Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Физические характеристики и биологическое действие электромагнитных излучений 7
1 Физические характеристики электромагнитных полей 7
2 Теоретические модели рецепции ЭМИ и проблема кТ 9
3 Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты
4 Современные представления о влиянии ЭМИ на метаболизм E.coli 17
5 Рсгуляторные системы клеток E.coli, потенциально задействованные в рецепции ЭМИ СВЧ. 23
6 Регуляторные системы бактериальной клетки, влияющие на синтез <т . 26
7 Регулон температурного шока и механизмы регуляции биосинтеза а32. 28
8 Механизм экспрессии а-субъединицы РНК-полимеразы и NusA. 30
9 Белки нуклеоида. 33
10 Заключение, цели и задачи 40
Глава 2 Материалы и методы исследования 42
1 Объекты исследования 42
2 Реактивы 42
3 Буферы 43
4 Растворы 44
5 Условия роста бактерий 44
6 Условия экспозиции клеток ЭМИ СВЧ 45
7 Регистрация кривых роста 45
8 Приготовление образцов для SDS-электрофореза 46
9 SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 46
10 Окрашивание гелей нитратом серебра 46
11 Двумерный электрофорез суммарного лизата белков в равновесной системе 46
12 Иммуноблоттинг 47
13 Выделение РНК из клеток E.coli 48
14 Подбор праймеров для обратной транскрипции и PCR анализа 50
15 Реакция обратной транскрипции 52
16 Количественная PCR (PCR в реальном времени) 52
17 Поиск потенциальных промоторов для антисмысловой транскрипции 53
Глава 3 Результаты и их обсуждения 53
1 Влияние ЭМИ СВЧ на динамику роста клеток E.coli 53
2 Влияние ЭМИ СВЧ на спектр растворимых белков, содержащихся в суммарном лизате клеток E.coli 54
3 Оптимизация условий для изучения вызванных ЭМИ СВЧ изменений 56
4 Анализ растворимых белков E.coli методом двумерного электрофореза 58
5 Поиск белков, потенциально реагирующих на ЭМИ СВЧ 59
6 Регулон теплового шока не участвует в адаптации клеток к ЭМИ СВЧ
75
7 Действие ЭМИ СВЧ сопровождается типичными для перехода к стационарному росту изменениями генной экспрессии 80
8 Влияние ЭМИ СВЧ на экспрессию генов, кодирующих белки транспорта и утилизации ионов железа 86
Заключение 90
Выводы 94
Список цитированной литературы 95
Благодарности
- Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты
- Механизм экспрессии а-субъединицы РНК-полимеразы и NusA.
- Двумерный электрофорез суммарного лизата белков в равновесной системе
- Влияние ЭМИ СВЧ на спектр растворимых белков, содержащихся в суммарном лизате клеток E.coli
Введение к работе
Неотъемлемой частью среды обитания любого организма является Магнитное поле (МП) Земли и электромагнитное излучение (ЭМИ) Солнца. Вариации их интенсивности, обусловленные внешними или техногенными факторами, вызывают адаптивную реакцию практически у всех живых организмов. Этим обусловлен интерес к детальному изучению механизмов биотрошюго влияния электромагнитных излучений. Их воздействие на биологические объекты зависит от частоты и интенсивности, наличия и типа модуляции, от поляризации излучения и режима экспозиции. Предложено несколько гипотез о физико-химических механизмах рецепции ЭМИ крайне высоких частот (более ЗОГГц с длиной волны меньше 10мм). Доминирующей концепцией является представление об их резонансном поглощении биологическими системами. Однако излучения низкой интенсивности, более длинноволнового диапазона, влияющие на многие биологические процессы, имеют энергию кванта меньше чем 10 эВ. Это значительно ниже энергии тепловых колебаний (кТ=10 2эВ). Поэтому механизм их влияния на клетки, в целом, остается малопонятным, хотя и сама «проблема кТ» также требует, по-видимому, более строгой формулировки [Бинги и др. 2006]. Так, помимо молекулярных мишеней, в клетках могут присутствовать относительно крупные частицы с макроскопическим магнитным моментом, а взаимодействие биологического объекта с электромагнитным излучением может развиваться в отсутствие теплового равновесия и иметь многоквантовый характер [Бинги и др. 2006]. Очевидно, что для поиска первичных мишеней электромагнитного воздействия нетепловой природы на клеточном и молекулярном уровнях проще всего использовать одноклеточные микроорганизмы, реакция которых на МП и ЭМИ не может быть опосредована наиболее чувствительными к действию ЭМИ нервной и эндокринной системами [Гапеев, Чемерис 2007]. Поэтому в качестве объектов исследования в данной работе была использована кишечная палочка (Escherichia coli, E.coli), которая является одним из наиболее изученных биологических объектов.
