Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Хламидийная инфекция и ее роль в глазной патологии 13
1.1.1. Общая характеристика возбудителей хламидиозов, формы инфекционно-воспалительного процесса, обусловленного хламидиями. 13
1.1.2. Классификация хламидий, заболевания, вызываемые ими и распространенность хламидиозов 14
1.1.3. Патогенез хламидийной инфекции 17
1.1.4. Клетки-мишени для возбудителей хламидийной инфекции 21
1.1.5. Клинические формы хламидийного поражения органа зрения и методы
диагностики хламидийной инфекции 22
1.2. Стекловидное тело в норме и его дистрофические изменения 26
1.2.1. Общая характеристика стекловидного тела 26
1.2.2. Классификации дистрофических изменений и задней отслойки стекловидного тела 28
1.2.3. Клинические признаки и методы диагностики дистрофических изменений стекловидного тела 31
1.2.4. Некоторые аспекты патогенеза дистрофических процессов в стекловидном теле и их связь с различными факторами 32
1.2.5. Возможные мишени в стекловидном теле и сетчатке для возбудителей скрытых инфекций 34
1.3. Экспериментальные модели хламидийной инфекции 36
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 42
2.1. Экспериментальная часть исследования 42
2.2.1. Использованная культура возбудителей 43
2.2.2. Протокол заражения и методы лабораторного контроля инфицированности животных з
Забор материала, животных исследований
Методы офтальмологического осмотра экспериментальных
Порядок выведения животных из эксперимента его подготовка для морфологических
2.2. Клиническая часть исследования 53
2.2.1. Дизайн клинического исследования 53
2.2.2. Офтальмологическое исследование 55
2.2.3. Исследуемые факторы 56
2.2.4. Сбор, хранение и транспортировка материала, лабораторные методы диагностики в клинической части исследования 57
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 63
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Результаты экспериментального исследования
3.1.1. Период клинического наблюдения 64
3.1.1.1. Группа животных, инфицированных возбудителем C.trachomatis L2
3.1.1.2. TWAR
3.1.1.3. Группа животных, инфицированных возбудителем C.pneumoniae 77
Группа сравнения (введение транспортной среды)
3.1.2. Морфологические исследования 78
3.1.2.1. Группа животных, инфицированных возбудителем C.trachomatis Группа животных, инфицированных возбудителем C.pneumoniae L2
3.1.2.2. TWAR
3.1.2.3. Группа сравнения (введение транспортной среды)
3.1.3. Статистический анализ результатов экспериментальной части
исследования 103
3.2. Результаты клинического исследования 106
3.2.1. Характеристика общей выборки участников исследования 106
3.2.2. Характеристика изменений стекловидного тела в исследуемой группе с ДСТ и подгруппе с ЗОСТ 109
3.2.3. Результаты лабораторного обследования в общей выборке участников исследования 115
3.2.4. Сравнение исследуемой группы с ДСТ и подгруппы с ЗОСТ с группой сравнения 123
3.2.5. Корреляционная связь исследуемых факторов с дистрофическими изменениями стекловидного тела 127
ГЛАВА 4. Заключение 130
Выводы 142
Практические рекомендации 144
Список сокращений, условных обозначений, символов,
Единиц и терминов 145
Список литературы 147
- Классификация хламидий, заболевания, вызываемые ими и распространенность хламидиозов
- Клинические признаки и методы диагностики дистрофических изменений стекловидного тела
- Порядок выведения животных из эксперимента его подготовка для морфологических
- Группа животных, инфицированных возбудителем C.trachomatis L2
Классификация хламидий, заболевания, вызываемые ими и распространенность хламидиозов
Возбудители хламидиозов представляют собой группу патогенных облигатных внутриклеточных паразитов, которые используют макроэргические соединения (аденозинтрифосфат - АТФ) хозяина [28,55,200]. По своему строению хламидии сходны с грамотрицательными бактериями, их антигенные свойства, а также принадлежность к роду, виду и серотипу обусловлены компонентами клеточной стенки: липополисахаридом (LPS), имеющим родоспецифическую антигенную детерминанту, и белками наружной мембраны с вариабельными эпитопами (Outer Membrane Protein – OMP), представленными на 60 % основным белком MOMP (Main Outer Membrane Protein) и на 40 % OMP-2 [16,154,187]. Поверхностные белки определяют такие важные функции, как вирулентность, инвазивность, ингибирование лизосомальной активности клетки-хозяина.
