончании сроков инстилляций 1-ю группу животных в день инстилляций, а вторую группу - через 6 мес, соответственно, забивали, препарировали и для исследования забирали паренхиматозные органы. 2.2.3. Определение антиокислительной активности водянистой влаги передней камеры глаза хемилюминесцентным методом
В работе использован хемилюминесцентный метод определения АОА биологического материала в модельной системе гемоглобин - люминол - перекись водорода (Нв-ЛМ-НгОг) [34,50,81,107,108]. Метод хемилюминесценции (ХЛ) относят к прямым методам изучения свободных радикалов и их реакций [32,99]. Процесс СРО модельной системы Нв-ЛМ-НгОг сопровождается испусканием квантов света ХЛ. Зависимость интенсивности ХЛ от времени называют кинетикой ХЛ [27,32,81,107,108]. В работе для изучения антиокислительных свойств исследуемых веществ использована система Нв-ЛМ-НгОг, в которой в нашем случае в качестве субстрата окисления выступает люминол. При взаимодействии с АФК люминол подвергается СРО, в ходе которого испускаются кванты ХЛ [81,107,108]. В настоящей работе для инициирования СРО люминола использована смесь Нв и Н2О2. В процессе их взаимодействия образуются радикалы-инициаторы окисления люминола, в качестве которых выступают феррил-радикалы гемоглобина и наиболее агрессивный гидроксильный радикал (ОН ).
Введение в модельную систему антиоксидантов приводит к торможению СРО люминола. Это проявляется в изменении параметров кинетики ХЛ, в частности, латентного периода [32,81,107,108]. В нашей работе для количественной оценки АОА мы измеряли величину латентного периода. Расчет антиокислительной активности:
АОА оценивали количественно в принятых в отечественной и зарубежной литературе единицах - в мкМ стандартного антиоксиданта тролокса - в тролоке-эквиваленте.
Для построения калибровочной кривой использовали тролокс, который представляет собой водорастворимый аналог витамина Е. Из основного ОД56 мМ р-ра тролокса готовят 4, 8, 16 мкМ растворы, которые используют для построения калибровочной кривой. На оси абсцисс откладывают значение концентрации, а на оси ординат величину (t - to) \ to, где: to — латентный период ХЛ или время, прошедшее от момента внесения Н2О2 в реакционную среду контрольной пробы до начала развития свечения ХЛ; определяется путем аппроксимирования прямолинейного участка кривой хемилюминесценции и ее экстраполяцией на ось абсцисс; t - время, прошедшее от момента внесения Н2О2 в реакционную среду опытной пробы до начала развития свечения хемилюминесценции ( определяется аналогично to ).
Величину латентного периода хемилюминесценции модельной системы в присутствии водянистой влаги определяли аналогично латентному периоду хемилюминесценции системы в присутствии тролокса при построении калибровочной кривой.
Рассчитывали величину (t - to) / to и по калибровочному графику находили концентрацию тролокса, соответствующую этой величине. После этого вычисляли окончательную АОА влаги, учитывая ее предварительное разведение (Рис. 5).
Влияние инстилляций глазной лекарственной формы 1% липоевой кислоты на паренхиматозные органы экспериментальных животных (кроликов) (острая и хроническая токсичность)
В водянистой влаге глаза больных ОУГ отмечается статистически достоверное, сравнительно с контролем, увеличение содержания первичных (перекиси липидов), вторичных (альдегиды) и конечных (шиффовы основания) продуктов перекисного окисления [25].
Кроме того, другим фактором, влияющим на интенсивность процесса ПОЛ, может являться снижение активности биогенных антиоксидантов в камерной влаге и тканевых структурах дренажной системы. Имеются данные о том, что при определенном снижении концентрации аскорбиновой кислоты последняя приобретает свойства прооксиданта, активируя процесс свободнорадикального окисления [7,141]. В клетках трабекулярного эпителия неглаукоматозных глаз активность антиокислительных ферментов достаточно высока, что указывает на важную физиологическую роль антиокислительной системы в тканях трабекулы [178].
Продукты ПОЛ поступают во влагу из омываемых ею тканей. При усилении процессов ПОЛ во влагу поступает большее количество вышеуказанных продуктов. В литературе есть сообщения об увеличении содержания продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов, шиффовых оснований) в водянистой влаге и тканях дренажной системы у больных глаукомой. По мере прогрессирования глаукомы активность процессов ПОЛ в глазу возрастает [16,17,56]. Становится очевидным, что при данной патологии значительно снижается функция антиокислительной системы.