Влияние МП и ЭМИ на метаболизм E.coli изучается с шестидесятых годов прошлого века, но полученные данные во многом противоречивы. Так, Веббом и Доддсом [1968] было установлено, что МП с частотой 136Гц и интенсивностью 7мкВт ингибирует деление клеток E.coli, не вызывая их гибели. Снижение скорости роста бактерий в МП было также зарегистрировано в работах [Strasak et al. 1998; 2002 (50Гц, 2.7-21.5mT); Ramon et al. 1981 (60 и 600Гц, 2mT) и Li et al. 2004 (пульсирующее МП, 62кГц, 160mT)]. Однако по данным [Nascimento et al., 2003], МП (60Гц, интенсивность 5G), наоборот, приводило к повышению метаболизма глюкозы и, следовательно, к активации роста клеток. Аналогичный эффект под действием ЭМИ СВЧ (3,07 ГГц) был обнаружен в работе [Anderstam et al., 1983]. Таким образом, данные о влиянии МП и ЭМИ на такую интегральную характеристику клеточной популяции как скорость роста неоднозначны.
Было установлено, что действие МП (5,2-6,1Т) на стационарно растущие клетки приводит к индукции в них транскрипционной активности, обусловленной а -субъединицей РНК-полимеразы [Tsuchiya et al., 1999]. Это согласуется с данными [Shcheglov et al 2002] показавшими, что экспозиция стационарно растущих клеток ЭМИ КВЧ (51.75ГГц, 10 мкВт/см ) приводит к уменьшению компактности нуклеоида и указывает на участие в адаптивном ответе о , которая отвечает за экспрессию генов в различных стрессовых условиях. Независимо было установлено, что под действием МП (60Гц, 1.1 шТ) увеличивается биосинтез еще одной а-субъединицы РНК-полимеразы - а [Cairo et al., 1998], которая отвечает за экспрессию генома в условиях температурного шока. В соответствии с этим, под действием МП (50Гц, 0.4-1.2шТ) был зарегистрирован повышенный синтез шаперонов DnaK, DnaJ и GroEL [Chow, Tung 2000; Li, Chow 2001;
Del Re et al. 2006], продукция которых на транскрипционном уровне зависит от а . Совместно с предыдущими данными это указывает на то, что МП воспринимается клеткой как стрессовый фактор, но методом двумерного электрофореза клеточных белков не удалось зарегистрировать индукции МП (5-ЮОГц, 10-14тТ) биосинтеза DnaK, а также таких белков, как RecA и UspA, которые продуцируются клеткой в различных неблагоприятных условиях роста [Nakasono, Saiki 2000]. Поэтому авторы последней публикации сделали вывод, что МП не является стрессовым фактором для E.coli.
Таким образом, на сегодняшний день опубликовано довольно много работ, посвященных изучению реакции клеток E.coli на электромагнитные излучения. Имеющиеся данные фрагментарны, в большинстве случаев получены на клетках, подвергнутых действию МП, и, зачастую, противоречивы. В какой-то степени это отражает общую ситуацию в мапштобиологии, которая находится на стадии накопления и осмысления данных, необходимых для последующего концептуального моделирования. Очевидно, что наиболее плодотворными на данном этапе могут оказаться новые подходы. Поэтому в данной работе для поиска регуляторной системы клетки, специфически реагирующей на ЭМИ СВЧ, был использован метод индивидуального тестирования генной экспрессии с помощью PCR в реальном времени.
Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты
Большинство радиотехнических средств, которые используются в радиолокации, радионавигации, спутниковой связи, радиорелейной связи и в быту (СВЧ-печи, сотовые телефоны) работают в сантиметровом диапазоне (3-30 ГГц) [Шеин, 2001]. Энергия кванта таких излучений (hv) составляет 1,2x10 5 - 1,2x10 4, что тоже гораздо ниже кТ тепловых колебаний, поэтому электромагнитное излучение в этом частотном диапазоне не должно приводить к существенным тепловым эффектам. Суммарная плотность потока мощности электромагнитного излучения Солнца на поверхности Земли составляет 6x10 мкВт/см . Только небольшая часть этого излучения приходится на высокочастотный диапазон (-10" мкВт/см ). Техногенные источники электромагнитных излучений, работающие в СВЧ- и КВЧ- диапазонах (например ретрансляционные станции), создают на поверхности Земли плотность потока энергии мощностью 1-Ю мкВт/см [Алешенков и др. 1997]. То есть, используемое нами излучение (1мкВт/см ) по мощности сопоставимо с техногенным фоном, но гораздо ниже предельно допустимого уровня, разрешенного для бытовых приборов. Так, на территории России и Белоруссии плотность потока энергии для сотовых телефонов не должна превышать .100 мкВт/см , а санитарные нормы для рабочих помещений ограничивают ППЭ ЮмкВт/см2 (Скогорев 2004). На территории США и некоторых европейских стран предельно допустимый уровень выше, а сотовые телефоны имеют максимальную выходную мощность в границах 0,125-1Вт (используемые частоты 0.453-1.8 ГГц). Наибольшей выходной мощностью характеризуются телефоны стандарта NMT-450 (номинальная мощность около 1Вт), меньшей - GSM-900 (0,25 Вт) и самой меньшей - стандарта GSM-1800 (0,125Вт).
Понятно, что воздействовать на биологические объекты может только такое электромагнитное излучение, которое ими поглощается. Эффективность поглощения зависит от энергии кванта, а также от соотношения длины волны (к) и размеров облучаемого объекта. Соизмеримость линейных размеров многих биологических объектов с длиной волны в диапазоне СВЧ указывает на возможность его резонансного поглощения этими объектами [Давыдов и др., 1984]. Поэтому ЭМИ СВЧ является, по-видимому, одним из наиболее длинноволновых излучений, способных непосредственно влиять на многоклеточные организмы. Важно, что наиболее эффективно энергия ЭМИ поглощается тканями с большим количеством воды [Пресман, 1968], причем под действием излучения свойства воды могут изменяться [Fesenko Е.Е., Gluvstein A.Ya., 1995; Лехтлаан-Тыниссон и др. 2004]. Поэтому в экспериментах с бактериями можно было ожидать разное влияние ЭМИ на клетки, растущие на агаре и в жидкой среде.
В настоящее время не вызывает сомнения, что высокочастотное электромагнитное излучение оказывает воздействие на биологические объекты практически любого уровня организации. Основная масса данных, тем не менее, получена с использованием многоклеточных организмов в качестве модельных объектов. Именно они выявили такие важные закономерности, как немонотонный характер частотных и амплитудных зависимостей, способность объяснить которые является главным тестовым критерием при оценке реалистичности теоретических моделей (см. выше). Немонотонный характер зависимости биологического эффекта от мощности излучения был установлен в исследованиях механизмов биотропного влияния ЭМИ СВЧ, выполненных Исмаиловым [Исмаилов, 1985], Пресманом [Пресман, 1968] и Холодовым [Холодов, 1991]. Роль амплитудной и частотной модуляции ЭМИ СВЧ при формировании биологического эффекта установлена Adey [Adey et al, 1982; Гапеев и др. 1993]. Оба эти факта означают, что биологическое действие даже высокочастотных ЭМИ нельзя рассматривать только с позиции энергетических эффектов [Девятков и др, 1983]. Было высказано предположение, что биологические объекты имеют специальные системы рецепции ЭМИ, но трудно представить, что для широкого частотного диапазона имеются рецепторы, способные резонансно поглотить энергию и стимулировать специфический ответ. Поэтому была выдвинута гипотеза о наличии универсального посредника. Роль такого посредника может играть вода, выполняющая особую функцию в биологических системах [Fesenko et al., 1995]. Учитывая наличие дипольного момента у молекулы воды и способность формирования кластеров даже в чистом виде, такая возможность представляется вполне разумной. Изменением свойств структурированной воды, окружающей биологические макромолекулы, в принципе, можно объяснить и влияние излучений на молекулярные процессы. Однако моделирование такого типа влияния ЭМИ из-за слишком большого числа степеней свободы пока не может быть полноценным. Более конструктивными на данный момент являются приведенные в предыдущем разделе модели, базирующиеся на влиянии МП и ЭМИ на движение заряженных частиц в разном окружении и предполагающие многократное увеличение числа резонансных частот за счет взаимодействия со стенками белковой глобулы или МП.
