Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Патологические изменения эпителия конъюнктивы глазного яблока и их роль в патогенезе Рубцовых деформаций 15
1.2. Патологические изменения эпителия роговицы и роль камбиальных клеток в их развитии 18
1.3. Хирургическое лечение патологических изменений эпителиальной поверхности глаза 21
1.4. Особенности регенерации эпителиальных покровов при тяжелых ожогах глаза 32
1.5. Анатомо-функциональные особенности амниотической оболочки, обуславливающие её применение в качестве пластического биоматериала. Методы консервации амниотической оболочки 43
Глава 2. Материал и методы исследования Г 50
2.1. Технологический процесс изготовления пластифицированной силиковысушенной амниотической мембраны 51
2.2. Экспериментальные методы исследования 57
2.2.1. Результаты экспериментальных исследований 57
2.2.2 Морфологические и морфометрические методы исследования .61
2.3. Характеристика больных 62
2.3.1. Методы обследования пациентов 69
2.3.2. Методы лечения пациентов 72
2.4. Статистический анализ результатов исследований 74
Глава 3. Сравнительные морфологические исследования амниотической мембраны, консервированной различными способами
Глава 4. Экспериментальное исследование биосовместимости амниотической мембраны консервированной различными способами 94
4.1 Результаты исследования иммунногенности силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны 95
4.2 Оценка биосовместимости силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны путем фиксации на её поверхности слоя культивированных клеток 114
Глава 5. Экспериментальное исследование морфологических изменений силиковысушенной амниотической мембраны на поверхности роговицы 123
5.1. Создание экспериментальной модели недостаточности камбиальных клеток. Изучение роли лимбальной зоны в развитии патологических изменений эпителия роговицы 123
5.2. Результаты морфологических исследований замещения " силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны на поверхности роговицы 139
Глава 6. Применение силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении птеригиума 150
Глава 7. Применение силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении симблефаронов .170
Глава 8. Изучение эффективности применения силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении патологических состояний переднего эпителия роговицы 179
8.1. Клинические проявления патологии региональных стволовых клеток эпителия роговицы 179
8.2.Хирургическое лечение патологических состояний роговицы 184
Глава 9. Особенности применения амниотической мембраны в лечении больных с ожогами глаз 196
9.1. Исследование нейродинамического дисбаланса при ожоговой травме глаза 197
9.2. Результаты использования силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении больных с ожоговой травмой глаза 208
Заключение 226
Выводы 245
Практические рекомендации
- Особенности регенерации эпителиальных покровов при тяжелых ожогах глаза
- Морфологические и морфометрические методы исследования
- Оценка биосовместимости силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны путем фиксации на её поверхности слоя культивированных клеток
- Результаты морфологических исследований замещения " силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны на поверхности роговицы
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Здоровая поверхность глаза сформирована двумя типами эпителия -роговичным и конъюнктивальным Передний поверхностный эпителий является одной из важнейших структур, обеспечивающих гомеостаз роговицы и глаза в целом Соответственно и патологические процессы, развивающиеся при нарушении целостности и адекватности регенераторных процессов эпителия многообразны
Наиболее частым проявлением патологии эпителиального покрова глазного яблока является птеригиум, ложный птеригиум, симблефарон, эпителиальные дистрофии роговицы (Schrrudinger G et al, 2003)
При длительном отсутствии эпителиального покрова в роговице развиваются метаболические нарушения, что приводит к развитию разнообразных по клиническому проявлению патологических состояний Данные патологические изменения могут быть подразделены на две категории Первая категория характеризуется повреждением камбиальных клеток, что может наблюдаться при химическом или термическом ожоге легкой или средней тяжести, при синдроме Stevens-Johnson, многократных криовоздействиях на зону лимба, длительном ношении контактных линз, воздействии ультрафиолетовых лучей Для второй категории характерно разрушение непосредственно морфологической структуры, на которой фиксированы камбиальные клетки Данное патологическое состояние может быть обусловлено различными кератитами, хирургическими операциями, повреждающими область лимба, ожогами тяжелой и особо тяжелой степени (Schmidinger G et al, 2003, Tsai-R J Tseng S С , 1994)