Хламидии обладают уникальным циклом внутриклеточного развития, включающим в себя инфекционную форму (элементарные тельца) и репродуктивную форму (ретикулярные тельца) [28]. Фагоцитируемые клеткой-мишенью элементарные тельца (ЭТ), избегают разрушения за счет фагосoмной мембраны и трансформируются сначала в промежуточные тельца, а затем в ретикулярные тельца (РТ), которые совершают 8-12 циклов бинарного деления и превращаются вновь в ЭТ. Клетка, заполненная возбудителем, разрушается, а ЭТ, оказываясь в межклеточном пространстве, инфицируют новые клетки. При проникновении в клетку нескольких ЭТ может сформироваться несколько микроколоний. Цикл развития занимает до 72 часов, но под воздействием различных внешних факторов (например, реакции теплового шока или нерациональной антибактериальной терапии) цикл может приостановиться в репродуктивной фазе с трансформацией возбудителей в L-форму (latent скрытый), при которой возбудитель в форме мелких цитоплазматических включений с низкой синтетической активностью способен длительно сохраняться (персистировать) и переходить в дочерние клетки при делении клетки-хозяина [37,70,71]. В случае перехода в L-форму на мембране инфицированных клеток экспрессируются не все белки хламидий, что ведет к избирательной стимуляции иммунокомпетентных клеток и оказывается недостаточным для эффективного иммунного ответа [69,199,200].
Хламидии вызывают различные по форме и течению инфекционно воспалительные процессы, определяемые как носительство инфекции, инфицированность, острая, хроническая, субклиническая и латентная формы инфекции, реинфекция [38]. Под инфицированностью подразумевается наличие возбудителя в макроорганизме, при этом если видимые признаки заболевания отсутствуют на фоне иммунологических сдвигов и характерных функциональных и морфологических изменений в пораженных органах и тканях, то говорят о носительстве инфекции. Острая форма инфекции характеризуется непродолжительным пребыванием возбудителя в макроорганизме с формированием различной степени невосприимчивости (иммунитета) к повторному заражению. Хроническая форма сопровождается длительным пребыванием хламидий в организме с ремиссиями, рецидивами, обострениями заболевания. При повторном заболевании в результате повторного заражения тем же возбудителем инфекции говорят о реинфекции.
При латентной форме инфекции происходит бессимптомное взаимодействие макроорганизма с возбудителем, находящимся либо в дефектной форме, либо в особой стадии своего существования (поддержание жизнедеятельности внутри клеток хозяина), при этом возможен переход в острую форму инфекции.
Возбудители хламидийных инфекций по современной классификации относятся к порядку Chlamydiales, семейству Chlamydiaceae и объединены в два рода: Chlamydia и Chlamydophila [55].