Механизм экспрессии а-субъединицы РНК-полимеразы и NusA.
По-видимому, самыми удивительными являются данные о том, что в экспонированных МП клетках накапливаются а-субъединицы РНК-полимеразы и белок регуляции терминации транскрипции NusA [Goodman et al., 1994] (см. выше). Ген а-субъединицы гроА находится в генетическом локусе, содержащем подряд 28 генов, большинство из которых кодируют рибосомные белки: P,psJ - rpsJ(S\0) - rplC(L3) - rplD(L4) - rplW(L23) - rplB(L2) - rpsS(S\9) - rplV(L22) -rpsC(S23) - rplP(U6) - rpmC(L29) - rpsQ(S\7) - Pspc - rplN(U4) - rplX(L24) - rplE(U5) -rpsN(SU) - r/w#(S8) - rplF(L\&) - rplR(US) - rpsE(S5) - rpmD(L30) - rplO(U5) -prlA (возможная субъединица транслоказы) - rpmJ(L36) - Рф()Л - rpsM(S\3) - rpsK(S\\) -rpsD(S4) - rooA (а субъединица РНК полимеразы) - rplQ(L17). Ближайший к гену гроА промотор находится перед геном грхМ, кодирующим белок S13 большой субчастицы рибосомы (База данных Regulon). Это самый сильный промотор в генетическом локусе, так как его элементы -35, -10 близки к консенсусным последовательностям (TTGACA и ТАТААТ), а выше элемента -35 есть хорошо выраженный UP-элемент (отмечен скобкой):
Пока не обнаружена возможность белковой регуляции этого промотора, но на 5 -конце РНК, полицистронно с него транскрибируемой, возможно образование трех стабильных шпилек (факт формирования шпилек указан в базе данных Regulon, а трехмерная структура получена с помощью программы RNA Structure [Mathews et al. 2004]): Формирование таких структур в РНК-продукте часто приводит к паузам или замедлению транскрипции, которые могут быть усилены белком NusA [Man et al. 2000]. Т.е. транскрипция гена а-субъединицы может зависеть от NusA. За геном rpmJ нет строгого терминатора транскрипции. Это значит, что возможен сквозной синтез полицистронной РНК с промотора Pspc. Возможность белковой регуляции для этого промотора также не обнаружена, но на 5 -конце этой длинной РНК также могут образовываться стабильные вторичные структуры, аналогичные показанным выше (Regulon). Кроме того, между стартовой точкой транскрипции и элементом -10 этого промотора есть G/C-богатый участок (дискриминатор строгого контроля), наличие которого свидетельствует о зависимости транскрипции от ppGpp: За геном rpsQ терминатор есть, поэтому сквозное прочитывание с промотора Рф5., по-видимому, маловероятно. Таким образом, имеющиеся в литературе и информационных базах данные свидетельствуют о том, что синтез гро А -мРНК зависит от доступности источников питания (эффектор ppGpp) и может контролироваться NusA. Но, так как промоторы, содержащие дискриминатор строгого контроля, ингибируются, а не активируются ppGpp, механизм с участием этого эффектора не может объяснить увеличение синтеза а-субъединицы при облучении. Ген NusA является третьим геном в опероне: Ртеи - РПША - /ие/У(тРНК) - Pyhbc -уЬЬС (неизвестный белок) - пшА - infB (фактор инициации трансляции) - rbfA (фактор взаимодействия с рибосомой) - truB (тРНК-синтетаза) - rpsO (S15) -рпр (полинуклеотидфосфорилаза). Подобно гро А, он может экспрессироваться с двух сильных промоторов, расположенных перед геном metY, и промотора, находящегося перед геном yhbC. Оба промотора, находящиеся перед геном metY, содержат дискриминатор строгого контроля и должны ингибироваться в неблагоприятных условиях. Синтез РНК с этих промоторов зависит от активатора Fis (регулирует экспрессию большинства генов, кодирующих рРНК, тРНК и рибосомные белки), глобального регулятора cAMP-CRP и репрессора ArgR (Regulon). Так же, как и в случае гроА, на 5 -конце полицистронной РНК возможно образование шпилечных структур, т.