Тяжелые и особо тяжелые ожоги всегда сопровождаются грубыми повреждениями эпителиального покрова, приводящими к рубцеванию,
деформации и формированию помутнения роговицы (Гундорова РА и др ,
1996, Макаров П В , 2003)
Решение медико-социальных проблем, вызванных патологическими изменениями со стороны переднего отдела органа зрения, возможно за счет разработки и внедрения комплекса лечебных и реабилитационных мероприятий, основу которых представляют реконструктивные операции В зависимости от степени выраженности патологических изменений выполняются хирургические операции, направленные на замещение утраченных камбиальных клеток, либо хирургические вмешательства, создающие условия для полноценной регенерации собственных тканей
В первом случае выполняется ауто- или аллотрансплантация биологических тканей Однако при этом не исключается развитие иммунного конфликта и тканевой несовместимости, появляется необходимость иммунносупрессивной терапии (Брошевский ТИ, 1961, Абрамов В Г , 1968, Беляев В С, 1984)
В других случаях, для обеспечения благоприятных условий, обеспечивающих восстановление эпителиального слоя поверхности глаза, используются самые разнообразные материалы и тканевые компоненты как биологического (Гундорова РА,1996, Салихов А Ю ,1997, Ченцова Е.В ,
1997, Кашоков В II ,2001), так и неорганического происхождения (Федоров
С Н , 1982, Филатова И А , 2001, Khaw Р , 2003)
Успех хирургических вмешательств на переднем отрезке глазного яблока зависит от многих причин, в частности, от качества и скорости восстановления эпителия роговицы Очевидно, что одним из важнейших критериев оценки результатов реконструктивных операций является характер регенерации замещенных тканей При патологических состояниях, связанных с недостаточностью камбиальных клеток поверхностного эпителия, важно создать условия для восстановления эпителия и стромы роговицы
Используемые методы перемещения конъюнктивы, замещения дефектов ткани слизистой ротовой полости, пищевода приводят к грубому рубцеванию, развитию атипичной для данного участка слизистой, прорастанию вновь образованных сосудов Недостаточная эффективность хирургических вмешательств, частые рецидивы заболеваний позволяют нам считать неполноценной послеоперационную регенерацию патологического участка поверхности глазного яблока
Научный поиск наиболее эффективного пластического материала, используемого для обеспечения благоприятных условии регенерации поверхностного эпителия, позволил определить необходимые требования к биологическому материалу Прежде всего, материал должен быть биологически активным, способным восстановить временно или постоянно анатомическую целостность и функциональную полноценность эпителиального покрова глазного яблока Немаловажно постоянное наличие запаса стерильного и удобного для использования хирургом материала
Интеграция последних научных данных с медицинским опытом позволяет предложить амниотическую мембрану как наиболее действенный, эффективный и безопасный способ временного замещения дефектов эпителиальных и слизистых оболочек (Батманов Ю Е , 1990, Tseng S С , 1998, Момозе А ,2001) Однако применение амниотической оболочки на различных стадиях заболевания приводит к неоднозначным толкованиям эффективности и обоснованности данного лечебного мероприятия А Момозе и многие другие сравнивают амниотическую мембрану с «волшебными шелковыми одеждами», напротив, RIvekovi (2001) считает необоснованным широкое применение амниона Следовательно, остается нерешенным вопрос о целесообразности и эффективности использования амниотической оболочки при патологических состояниях переднего отрезка глазного яблока Таким образом, необходимо продолжить изучение свойств амниотической оболочки и разработку новых методов лечения патологических состояний эпителия
роговицы и конъюнктивы глазного яблока, выработать строгие критерии и показания к применению амниотической мембраны, оценки эффективности лечебного мероприятия