В роде Chlamydia, важнейшей фенотипической особенностью представителей которого является способность накапливать гликоген в цитоплазматических включениях (тельца Провачека-Гальберштедтера), возбудителями антропонозных инфекций являются различные серовары вида Chlamydia trachomatis, обуславливающие трахому, паратрахому, урогенитальный хламидиоз, венерическую лимфогранулему, проктиты, некоторые формы артритов, пневмонию у новорожденных [28,38,39]. 18 сероваров этого вида объединены в два биовара: трахома (серовары A-K, Ba, Da и Ia) и лимфогранулема венерум (LGW серовары L1, L2, L2a и L3) [69]. Наибольшее клиническое значение ввиду распространенности урогенитального хламидиоза имеют серовары D, E, F, G, H, I, J и K вида C.trachomatis. Данные о частоте инфицированности возбудителями урогенитального хламидиоза в различных работах варьируют, что может быть связано, по мнению некоторых авторов, с различной чувствительностью используемых методов лабораторной диагностики [16]. Урогенитальный хламидиоз является одним из самых распространенных сексуально-трансмиссивных заболеваний, в мире им ежегодно заболевают более 90 миллионов человек [22,107]. Скрининговое исследование в Англии, проведенное в 2006 году, установило, что количество людей, инфицированных возбудителем урогенитального хламидиоза Chlamydia trachomatis, составило 10 % при среднем возрасте инфицированных женщин 16-19 лет и 20-24 лет мужчин [155,185]. В США частота инфицированных Chlamydia trachomatis людей в 2006 году составила 13,1 %, приблизительно у 70 % из них урогенитальный хламидиоз протекает в бессимптомной форме [192,215]. В России урогенитальным хламидиозом ежегодно заболевают 1,5 млн человек [15,19]. В Санкт-Петербурге частота инфицированности урогенитальным хламидиозом составляет около 12 % взрослого населения [27]. Более чем в половине случаев урогенитальный хламидиоз сопровождается поражением органа зрения, чаще всего развитием хламидийного конъюнктивита [1]. В целом, в структуре воспалительных заболеваний глаз в офтальмологической практике на долю связанных с хламидийной инфекцией заболеваний глазной поверхности приходится около 8-10 %, удельный вес хламидийных конъюнктивитов составляет от 3 до 30 % от общего числа конъюнктивитов [2,8,29].
В род Chlamydophila включены шесть видов: C.pecorum, C.pneumoniae, C.psittaci, C.abortus, C.caviae, С.fellis. Но наибольшее клиническое значение имеет вид C.pneumoniae, и его серовар TWAR [111]. Серовар TWAR был описан сравнительно недавно: исследователи установили, что выделенный в 1965 году на острове Тайвань из конъюнктивы больного ребенка штамм TW183 идентичен штамму AR39, выделенному в 1983 году в США из фарингеального смыва больного острым респираторным заболеванием, а детальное изучение свойств показало принадлежность возбудителей к хламидиям, вызывающим у человека преимущественно острые и хронические пневмонии [28]. В целом, возбудитель C.pneumoniae TWAR обуславливает до 25 % случаев респираторных заболеваний, в том числе до 10 % эндемических пневмоний, 5 % случаев острых и хронических бронхитов [5,38,114]. Кроме того, в ряде работ получены данные о возможной взаимосвязи возбудителя C.pneumoniae серовар TWAR с развитием атеросклероза, бронхиальной астмы и дегенеративных заболеваний центральной нервной системы [67, ,78, 94,110,117,139].
При проведении сероэпидемиологических исследований в разных выборках было установлено, что антитела к C.pneumoniae присутствуют более чем у 60 % взрослого населения [19,22,28,97,107,155,192]. Первичное инфицирование C.pneumoniae происходит чаще у детей и подростков в возрасте от 5 до 15 лет, среди которых доля серопозитивных лиц составляет приблизительно 30 %, а реинфицирование в дальнейшем может происходить в течение всей жизни человека [16,140]. С возрастом число лиц, инфицированных возбудителем, увеличивается, причем во взрослой популяции серопозитивными чаще оказываются мужчины (55-76 %), нежели женщины (40-68 %) [97]. 1.1.3. Патогенез хламидийной инфекции
Инфицирование человека возбудителем C.trachomatis происходит половым, контактно-бытовым и вертикальным (от матери к плоду) путями, при этом на конъюнктиву хламидии заносятся с отделяемым из пораженных глаз, урогенитального тракта или предметов личной гигиены, где они способны сохранять жизнеспособность в течение суток при комнатной температуре, а также через воду в бассейнах, общественных банях [13,38]. Инфицирование человека C.pneumoniae происходит воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем заражения [5,28].
После внедрения возбудителей в тропные к нему клетки переходного эпителия слизистых оболочек мочеполовой системы, клетки конъюнктивы (C.trachomatis), или эпителий дыхательных путей (C.pneumoniae) развивается инфекционно-воспалительный процесс, протекающий в несколько стадий [38]. Так, В.М.Гранитов (2002) выделяет пять стадий [16]:
1. Возбудитель инфицирует клетки-мишени слизистых оболочек, к которым он тропен, нарушая биосинтетические процессы в клетках и разрушая их при размножении.