е. NusA может влиять на синтез своей мРНК. Функциональная роль NusA в настоящее время очень интенсивно изучается [обзор Richardson and Greenblatt 1996]. Этот белок взаимодействует с коровой частью РНК-полимеразы вскоре после инициации транскрипции и способствует замедлению синтеза РНК или вообще его останавливает на участках, формирующих вторичные структуры. Опосредованная NusA терминация зарегистрирована, например, в лидерной последовательности полицистронной мРНК, транскрибируемой с промотора P,pSj [Stelzl et al. 2003]. Принято считать, что NusA стабилизирует шпильки в РНК. Именно это становится причиной остановки синтеза, что особенно важно на настоящих терминаторах. Сам по себе NusA с РНК не связывается. Взаимодействие с РНК-полимеразой сообщает ему эту способность. Несмотря на то, что зарегистрированы кросс-сшивки NusA с Р- и Р -субъединицами РНК-полимеразы, наиболее прочные комплексы образуются ДНК-связывающим доменом а-субъединицы [Liu et al. 1996]. Таким образом, увеличение концентрации NusA в клетках в большинстве случаев должно сопровождаться уменьшением числа мРНК, формирующих стабильные шпилечные структуры, в том числе rpoA-мРНК, хотя в некоторых случаях NusA может играть прямо противоположную роль антитерминатора. Антитерминация с участием NusA зарегистрирована для аттенюаторного участка, находящегося в терминаторной области tR2 бактериофага X. Синтезированная с этого участка РНК формирует шпилечные структуры, названные «nut site». С ними взаимодействуют NusA (могут также NusB, NusG и S10), РНК-полимераза и фаговый белок N. Образующийся комплекс способен к сквозному прочитыванию многих генов, не останавливая транскрипцию на встречающихся терминаторах [Mogridge et al. 1995; Mah et al. 2000]. Концентрации NusA и потенциально зависящей от него сс-субъединицы РНК-полимеразы, следовательно, совсем не обязательно должны изменяться в противофазе. Тем не менее, восприятие данных об активации магнитным полем синтеза ос-субъединицы осложняет тот факт, что авторами не было обнаружено аналогичного увеличения в продукции белков S13, Sll, S4 и L17 [Goodman et al., 1994], мРНК которых должны синтезироваться совместно с гроА-мРНК.. Это значит, что увеличение экспрессии а-субъединицы РНК-полимеразы под действием пульсирующего МП можно объяснить либо специфической стабилизацией гроА-и?ЯК, либо наличием дополнительного регуляторного участка непосредственно перед геном гроА, который может быть промотором, специфически активируемым полем, или NusA-зависимым аттенюатором.
Двумерный электрофорез суммарного лизата белков в равновесной системе
Клетки выращивали так же, как описано выше. После осаждения клеток и удаления среды осадок растворяли в 500 мкл лизирующего буфера А. В раствор добавляли 10 мкл ЮОмМ PMSF в изопропаноле и 13.4мкл лизоцима (10мг/мл). Смесь инкубировали 20 минут на льду. Далее клетки подвергали 4-5 сериям ультразвуковой обработки, после чего центрифугировали 15 минут при ЮОООоб/мин. Супернатант собирали в 1.5мл пробирки, добавляли к нему 1.5 объема насыщенного раствора сульфата аммония и оставляли при 4С до нанесения на гель.
Изоэлектрофокусировку (первое направление) проводили в стеклянных трубках (длина - 14см, внутренний диаметр - 1.5мм). Трубки перед использованием вымачивали в растворе, содержащем 60%» спирта и 14.8%» соляной кислоты. После вымачивания трубки тщательно отмывали в бидистиллированной воде и высушивали. Сухие трубки заклеивали с одной стороны пленкой Parafilm (Laboratory film, США) и заполняли гелем для изоэлектрофокусировки. Для формирования ровной поверхности на гель наслаивали Юмкл воды и оставляли при комнатной температуре на 40 минут. После полимеризации воду удаляли с поверхности геля, а на ее место наносили Юмкл лизирующего буфера и Юмкл покрывающего буфера. Трубки помещали в камеру для изоэлектрофокусировки и создавали градиентное распределение амфолинов под напряжением:
Перед нанесением анализируемых образцов убирали покрывающий буфер. Затем наслаивали суммарный лизат клеток (20мкл) и новую порцию покрывающего буфера (Юмкл). Изоэлектрофокусировку проводили 19 часов при 400В/ 0.6мА. Затем гель извлекали из трубок, помещали в буфер для уравновешивания на 3-5 минут и переносили в камеру для разделения белков по молекулярному весу. Гель для SDS-фореза готовили заранее. Так же, как и в случае одномерного электрофореза использовали 10-15% разделяющий и 4% концентрирующий полиакриламидпые гели. Извлеченный из трубки гель «сшивали» с концентрирующим 1% агарозой, приготовленной на буфере для уравновешивания. После полимеризации агарозы пластины помещали в камеру для электрофореза и проводили разделение пептидов при 70В/20мА до входа фронта в разделяющий гель. После этого напряжение увеличивали до 140В.