Расширение показаний к использованию амниотической оболочки выдвигает еще одну актуальную задачу - разработку новых и доступных методов консервации амниона, так как использование не консервированной амниотической оболочки, либо консервированной в питательных средах, имеет некоторые недостатки Прежде всего, это сложность планирования операции, так как необходимо учитывать время забора донорского материала Ограниченные длительность хранения амниона и жизнеспособность его эпителия вызывают сомнение в эффективности применения для создания условий полноценной регенерации поврежденных тканей Достаточно актуальна проблема стерильности при использовании нативного материала
Существующие методы длительной консервации лиофилизация, криоконсервация, так же обладают различными недостатками В частности, необходимо специальное и дорогостоящее оборудование, особенные условия подготовки и хранения биоматериала
Нерешенность проблемы лечения больных с эпителиальной патологией переднего отрезка глаза, необходимость создатгая единого алгоритма использования амниотической мембраны при патологии роговицы и конъюнктивы глазного яблока определили выбор цели нашего исследования
Следовательно, на основании вышесказанного, представляется актуальной и современной задача по дальнейшему исследованию свойств амниотической оболочки и разработке как новых методов хирургического лечения пациентов,ы так и новых методов заготовки и консервации амниотической мембраны
Целью настоящей работы является разработка комплексной системы хирургического лечения пациентов с эпителиальной патологией переднего отдела глаза на основе нового пластического материала - силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны (СПАМ)
Разработать технологию изготовления на основе амниотической мембраны нового материала с заданными свойствами механическая пластичность, низкая антигенность, вирусная и бактериальная безопасность, длительная сохранность
Изучить морфологические изменения амниотической мембраны, консервированной различными способами
Изучить воздействие химических и физических факторов при консервации путем высушивания над силикагелем с пластификаторами на иммунногешюсть и биологическую активность амниона
Исследовать в эксперименте взаимодействие силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны с тканями роговицы на экспериментальной модели недостаючности региональных стволовых клеток роговичного эпителия
Изучить эффективность применения силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении больных с патологическими изменениями конъюнктивы, обусловленными эпителиальной недостаточностью (птеригиум, симблефарон)
Изучить влияние силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны на результаты лечения больных с эпителиальной патологией роговицы
7 Разработать алгоритм лечения тяжелых и особо тяжелых ожогов глаза с использованием СПАМ
Создан биологический имплантат из амниотической мембраны -силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана (СПАМ) -удобный, эффективный и безопасный материал (Патент РФ №2214091, Патент РФ №36219)
Впервые доказана возможность сохранения соединительно-тканной структуры СПАМ и изучены морфометрические изменения при высушивании над силикагелем с пластификаторами амниотической мембраны
Впервые доказана низкая анитигенность и высокая биосовместимость СПАМ
Впервые разработана экспериментальная модель недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия, изучен механизм замещения СПАМ на поверхности роговицы и доказана его биологическая активность
Разработанный в эксперименте метод получения культуры клеток роговичного эпителия, фиксированного на поверхности силиковысушенной амниотической мембраны, открывает новые возможности при реабилитации пациентов с тяжелой эпителиальной патологией переднего отдела глазного яблока
Систематизированы методы диагностики недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия и разработана классификация недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия
Разработан метод пластики конъюнктивы СПАМ при лечении рецидивирующего птеригиума Предложен способ противорецидивного
лечения птеригиума в послеоперационном периоде (Решение о выдаче патента РФ по заявке №5054173/14)
Разработан метод пластики конъюнктивы при лечении рубцовых деформации конъюнктивальной полости с использованием СПАМ
Проведен сравнительный клинический анализ эффективности применения СПАМ при лечении заболеваний роговицы
Впервые проведено изучение результатов использования СПАМ и аутоконъюнктивы
Предложен алгоритм функциональной и косметической реабилитации больных при ожоговой болезни глаза с использованием СПАМ (Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2004611849)