2. Развитие первичной региональной инфекции, когда возбудитель реализует цикл размножения на фоне индукции инфекционно-воспалительного процесса.
3. На фоне клинической манифестации заболевания инфекция распространяется из места первичного инфицирования в окружающие клетки, к которым тропен возбудитель, а также в отдаленные органы и ткани в составе мононуклеаров крови (моноциты, макрофаги, полиморфноядерные лейкоциты и лимфоциты).
4. Антигены возбудителя стимулируют развитие иммунопатологических состояний (синдром Рейтера), что чаще наблюдается у лиц, у которых присутствует антиген HLA-B27, ассоциирующийся со спондилоартропатиями и увеитами [164].
5. Резидуальная (остаточная) фаза, во время которой возбудитель может уже отсутствовать в организме, но морфологические и функциональные изменения в пораженных органах и системах сохраняются или прогрессируют.
При продуктивной инфекции (активном размножении хламидий и инфицировании новых клеток) в качестве немедленной неспецифической реакции иммунной системы (проиммунитет) в течение нескольких суток после внедрения возбудителей происходит активация клеточного звена (макрофаги) с продукцией факторов неспецифической иммунной защиты (лизоцим, интерферон) и локальное образование секреторного IgA [91]. Индукция специфического иммунного ответа происходит в соответствии с механизмами, характерными для внутриклеточных инфекций (например, микобактерий туберкулеза) [38,57]. При завершенном фагоцитозе возбудителей в клетках-фагоцитах (макрофаг, моноцит) хламидийные антигены подвергаются процессингу и представляются В-лимфоцитам с последующей активацией лимфоцитов Т-хелперов 1 типа (Тh1-лимфоциты), которые уже через 48 часов после инфицирования начинают вырабатывать антитела IgM к LPS-антигену (с пиком на 4-6 сутки; начало индуктивной фазы), а затем и антитела IgG [82,113,179,200]. Антитела IgG начинают вырабатываться в среднем через 4-6 дней и достигают пика через 2-3 недели, а антитела IgG к антигену MOMP можно обнаружить через 4-8 недель после инфицирования.
Продукция антител и фагоцитарная активность макрофагов возможны только при нахождении хламидий в форме ЭТ, в случае же внутриклеточной локализации (РТ, промежуточные тельца и L-формы) возбудитель может не подвергаться фагоцитозу, и тогда инфекция становится персистирующей [16,86,108]. Способность к персистенции обусловлена тем, что хламидии посредством своих поверхностных белков способны блокировать слияние лизосом с фагосомами, в результате антигены хламидий не подвергаются процессингу и презентации на поверхности фагоцитов [101]. Дополнительно в условиях изменения метаболизма инфицированной клетки снижается продукция хламидиями MOMP и LPS [83].
Клинические признаки и методы диагностики дистрофических изменений стекловидного тела
По окончании введения 400 мл этилового спирта 96 % в магистральные сосуды производили энуклеацию глазных яблок, производя круговую конъюнктивотомию, пересечение экстраокулярных мышц и зрительного нерва. В удаленном глазном яблоке для дополнительной префиксации выполняли инъекцию 0,5 мл жидкости Карнуа (этиловый спирт 96% : хлороформ : ледяная уксусная кислота = 6:3:1) в переднюю камеру, затем глазное яблоко фиксировали в жидкости Карнуа в течение 1 часа, после чего рассекали в сагиттальной плоскости, не допуская потери стекловидного тела, фотографировали макропрепарат, и с учетом объема ткани снова помещали в фиксатор (жидкость Карнуа) на 3 часа, затем промывали в 100 % этиловом спирте до исчезновения запаха уксусной кислоты (в течение 1,5 часов при 4-кратной смене спирта). Далее осуществляли гистологическую проводку в следующем порядке: дважды по 60 минут в 100 % этиловом спирте, затем дважды через смесь 100 % этилового спирта и хлороформа (3:1) по 2 часа, после чего дважды по 1 часу через хлороформ и расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе. После этого материал заливали в парафиноподобную среду (HISTOMIX, Биовитрум, Россия) с дальнейшим изготовлением блоков [26].