Окрашивание гелей проводили 0.25%» раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в смеси вода:этанол:уксусная кислота (6:4:1), или окрашивали нитратом серебра [Oakley et al., 1980] (см. выше). Суммарный клеточный лизат получали аналогично тому, как указано в пункте 8 и разделяли в 10%» полиакриламидном геле, как указано в пункте 9. Перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, Швеция) осуществляли в камере для трансблота, заполненной Tris-глициновым буфером, в течение 2 часов при 350мА. Затем фильтр с перенесенными белками помещали в блокирующий буфер на 2 часа (37С) при постоянном перемешивании. После блокировки наносили моноклональные кроличьи антитела к белку теплового шока мыши БТШ70 (клон SPA-812, StressGen Biotechnologies, индуцибельная форма). Предварительно было установлено, что благодаря консервативности БТШ70, моноклональные антитела к белку теплового шока мыши связываются с бактериальным гомологом этого белка. Мембрану инкубировали в растворе антител (1 час, 37С) при постоянном перемешивании, помещали в раствор антивидовых антител IgG, коньюгированных с биотипом (козьи поликлональные антикроличьи антитела с биотипом (StressGen Biotechnologies), 1:5000 в Na-фосфатпом буфере), и инкубировали при тех же условиях 1 час. Для визуализации специфического преципитата к раствору добавляли комплекс, содержащий стрептавидин и пероксидазу хрена. Для определения содержания БТШ использовали систему ECL, содержащую люминол, дающий сигнал хемилюминесценции при распаде пероксида (Amersham, Швеция). Каждый этап сопровождался многократным промыванием пластины Na-фосфатным буфером.
Три разных способа были опробованы для выделения тотальной РНК из клеток E.coli. На стадии оптимизации реакций для количественной PCR (подбор концентрации праймеров и матрицы, а также оптимальной температуры отжига) использовали фенольный метод. Основные результаты количественного анализа были получены на препаратах РНК, выделенных с использованием кита и колонок Invitrogen. Этот метод позволяет получить стандартное количество РНК, практически не требующее выравнивания концентраций в контрольном и опытном образцах. На последнем этапе использовали методику выделения РНК, разработанную для Грамм-отрицательных бактерий. Этот метод позволяет получить большое количество РНК и достаточно хорошо воспроизводим.
Фенольный метод: 20мл суспензии клеток E.coli осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сливали, а осадок растворяли в ЗООмкл лизирующего раствора, нагретого до 65С. Затем добавляли 4мл насыщенного водой кислого фенола, также нагретого до 65С, и инкубировали при этой же температуре в течение 5 минут, постоянно помешивая. Водную фазу отделяли от фенольной центрифугированием при ЮОООоб/мин в течение 10 минут при 20С и собирали. К ней добавляли 4мл фенола и повторяли процедуру с перемешиванием (в течение 10 минут) и центрифугированием. К собранной после этого водной фракции добавляли 4мл смеси фенол:хлороформ (1:1 v/v), тщательно перемешивали и центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин (20С). Затем, РНК осаждали 2.5-кратным объемом 96% этанола
Влияние ЭМИ СВЧ на спектр растворимых белков, содержащихся в суммарном лизате клеток E.coli
Несмотря на слабо выраженный ответ на ЭМИ СВЧ у штамма E.coli W3110, его бимодальность можно было рассматривать как косвенное свидетельство «включения» ЭМИ СВЧ какого-то адаптационного механизма к неблагоприятному (так как снижается скорость роста на ранней логорифмической фазе), но не деструктивному (потому что скорость роста восстанавливается) воздействию. Для объяснения данных, полученных для E.coli W12, необходимости в таком предположении не было. Их можно было интерпретировать как простую активацию ферментативной активности в клетках, как, например, это было показано в работе [Dutta et al. 1994] для активности эукариотического фермента енолазы, экспрессируемого в клетках E.coli под действием ЭМИ (147МГц, амплитудная модуляция 16Гц).