К наиболее важным биогенным антиоксидантам относят глутатион, витамины А, С, Е, бета-каротин, таурин, церулоплазмин. Наряду с соответствующими ферментами (каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионтрансфераза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза) большинство упомянутых веществ содержится в тканях и жидкостях глаза. Это указывает на высокую значимость процессов антиоксидантной защиты [38,39,111].
Данные литературы доказывают снижение антиокислительной защиты тканей глаза при ОУГ, что дает основание для применения антиоксидантов у больных с данной патологией [38,54,103].
Для лечения глаукомы применяли такие антиоксиданты, как аевит (препарат витаминов А и Е) [63], аскорбиновую кислоту, эмоксипин (препарат класса 3-оксипиридина) [52,53,130], токоферол с эмоксипином [46,127], эрисод, циклокар, гистохром, липоевую кислоту (в таблетках) [45,49,50,112,113,114]. Все вышеперечисленные препараты имеют разный механизм действия. Большинство - жирорастворимые соединения, что затрудняет их местное применение.
При пероральном приеме таблетированной формы ЛК у больных ПОУГ I и II стадии с нормализованным и умеренно повышенным внутриглазным давлением отмечалось повышение уровня глутатиона в эритроцитах и концентрации SH-групп в слезе.
Учитывая положительный эффект перорального применения больными ПОУГ таблетированной формы антиоксиданта - липоевой кислоты, целью настоящей работы явилась разработка и медико-биологическое изучение новой глазной лекарственной формы липоевой кислоты для применения ее в качестве антиоксиданта в терапии глаукомы (экспериментальное исследование).
В связи с этим основными этапами нашей работы были: - Участие в разработке глазной водорастворимой лекарственной формы липоевой кислоты для антиоксидантной терапии глаукомы. - Изучение токсического действия лекарственной формы липоевой кислоты на ткани глаза и паренхиматозные органы экспериментальных животных (кроликов). - Разработка методов количественной оценки влияния липоевой кислоты на антиокислительную активность во влаге передней камеры у кроликов. - Исследование влияния инсталляций лекарственной формы липоевой кислоты на динамику изменения антиокислительной активности во влаге передней камеры кроликов. Разработка оптимального режима применения лекарственной формы липоевой кислоты в качестве антиоксиданта для терапии ОУГ. Сравнение влияния инстилляций раствора ЛК и эмоксипина на АОА влаги передней камеры глаз кроликов. - Изучение антиоксидантного действия раствора липоевой кислоты in vitro во влаге передней камеры больных глаукомой с различными стадиями заболевания. В данной работе нами была использована водорастворимая глазная лекарственная форма липоевой кислоты 0,1% и 1% концентрации с нейтральной рН, изготовленная в АО «Диафарм». Мы впервые установили, что при инстилляциях ЛК в глаз кроликам во влаге передней камеры повышается АОА.
Количественную оценку влияния инстилляций липоевой кислоты на АОА влаги передней камеры кроликов проводили методом хемилюминесценции в системе гемоглобин-люминол-перекись водорода, который позволяет оценить антиокислительную активность по отношению к самому распространенному и агрессивному свободному радикалу - гидроксил-радикалу. АОА во влаге измеряли в различные сроки после инсталляций ЛК.
Работа проведена на 129 экспериментальных животных (258 глаз) — половозрелых кроликах породы шиншилла весом 2,5-3,5 кг.
На 84 кроликах (168 глаз) исследовали влияние инстилляций глазных капель ЛК на АОА влаги передней камеры в разных режимах и разной концентрации. Было проведено VII серий экспериментов. В каждой серии имелась опытная и контрольная группы животных. Контрольная группа кроликов получала инстилляций основы ЛК по схеме, аналогичной с опытной группой. В экспериментах по длительным инстилляциям имелась дополнительная группа кроликов для определения «фоновой» АОА. Под «фоновыми» значениями подразумевали величину АОА влаги, полученной после забора ее на 16 сутки через 15 часов после последней инстилляций.
В I серии эксперимента животным опытной группы однократно инсталлировали ЛК 0,1% концентрации; животным опытной группы II серии - однократно инсталлировали ЛК 1% концентрации; III серии - 0,1% ЛК 3 раза в день в течение 4-х дней; IV серии - 1% ЛК 3 раза в день 4 дня; V серии - 1% ЛК 3 раза в день 16 дней.
Сравнение антиокислительной активности влаги передней камеры глаз кроликов после однократной инстилляций 1% липоевой кислоты и 1% эмоксипина
При инсталляциях данной лекарственной формы (1% ЛК) 3 раза в день в течение 16 дней были получены максимальные и статистически достоверные изменения значения АОА во влаге передней камеры глаз кроликов.