Изготовление микропрепаратов, их окраску и микроскопию выполняли под руководством морфолога отдела морфологии ФГУ «ГосНИИИ военной медицины» МО РФ к.б.н. Владимировой О.О. Для этого из парафиновых блоков на ротационном микротоме Leica RM 2235 (Leica, Германия, 2006) с применением одноразовых лезвий ACCU-EDGE S35 (Feather, Япония, 2006) готовили серии срезов толщиной 4 мкм, из которых в дальнейшем изготавливали парные микропрепараты. Последовательные парные срезы, которые в дальнейшем окрашивали различными методами, позволяли соотнести патологические изменения в тканях и локализацию возбудителей. После депарафинизации один из парных срезов окрашивали гематоксилином Карацци и водным эозином («Биовитрум», Санкт-Петербург) для оценки морфологических изменений в тканях. Световую микроскопию производили на лабораторном микроскопе Leica MT 2500 (Германия, 2008). Оценивали структурные изменения в тканях глаза, более детально исследуя изменения СТ и внутренних слоев сетчатки, их локализацию и степень выраженности, с фоторегистрацией полученных данных. Окрашивание парного среза осуществляли методом ПИФ с использованием диагностического набора «ХламоСкрин» (НИАРМЕДИК, Россия, 2007), куда входят диагностические флюоресцирующие родоспецифические моноклональные антитела. Затем наличие и форму возбудителей, их локализацию определяли при люминисцентной микроскопии на лабораторном микроскопе Leica MT 2500 (Leica, Германия, 2008) с дополнительной секцией ртутной лампы. При микроскопии размеры микроскопируемых объектов, расстояния между ними измеряли, используя программный пакет Leica Image Manager, входивший в состав микроскопа. Локализацию обнаруженных при иммуногистохимическом анализе (ПИФ) хламидийных включений сопоставляли с парным микропрепаратом, окрашенным гематоксилином и эозином, что позволяло соотнести
Исследование случай-контроль было проведено в период с марта 2013 года до октября 2013 года. Исследование «случай-контроль» является одним из типов наблюдательных ретроспективных исследований, в котором устанавливают наличие или отсутствие связи между каким-либо фактором риска и клиническим исходом (развитие заболевания, его прогрессирование, излечение). При этом сравнивают долю участников, подвергшихся воздействию «фактора риска», в двух сходных по возрасту и полу группах людей, в одной из которых развился клинический исход («случай»), а в другой не развился («контроль») [33].
Всего в клинической части исследования участвовали 144 добровольца: 69 мужчин, 75 женщин в возрасте от 40 до 50 лет (средний возраст составил 46,12±2,86 лет) из пациентов санатория-профилактория «Федосьино» ВВ МВД (профиль санатория – заболевания сердечно-сосудистой системы, дыхательной системы, опорно-двигательного аппарата, нервной системы и медицинская реабилитация), удовлетворяющих условиям включения и исключения из исследования. Обследуемые были включены последовательно в основную группу (с наличием ДСТ, в том числе ЗОСТ), либо в группу сравнения (обследуемые без ДСТ). Исследуемая группа состояла из 46 обследуемых (23 мужчины, 23 женщины, средний возраст 47,51±2,52 лет) с клиническими признаками ДСТ.
Подгруппа основной группы с подтвержденной при биомикроскопии и УЗ-исследовании ЗОСТ включала 19 человек (10 мужчин, 9 женщин, средний возраст 49,11±0,81 лет). Контрольная группа состояла из 98 (46 мужчин, 52 женщины, 45,33±2,83 лет) человек без клинических признаков ДСТ при биомикроскопии и УЗ-исследовании. От каждого участника исследования было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Дистрофические изменения СТ классифицировали как деструкцию СТ (ДСТ), ДСТ с неполной и полной задней отслойкой СТ (ЗОСТ). Под ДСТ принято понимать нарушение организации макромолекулярного каркаса СТ вследствие различных причин, сопровождающееся утолщением, огрублением волокон, фракционированием витреального геля (ликвификация и синерезис), визуализируемых при биомикроскопии и ультразвуковом исследовании [191]. Клинически ДСТ автор определял по наличию признаков разжижения (ликвификации) СТ с фибриллярной дегенерацией, когда при его биомикроскопическом исследовании выявляли темные, оптически пустые полости, преимущественно в центральных отделах витреума, вне которых были заметны утолщенные, склеенные и хаотично перемещающиеся в жидкой водянистой субстанции СТ при изменении взгляда обследуемого фибриллы. ЗОСТ автор определял при биомикроскопии по наличию уплотненной подвижной ЗГМ и кольца Вейса. Подтверждение ДСТ и ЗОСТ производил при ультразвуковом исследовании.