Предложен простой и доступный метод консервации амниотической оболочки высушиванием над силикагелем с последующей гамма-стерилизацией
Подтвержденная гистологическими исследованиями сохранность морфологической структуры СПАМ позволила предложить данный материал для хирургического лечения больных с патологическими состояниями эпителиальной поверхности глазного яблока
Разработанный комплекс методов использования амниотической
мембраны позволяет ускорить процесс реабилитации пациентов с
патологическими изменениями эпителия конъюнктивы и рої овицы
Клинические рекомендации, основанные на внедрении в практику
алгоритма лечения пациентов с последствиями тяжелых ожогов глаза,
позволяют выбрать наиболее рациональный путь реабилитации больного
Особенности регенерации эпителиальных покровов при тяжелых ожогах глаза
Конъюнктива - богато васкуляризированная слизистая оболочка, выстилающая заднюю поверхность век, переходит на переднюю поверхность глазного яблока, и оканчивается у края роговицы. Поверхность конъюнктивы век выстлана двухслойным цилиндрическим эпителием. В данном отделе конъюнктивы у края век располагаются бокаловидные клетки, а около дистального конца хряща - крипты Генле. В области свода конъюнктивы эпителий переходит в 5-6 слойный цилиндрический эпителий с большим количеством бокаловидных слизистых клеток. Конъюнктива глазного яблока покрыта многослойным плоским эпителием. У лимба бульбарная конъюнктива имеет слабую папиллярную структуру и содержит островки цилиндрического эпителия с секретирующими клетками Бехера. [86, 112]. Конъюнктивальный эпителий расположен на соединительнотканной строме, состоящей из поверхностного лимфоидного слоя и более глубокого волокнистого слоя. Лимфоидная ткань образуется в течение первых месяцев жизни ребенка и содержит многочисленные тучные клетки, лимфоциты, тем самым обеспечивая огромный антимикробный потенциал. Более глубокий волокнистый слой образован эластичными колагеновыми волокнами и содержит сосуды и нервы конъюнктивы [112, 184].
Конъюнктива выполняет множество функций, обеспечивающих гомеостаз поверхности глазного яблока. Прежде всего, это продукция муцина слезной жидкости. Конъюнктива также имеет огромный потенциал для противостояния постоянному воздействию патогенной флоры и механическим воздействиям. Это обеспечивается клеточным составом эпителия, который активно участвует в защитной воспалительной реакции, захвате и нейтрализации инородных тел, выработке иммуноглобулинов. Выраженная васкуляризация способствует также активной лимфоцитарной реакции, фагоцитозу, ферментативной функции клеток эпителия при инвазии патологического агента. Значительная подвижность, рыхлое прикрепление конъюнктивы в области сводов выполняют защитную роль, при её патологическом повреждении возможно замещение дефекта смещением слизистой. Защитную роль выполняет также способность эпителия конъюнктивы быстро и полноценно регенерировать. При патологических изменениях роговой оболочки конъюнктивальный эпителий активно участвует в процессе восстановления структуры и функции роговой оболочки [160, 184].
Различные патологические состояния приводят к нарушению регенераторных способностей конъюнктивы. Чаще в основе патологических изменений лежит воспалительный процесс. Однако также значительное место в патогенезе заболеваний конъюнктивы занимают травматические повреждения. Постоянное или многократное воспаление конъюнктивы вызывает ряд реактивных и дегенеративных изменений. Первоначально развивается гиперплазия эпителиальных клеток, появляются фолликулы, сосочковые разрастания. В итоге, воспаление приводит к атрофии и рубцеванию конъюнктивального эпителия, что способствует потере характерных функций конъюнктивального эпителия, его кератинизации и формированию грубой деформации конъюнктивальной полости. Клинические проявления данных патологических состояний в виде птеригиума, ложного птеригиума, симблефарона, пемфигуса, постравматических рубцовых деформаций приводят к грубым нарушениям функции глаза. Птеригиум в виде треугольной складки конъюнктивы надвигающейся на роговицу характеризуется прогрессирующим течением и многократными рецидивами после хирургического лечения. В основе развития патологических изменений длительное воздействие ультрафиолетового излучения, токсичных веществ, абразивной пыли, хроническое воспаление способствующее избыточной интервенции Т-лимфоцитов. Развивающаяся при этом избыточная пролиферация ткани приводит к гипоксии и росту вновь образованных сосудов [91, 197].