На 37 кроликах (74 глаза) для сравнения с действием 1% ЛК изучали АОА влаги передней камеры после инстилляций 1% раствора эмоксипина (VI и VII серии экспериментов). Контролем служили группы интактных кроликов. Инстилляций 1% эмоксипина производили по схеме, аналогичной с инсталляциями 1% ЛК.
В результате инстилляций 1% эмоксипина не было получено статистически достоверного изменения АОА во влаге передней камеры глаз кроликов. Таким образом, 1% липоевая кислота проявила более выраженные антиоксидантные свойства по сравнению с эмоксипином.
Эмоксипин относится к группе 3-оксипиридинов и широко применяется в офтальмологии. Полагают, что одним из основных механизмов действия этого препарата является его антиоксидантная активность [87]. Эмоксипин обладает ангиопротекторным действием. Он уменьшает проницаемость сосудистой стенки, снижает вязкость крови и агрегацию тромбоцитов, усиливает фибринолиз, улучшает микроциркуляцию, повышает устойчивость тканей к гипоксии [52]. Установлена способность эмоксипина накапливаться во влаге передней камеры глаза после однократной инстилляций с максимумом накопления от 1 до 3 часов [85].
По нашим данным и данным литературы эмоксипин не оказывает влияния на величину латентного периода в системе гемоглобин-перекись водорода-люминол [13], т.е. не влияет на свободнорадикальные процессы, вызванные действием наиболее агрессивного и распространенного свободного радикала — гидроксил-радикала. В других модельных системах свободнорадикального окисления эмоксипин оказывал антиоксидантное действие при концентрациях 0,1-1,0 мМ, т.е. это вещество на 2-3 порядка менее активно, чем известные антиоксиданты [47,62]. Это позволяет предположить, что влияние эмоксипина на свободнорадикальное окисление (СРО) носит опосредованный характер. В частности, улучшая микроциркуляцию и энергетический обмен в тканях, эмоксипин, по-видимому, препятствует формированию условий для активации СРО. Полагают также, что при местном применении данного препарата может создаваться концентрация, достаточная для реализации и прямого антиоксидантного действия (концентрация в ампуле 57,6 мМ). Наши данные указывают на то, что при закапывании 1% раствора эмоксипина в водянистой влаге подобная концентрация препарата, по-видимому, не достигается. Можно предположить, что благоприятное действие этого препарата на клинические показатели у больных с глаукомой связано с другими его свойствами, которые также косвенно могут препятствовать излишнему образованию свободных радикалов.
На 8 кроликах изучали влияние инстилляций 1% ЛК на ткани глазного яблока (16 глаз) и паренхиматозные органы животных (острая и хроническая токсичность)
В ходе проведенных исследований было установлено, что предлагаемая лекарственная форма липоевой кислоты не оказывает токсического действия на ткани глазного яблока и паренхиматозные органы при инстилляций ее в глаза экспериментальным животным (кроликам). Для изучения влияния липоевой кислоты на влагу передней камеры больных ОУГ были проведены опыты (in vitro). Все больные были разделены на группы в зависимости от стадии заболевания. Забор влаги производили во время антиглаукоматозных операций через парацентез с помощью инсулинового шприца. Измерение АОА осуществляли хемилюминесцентным методом (описание см. выше).
В результате данных экспериментов во влаге больных с П-а, П-в, Ш-в, Ш-с стадиями ПОУГ значения АОА держались в пределах контрольных значений, тогда как во влаге больных с Ш-а стадией (т.е. в далекозашедшей стадии с нормализованным давлением) отмечалось статистически достоверное увеличение АОА.
Данные, полученные в опытах in vitro, дают основание полагать, что ЛК не оказывает непосредственного влияния на АОА изолированной влаги передней камеры. По-видимому, антиоксидантную активность ЛК обуславливает восстанавливающая активность дигидролипоевой кислоты (восстановленная форма липевой кислоты). Мы допускаем, что ДГЛК в присутствии ионов металлов переменной валентности может выступать в качестве прооксиданта и инициировать окисление липидов. Наблюдаемое нами повышение АОА во влаге больных после инстилляций ЛК обусловлено взаимодействием ее с метаболическими системами, поступающими из клеточных структур, омываемых влагой. Мы считаем, что при далеко зашедшей глаукоме, когда имеется грубое повреждение клеток, их компоненты могут поступать во влагу и взаимодействовать с ЛК.
Проведенные исследования свидетельствуют о высокой антиоксидантной активности нового препарата (лекарственной формы 1% липоевой кислоты), предполагаемого использовать в дальнейшем для антиоксидантной терапии глаукомы.