Добровольцы отобраны в исследование в соответствии с критериями включения и исключения. Поскольку ДСТ и ЗОСТ, прежде всего, являются следствием возрастных изменений, а их частота увеличивается после 40 лет, то критерием включения был выбран возраст обследуемых от 40 до 50 лет включительно [143,145].
Порядок выведения животных из эксперимента его подготовка для морфологических
Во внутренних слоях сетчатки, диффузно инфильтрированной лимфоцитами и макрофагами (особенно около диска зрительного нерва и в области сосудов), выявили нарушение гистоархитектоники с изменением хода опорных волокон клеток Мюллера, новообразованные сосуды и элементы глиоза, что в целом отражало течение пролиферативного процесса, особенно в местах сохранившегося витреоретинального контакта. В различных отделах сетчатки наблюдали очаговые повреждения по типу «фолдинга», основой которому служили измененные в результате гидропической дистрофии наружные сегменты палочек и колбочек (рисунок 20).
В основании большинства выявленных на серийных срезах очагов находили плазматические клетки (рисунок 20, В). При сохранности мембран и межклеточных контактов увеличение размеров отдельных клеток способствовало описанной инвагинации участков сетчатки. Данный тип нарушений был отмечен и вне хориоретинальных очагов. В целом, патоморфологические изменения в структурах заднего сегмента глаза сходны с таковыми при экспериментальных аутоиммунных увеитах [238]. Микропрепараты глазного яблока животного, инфицированного C.trachomatis L2 (кролик №3, OD, 50 сутки после инфицирования). А. Гиалоцит у конгломерата фибрилл стекловидного тела: рядом с ядром вакуоль и фагоцитированный пигмент. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.1500. Б. Черные стрелки - лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация стекловидного тела и сетчатки; белая стрелка – участки гидропической дистрофии фоторецепторов с «фолдингом», характерные для увеитов. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.200. В. Плазматические клетки (Пл) в основании участков гидропической дистрофии фоторецепторов. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.1000.
Микропрепарат глазного яблока животного, инфицированного C.trachomatis L2 (кролик №3, OD, 50 сутки после инфицирования). А. Внеклеточные хламидийные включения в стекловидном теле. Окраска: ИГХ. Ув.1000. Б. Соответствующий участок стекловидного тела (в рамке): огрубление фибрилл стекловидного тела, лимфоциты и гиалоциты. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.600. Хламидийные включения (белые стрелки) во внутренних слоях сетчатки на уровне клеток Мюллера. Окраска: ИГХ. Ув.1000. Г. Соответствующий участок сетчатки в парном срезе: черные стрелки – ядра и тела клеток Мюллера. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.1000. При иммуногистохимической окраске флюоресценция антигенного материала возбудителей была отмечена внутри- и внеклеточно в пролифертивной ткани и остатках стекловидного тела, в области очаговых изменений сетчатки по типу «фолдинга», на уровне внутренней пограничной мембраны, в эндотелиоцитах сосудов, в клетках Мюллера сетчатки, других глиальных элементах сетчатки, в субретинальном пространстве и сосудистой оболочке (рисунок 21; таблица 9). Повышенная концентрация возбудителя в хориоретинальных очагах не отмечена. интравитреальное введение возбудителя При оценке соотношения клеток в стекловидном теле в глазах с разной формой течения инфекционно-воспалительного процесса установлено, что в сроки 72 и 128 суток после инфицирования при бессимптомной и умеренной форме поражения соотношение клеток значимо не отличается, преобладают гиалоциты (74-87% от числа клеток) и лимфоциты (7-12%). При тяжелой форме как на 56, так и на 128 сутки значимо выше содержание фибробластов (от 12 до 38%), из воспалительных клеток больше не только лимфоцитов, но и нейтрофилов, макрофагов и моноцитов (рисунок 22). Кроме того, в большем количестве выявлены клетки глии и пигментного эпителия сетчатки, преимущественно преретинально.