Морфологической основой патологических процессов на первом этапе является гиперплазия эпителиальных клеток, развитие фолликулов и новообразованных сосудов. Периваскулярная соединительная ткань в последующем используется фибробластами как тропа перемещения. Фибробласты достигают межклеточного пространства стромы роговицы, активизируют факторы роста и способствуют выработке кератоцитами не характерных для роговицы коллагеновых волокон состоящих из коллагена I и III типа, а также способствуют патологической дедифференциации конъюнктивального эпителия, развитию сквамозной эпителиопатии, его кератинизации и формированию помутнения вокруг головки птеригиума [174,255,256.] Патологические изменения в эпителиальных клетках конъюнктивы, вызванные вирусной или бактериальной инфекцией, приводят в результате к рубцеванию и развитию ксероза. Рубцовые деформации конъюнктивы, укорочение сводов и симблефарон вызванные перечисленными патологическими изменениями приводят к нарушению гомеостаза и дедифференцировке эпителиоцитов конъюнктивы и роговицы, нарушению барьерной функции лимба. Как результат развивается неоваскуляризация роговой оболочки и формирование ее помутнения [206]. Более грубые изменения наблюдаются при травматическом поражении конъюнктивы. Выраженные патологические изменения в посттравматическом периоде связаны с нарушением регенераторной способности эпителия конъюнктивы, камбиальные клетки которого находятся в области конъюнктивальных сводов [8, 17, 45, 77] В свою очередь t рубцовые изменения конъюнктивы приводят К \ нарушению эпителиальной поверхности роговой оболочки,, формированию рецидивирующих дефектов, развитию язвы,роговицы [44, 46, 271, 276].
Морфологические и морфометрические методы исследования
Репаративная регенерация роговицы при различных патологических состояниях нуждается в создании определенных условий для усиления потенциала митотической активности региональных стволовых клеток. Имплантация в тканевые дефекты биологических материалов способна индуцировать полноценную регенерацию в ложе трансплантата. Следовательно, биологические имплантаты можно использовать для изменения активности процесса тканевой регенерации.
Анатомическое строение, особенности тканевого состава и функции амниона определяют ряд качеств, наличие которых привлекает исследователей и клиницистов к использованию амниотической мембраны при лечении различных патологических состояний. Применение неконсервированной амниотической оболочки, либо консервированной на короткие сроки в питательных средах имеет некоторые недостатки. Существующие методы длительной консервации лиофилизация, криоконсервация, обладают различными недостатками. В частности, необходимо специальное и дорогостоящее оборудование, специальные условия подготовки и хранения биоматериала.
Нами разработан и внедрен в клинику новый метод длительной консервации амниотической мембраны без фиксации на нитроцеллюлозной бумаге. Значительно более простым, по сравнению с лиофилизацией, и не требующим значительных материальных затрат, является метод высушивания над силикагелем. Метод длительной консервации биологического материала путем высушивания над силикагелем впервые предложен P.Payrau в 1959г [242J. Большой опыт консервации роговицы и склеры в глазном банке Самарской клинической офтальмологической больницы им.Т.И.Ерошевского методом силиковысушивания [121] послужил базой для разработки нового способа консервации амниотической мембраны (Патент РФ №2214091). Предложенный нами способ консервации амниотической мембраны осуществляется следующим образом. Производится забор участка плаценты в роддоме в стерильных условиях, при выполнении кесарева сечения у беременных женщин, дважды в течение беременности обследованных на ВИЧ, гепатит В и С, сифилис. Плацента очищается от сгустков крови в 0,9% растворе хлорида натрия. Амнион отделяется от остатков хориона (Рис.1).
Амниотическуая мембрана обрабатывается в 0,02% растворе хлоргексидина 10 минут, в растворе, содержащем 40мг/мл гентамицина и 2,5мг/мл амфотерицина В - 10 минут. Амниотическая мембрана погружается на время в глицерол, затем фиксируется на рамки, например, металлические, и помещается в эксикатор с силикагелем. Высушивание амниотической мембраны над силикагелем производится в течение 18-24 часов (Рис.2). В последующем, в стерильных условиях, амниотическая мембрана отделяется от рамки, упаковывается и стерилизуется гамма-лучами. Срок хранения консервированной таким образом амниотической мембраны не менее 2 лет в герметичной упаковке, при комнатных условиях (Рис. 4). Первые эксперименты были поведены без обработки AM в глицероле и показали хрупкость высушенного материала, что значительно осложняло возможность его использования. В связи с этим было предложено новое техническое решение - предварительная обработка амниотической мембраны в пластификаторе. Силиковысушенная амниотическая мембрана после обработки в защитном растворе глицерола сохраняет эластичность, сохраняется так же адгезивное свойство стромальной поверхности и блеск базальной мембраны амниотической оболочки.
Данное обстоятельство позволяет легко располагать амниотическую мембрану стромальной поверхностью к глазному яблоку при выполнении операции по замещению дефекта конъюнктивы (Рис.3).
Оценка биосовместимости силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны путем фиксации на её поверхности слоя культивированных клеток
Соединительнотканные слои компактные, фибробластов и спонгиозный претерпевают значительные изменения. На микропрепаратах криоконсервированной амниотической мембраны отмечается утолщение данных слоев более, чем в 100% по отношению к нативной амниотической мембране. Наибольшему разбуханию подвергается спонгиозный слой. Коллагеновые волокна спонгиозного слоя разнонаправленные, Однако, при подготовке препаратов после криоконсервации, в отличие от амниотической мембраны консервированной при t плюс 4С, отслоения спонгиозного слоя в следствие его избыточного разбухания не отмечалось.
Следовательно, при консервации в средах при t плюс 4С и при t минус 80С, амниотическая мембрана претерпевает некоторые изменения. Эпителиальные клетки при удлинении сроков консервации теряют жизнеспособность. Соединительнотканные слои значительно разбухают. Спонгиозный слой теряет структурную организацию и в некоторых случаях может отслаиваться.
Изучение гистологических препаратов силиковысушенной амниотнческой мембраны подтвердило наши предположения о значительных изменениях в эпителиальном слое (Рис.15). Так, эпителиальные клетки выглядят уплощенными с гомогенной оксифильной цитоплазмой. Большинство ядер палочковидной или овальной формы с грубыми глыбками хроматина, ориентированы по горизонтали. В некоторых клетках можно наблюдать пикноз ядер, в отдельных клетках обнаруживаются околоядерные вакуоли. Ядра в таких клетках изменены - неправильной формы, поверхность неровная, с вмятинами и выступами. На единичных участках клетки лишены ядер. Толщина эпителиального слоя силиковысушенной амниотнческой мембраны резко уменьшена и составляет всего лишь 45% от толщины эпителиального слоя нативной амниотической мембраны- в среднем 4,42мкм (Табл.4).
Базальная мембрана хорошо контурируется, плотной структуры и толщина её составляет не менее 1мкм.
Все подлежащие соединительнотканные слои равномерно и значительно уменьшены по сравнению с нативным амнионом и составляют соответственно: компактный - 4,87мкм- 23,1%, фибробластов -4,1мкм-19,6%, спонгиозный - 4,89мкм- 14,6% (табл.5,6,7).
Компактный слой выглядит как гомогенная бесклеточная оксифильная полоса. В слое фибробластов мы наблюдаем резкое уменьшение количества клеточных элементов. Нередко видны тени ядер. Ядра сохранившихся фибробластов имеют палочковидную форму. Сами клетки резко уплощены. Количество макрофагальных элементов тоже уменьшено, однако нам удалось наблюдать наряду с уплощенными клетками Кащенко-Гофбауэра нормальные неизмененные клетки. В этой зоне можно видеть продольно расположенные волокна прокрашивания (Рис. 16). и участки гомогенного оксифильного
Спонгиозный слой, при консервации амниотической мембраны путем высушивания над силикагелем, претерпевает наибольшие изменения, он значительно, до 80 -85%, уплощается, но сохраняется рыхлая структура соединительной ткани. В нем видны разнонаправленные пучки извитых волокон, проявляющих слабую оксифилию. Между пучками волокон встречаются единичные фибробласты. Таблица 5.