Соотношение клеток в стекловидном теле в глазах с разной формой поражения (Б – бессимптомная; У – умеренная; Т – тяжелая), в разные сроки забора материала и с разными способами заражения возбудителем C.trachomatis L2. 3.1.2.2. Группа животных, инфицированных возбудителем C.pneumoniae TWAR
1. Бессимптомная форма (животные № 11 (OU), №12 (OU)). Заражение без использования интравитреального пути введения возбудителей. Макропрепараты. При рассечении в сагиттальной плоскости префиксированных глазных яблок данных за патологические изменения в оболочках глаза не выявлено. В стекловидном теле единичные элементы огрубления волокон стекловидного тела, признаки фибриллярной дегенерации в кортикальном слое витреума (рисунок 23). Рисунок 23 - Макропрепарат глазного яблока животного, инфицированного C.pneumoniae TWAR (кролик №11, OD, 128 сутки после инфицирования). А. Общий вид. Ув.1. Б. Единичные элементы фибриллярной дегенерации в стекловидном теле (белые стрелки). Ув.3.
Результаты гистологического исследования. Изменения в тканях были минимальными (рисунок 24). Гомогенность структуры стекловидного тела была незначительно нарушена за счет уплотнения и локальной агломерации волокон, преимущественно у основания стекловидного тела (рисунок 24, А и Г). В основании и в препапиллярной зоне стекловидного тела выявлено увеличение количества гиалоцитов обычного вида, фибробластов, присутствовали единичные лимфоциты (преимущественно в витреуме у поверхности сетчатки и периваскулярно во внутренних ее слоях) (рисунок 24, Б). Внутренняя пограничная мембрана сетчатки была неравномерно уплотненной. В сетчатке, помимо слабой лимфоцитарной инфильтрации, явных изменений в клеточных структурах сетчатки и ее гистоархитектонике не выявлено (рисунок 24, В).
Группа животных, инфицированных возбудителем C.trachomatis L2
Результаты воспроизведенной группой авторов экспериментальной модели хламидийного поражения органа зрения не могут быть в полной мере перенесены на человека, поскольку один из использованных возбудителей является нетипичным для офтальмохламидиоза (C.trachomatis L2), а инфицирующая доза была высокой и в условиях in vivo такое количество инфекционного агента не проникает в структуры глаза. Таким образом, тяжелые формы поражения органа зрения, наблюдавшиеся в эксперименте, у человека в литературе не описаны, в то же время формы с минимальными клиническими проявлениями больше могут соответствовать субклиническим вариантам офтальмохламидиоза у человека.
Принято считать, что типичной локализацией возбудителей хламидиозов в органе зрения является конъюнктива, а при увеитах, в частности при синдроме Рейтера, поражение, в большей степени, обусловлено аутоиммунными реакциями [21,164]. Ранее в отдельных работах хламидийные включения были обнаружены в сосудистой оболочке (C.trachomatis), а также во внутриглазных лимфомах и в составе неоваскулярных мембран при влажной форме ВМД (C.pneumoniae) [8,20,112,135]. Также антигены хламидий были идентифицированы у пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки в субретинальной жидкости [6].
В эксперименте при морфологическом исследовании зараженных животных показано, что хламидийные включения присутствовали не только в конъюнктиве, но и в стекловидном теле, а также прилегающей к нему сетчатке. Мишенями для инфекции в стекловидном теле служили гиалоциты и фибробласты, а в сетчатке глиальные клетки и клетки Мюллера, участвующие в метаболизме стекловидного тела [30]. Все эти клетки, способные к фагоцитозу, имеют сходное происхождение и особенности биологии с такими клетками как астроциты, клетки микроглии, миофибробласты, макрофаги, моноциты, фибробласты, для которых уже показана возможность инфицирования возбудителями как C. pneumoniae, так и C.trachomatis [24,27,106,149,213]. Выявление хламидийных включений в гиалоцитах в глазах, где не производили интравитреального введения возбудителей, может быть обусловлено тем, что гиалоциты, относящиеся к макрофагально-моноцитарной системе, рассматриваются как мигрирующие из кровяного русла моноциты, время циркуляции которых в крови составляет до 72 часов, а жизни в тканях до 3 недель [12,95,165,166].