Следовательно, при консервации амниотической мембраны путем высушивания над силикагелем прекрасно сохраняется соединительнотканная структура. Эпителиальные клетки в процессе консервации гибнут, разрушаются. Однако в связи с наличием плотной связи клеточных мембран эпителия с подлежащим слоем, на поверхности базальной мембраны сохраняются остатки разрушенных клеток, что способствует сохранению биологических свойств силиковысушенной амниотической мембраны.
Сравнительные морфологические исследования, подтвержденные морфометрией и статистическими расчетами, показали неравнозначное воздействие консервации на различные структуры амниона. В частности, с высокой степенью достоверности утверждается повреждение всего клеточного состава при силиковысушиванни, однако нарастающий кариопикноз наблюдается также, как при консервации в питательной среде Eagle при плюс 4С или при минус 80 С. При консервации в питательных средах при плюс 4С происходит значительное разбухание стромальных слоев амниона, что может привести к отслоению последних при подготовке к использованию. Криоконсервация в среде Eagle при минус 80 С также приводит к значительному изменению толщины соединительнотканных слоев, но структурные изменения при этом не происходят. Напротив, значительное уплотнение слоев амниона наблюдается при высушивании над силикагелем. Однако значительные во всех случаях морфометрические изменения слоев амниотической мембраны не приводят к разрушению морфологической структуры коллагеновых волокон. Следовательно, при использовании любого метода консервации сохраняется соединительнотканная структура амниотической мембраны, но также, независимо от вида консервации, в большей (при силиковысушиванни) или в меньшей (при консервации в питательных средах) страдают клеточные структуры амниона. Учитывая экономичность и простоту консервации амниона путем высушивания над силикагелем, сохранность соединительнотканной структуры, стерильность и удобство хранения, необходимо отдать предпочтение данному методу консервации перед другими.
Результаты морфологических исследований замещения " силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны на поверхности роговицы
Тяжелые либо многократные повреждения лимба приводят к нарушению регенерации поверхностного эпителия роговой оболочки и, как следствие, к разрастанию конъюнктивального эпителия на поверхности роговицы [29, 35, 45, 81, 107, 135, 155, 167, 177]. Исследования прошедшего десятилетия позволяют утверждать, что источником регенерации роговичного эпителия являются камбиальные или монопотентные региональные стволовые клетки в области лимба (Рис. 37.) Схематическое изображение расположения зоны роста и направления миграции эпителиальных клеток. Нами проведено экспериментальное исследование по выявлению роли камбиальных клеток расположенных в области лимба в процессе регенерации эпителия роговицы. Был разработан способ получения в эксперименте лимбальной недостаточности. Для выполнения данного эксперимента были проведены эксперименты на двух группах животных: 1 группа, экспериментальная - 15 кроликов, которым выполнялось удаление роговичного эпителия путем аппликации в течение 15 секунд на поверхность роговицы диска фильтровальной бумаги пропитанного 20% раствором этилового спирта с последующим воздействием на камбиальные клетки в области лимба митомицином -С (ММС). У двух животных данной группы на левых глазах после деэпителизации раствором 20% спирта осуществлялось воздействие ММС на центральную область роговицы. Забор материала для дальнейшего исследования выполнялся на 3 и 7 сутки.
2 группа, контрольная - 8 кроликов, которым выполнялось удаление эпителиального слоя роговицы без воздействия ММС на лимбальную зону. Эпителий на правых глазах кроликов данной группы удалялся при помощи аппликации на роговицу диска фильтровальной бумаги пропитанного 20% раствором этилового спирта, а на левых глазах эпителий удалялся механическим воздействием шпателя. Забор материала для дальнейшего исследования выполнялся на 3 и 7 сутки.
Животным как экспериментальной, так и контрольной группы после иссечения третьего века (Рис.38), удалялся роговичный эпителий путем аппликации диска фильтровальной бумаги диаметром 10мм, пропитанного 20% раствором этилового спирта, на 15 -20 секунд (Рис.39). Некротизированные клетки эпителия удалялись с поверхности роговицы микротупфером. Контроль удаления роговичного эпителия производился путем окрашивания поверхности роговицы 1% раствором флюоресцеина (рис.40).
В последующем животным экспериментальной группы на область лимба выполнялась аппликация 0,04% раствора митомицина -С в течение 4 минут (Рис.41). Как известно, раствор митомицина -С достоверно угнетает процесс деления клеток [155, 156]. Экспозиция воздействия препарата значительно была увеличена для достоверного угнетения камбиальных клеток роговичного эпителия.
В послеоперационном периоде перфорации роговицы, некроза склеры не наблюдалось. Дефект эпителия сохранялся в течение 5- 7 суток после операции. По завершению эпителизации формировалось поверхностное нежное помутнение роговицы (Рис.42). В контрольной группе эпителий роговой оболочки правых глаз удалялся путем аппликации диска фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором этилового спирта, на 15 -20 секунд, эпителий роговицы левых глаз удалялся механически, путем соскабливания шпателем. Рис. 42. Кролик 215. Поверхностное помутнение в центре роговицы на 7 сутки после удаления эпителия и воздействия ММС на лимбальную зону. Морфологическая картина в экспериментальной и контрольной группе на 3 сутки после удаления эпителиального слоя.
На гистологических препаратах роговой оболочки животных контрольной группы эпителиальный слой восстанавливается. Площадь эпителизации не менее 80%. Клетки эпителия дифференцированные, располагаются в 4 ряда, ближе к центральной зоне эпителиоциты располагаются в 2 ряда. В строме роговицы отмечается воспалительная реакция, которая проявляется миграцией в слои роговицы полиморфноядерных лейкоцитов более выраженная на периферии и уменьшением числа фибрбластов (Рис.43). На препаратах роговичных дисков после механической деэпителизации дефект эпителия отсутствует. Роговичный диск покрыт эпителием (Рис.44). Воспалительная реакция на препаратах роговичных дисков после механической деэпителизации проявлялась большей пролиферацией стромы полиморфноядерными лейкоцитами и значительным уменьшением числа фибробластов в строме. . Микрофото. Кролик 101. Морфологическая структура передних слоев роговой оболочки животных контрольной группы на 3 сутки после удаления эпителиального слоя аппликацией 20% этилового спирта. Периферия роговицы. Окраска гематоксилин-эозин. Увел 10x7.
Нами выполнено исследование количества фибробластов и полиморфноядерных клеток в 10 полях 10 препаратов роговицы экспериментальной и контрольной групп животных в сравнении с гистологической картиной интактной роговицы. Результаты представлены на графике 1. / /L
График 2. Динамика заживления эпителиального дефекта роговицы в контрольной группе кроликов. Мдэп -механическая деэпителизация; Спдэп спиртовая деэпителизация; Д+ММС - спиртовая деэпителизация + воздействие на зону лимба раствором митомицина-С; Д+ММС-центр спиртовая деэпителизация +воздействие на центральную зону роговицы раствором митомицина.
При исследовании гистологических препаратов роговой оболочки в экспериментальной группе, на 3 день после деэпителизации и воздействия ММС на камбиальные клетки роговичного эпителия, отмечается наличие эпителия только по периферии, дефект эпителия более 70% площади роговичного диска. Имеющиеся эпителиальные клетки были не дифференцированы, располагались в 1 -2 ряда. Формирующийся эпителиальный слой наползал на роговицу в виде вала с периферии. В передней части стромы отмечается уменьшение количества фибробластов (Рис.46). Воспалительная реакция на препаратах экспериментальной группы была незначительной и проявлялась в виде миграции полиморфноядерных лейкоцитов на крайнюю периферию роговичного диска.