Отсутствие или единичные включения в 9 наблюдениях в стекловидном теле и в 2 наблюдениях в сетчатке при морфологическом исследовании также согласуется с имеющимися данными о патогенезе хламидийной инфекции. Так, хламидии могут принимать участие в патологических процессах в инициальной стадии, когда возбудитель, размножаясь и инфицируя новые клетки, выступает в качестве триггера иммунологический реакций [69,158]. В дальнейшем, при элиминации, излечении или переходе в персистирующую инфекцию возбудитель уже может отсутствовать либо сохраняться в L-форме, что затрудняет его идентификацию обычными рутинными методами, хотя повреждение тканей продолжается за счет иммунных механизмов. Такой вариант описан в работах, посвященных изучению роли хламидийной инфекции в атерогенезе, а также при ВМД, когда на фоне сильной корелляционной связи с наличием антител к C.pneumoniae существуют лишь отдельные сообщения о выявлении самого возбудителя в эндотелиоцитах и миофибробластах неоваскулярных мембран [126,127,133].
Хламидийные включения в стекловидном теле и во внутренних слоях сетчатки выявляли как при инфицировании C.trachomatis L2, так и C.pneumoniae TWAR, что может свидетельствовать об общих механизмах и путях распространения возбудителей, несмотря на тропность к разным типам клеток. Если выделение возбудителей в период клинического наблюдения в конъюнктиве культуральным методом доказывало наличие жизнеспособного инфекционного агента, то обнаружение методом ПИФ при патоморфологическом исследовании хламидийных включений в стекловидном теле не может служить в полной мере подтверждением жизнеспособности выявленных хламидийных включений. Это связано с тем, что люминисценцию дает антиген клеточной стенки возбудителя, таким образом, при исследовании можно наблюдать нефагоцитированные остатки хламидийных включений [38]. С другой стороны, выявление хламидийных включений, расположенных внутриклеточно (то есть ретикулярные тельца, продуктивная форма инфекции) в стекловидном теле и внутренних слоях сетчатки через 128 суток после инфицирования конъюнктивы и субконъюнктивального введения позволяет говорить о проникновении и сохранении в стекловидном теле жизнеспособного возбудителя [52]. Так, время жизни моноцитов-макрофагов, в составе которых возбудитель может мигрировать из очагов первичной локализации, составляет не более 3 недель, а разрушенные клетки подвергаются лизису и фагоцитированию. При этом отдельные фрагменты хламидийных включений, будучи освобожденными из разрушенных клеток и вновь фагоцитированными, не могут избежать, в отличие от жизнеспособного микроорганизма, разрушения лизосомами, что противоречит обнаружению возбудителей на 128 сутки после инфицирования [28]. Кроме того, как было указано ранее, важную роль в патогенезе хламидийного поражения играют иммунные реакции, развивающиеся в ответ на присутствие антигенов, но не обязательно живого микроорганизма.
Четвертой и пятой задачей, поставленной в работе, было изучение у лиц с дистрофическими изменениями стекловидного тела частоты выявления возбудителей хламидийной инфекции в конъюнктиве и специфических антител в крови, а также содержания провоспалительных цитокинов в слезе и сыворотке крови. Для этого было проведено исследование «случай-контроль», в котором 144 человека, удовлетворявшие критериям включения и исключения, были включены в две группы – группу из 46 обследуемых с признаками ДСТ (с выделением подгруппы с наличием ЗОСТ из 19 обследуемых) и группу сравнения из 98 обследуемых (без признаков ДСТ). Основным критерием включения в исследование служил возраст – от 40 до 50 лет, поскольку в этом возрастном диапазоне отмечено начало развития «возрастных» изменений стекловидного тела (ДСТ и ЗОСТ).