Если справедливо первое предположение, то ЭМИ СВЧ должно вызывать какие-либо специфические изменения в спектре белков, содержащихся в клетках E.coli W3110, причем эти изменения должны проявляться уже на стадии угнетения роста. Поэтому был получен суммарный лизат контрольных клеток и клеток, подвергнутых действию ЭМИ в течение 120, 180, 240 и 300 минут. В этих условиях наблюдалось небольшое подавление роста (Рис. 4А). Так же, как и в предыдущей серии экспериментов, клетки растили в среде LB в пластиковых флаконах. Сравнение спектра растворимых белков, полученных из клеток после экспозиции ЭМИ СВЧ в течение 180 и 240 минут, с контрольными образцами показано на Рис. 5. Для трех полипептидов с молекулярной массой (MW) порядка 90kDa, 35kDa и 31kDa уже во время угнетенного роста наблюдается некоторое увеличение во внутриклеточном содержании. Менее выраженная, но такая же тенденция была обнаружена для белков с MW -70Ша и 38kDa.
Таким образом, экспозиция клеток E.coli ЭМИ СВЧ, не приводя к глобальным перестройкам клеточного метаболизма, влияла на спектр присутствующих в клетке белков. Это согласовалось с возможностью существования у кишечной палочки системы адаптивного ответа на электромагнитное излучение и свидетельствовало о целесообразности дальнейших исследований.
Несмотря на то, что описанные выше эксперименты были выполнены в условиях длительного воздействия ЭМИ СВЧ, наблюдаемые изменения были выражены очень слабо. Отчасти это могло быть обусловлено использованным способом экспозиции, при котором часть энергии электромагнитной волны могла быть поглощена раствором или отражена пластиковой стенкой флакона. Поэтому была поставлена серия экспериментов, в которых действию ЭМИ СВЧ подвергали колонии клеток, растущих на агаровой среде в открытых чашках Петри или чашках, закрытых только тонкой пленкой Parafilm. Так же, как и в предыдущих случаях, контрольные образцы были экранированы, а опытные находились 5, 20, 60 и 120 мин. в зоне действия ЭМИ (более длительное время эксперимента приводило к высыханию поверхностного слоя агара). Сразу после этого клетки смывали с геля и получали клеточный лизат, который анализировали SDS -электрофорезом. Несмотря на то, что необходимость смыва колоний с геля затрудняет получение одинаковых по объему и концентрации препаратов и загрязняет образцы, удалось получить приемлемые для прямого сравнения электрофореграммы.
Наиболее выраженные различия для интактных и облученных клеток были зарегистрированы после 60 минутной экспозиции. Они свидетельствовали об интенсификации полосы, соответствующей полипептиду с молекулярной массой 94kDa, изменения в уровне внутриклеточного содержания которого уже наблюдали раньше. Большое количество солей в образцах не позволило получить хорошее разрешение полос в других областях геля, но стало совершенно ясным, что прямая экспозиция клеток воздействию ЭМИ не приводит к усилению сигнала. Это значит, что стенка флакона не является существенным препятствием для электромагнитной волны. Поэтому во всех последующих экспериментах работали с клетками, растущими в жидкой среде. Кроме этого, так как влияние ЭМИ СВЧ на спектр растворимых белков в клетках, находящихся на стационарной фазе роста, во всех экспериментах оказался аналогичным показанному на Рис. 5, для всех последующих опытов клетки заранее выращивали до стационарной фазы (16 часов роста) в одном флаконе. Затем суспензию делили на две одинаковые порции, одну из которых подвергали действию ЭМИ, а другуопомещали в соседнюю камеру и использовали в качестве контроля. Это позволило нам избежать неоднозначности результатов из-за разной скорости роста бактерий во время экспоненциальной фазы и обеспечить стандартные условия во всех экспериментах.
Полосы, соответствующие MW 70kDa и 32kDa (Рис. 5.), в принципе, могли относиться к белкам теплового шока шаперону DnaK (68.9kDa) и с (32.3kDa), индукция которых МП была зарегистрирована ранее [Chow Tung, 2000; Li, Chow, 2001; Del Re et al., 2006; Cairo et al., 1998]. Это предполагало возможность прямой индукции ЭМИ СВЧ регулона теплового шока. Для оценки такой вероятности в следующей серии опытов было исследовано влияние ЭМИ СВЧ на спектр белков, синтезируемых в клетках E.coli W3110 и E.coli W12 в условиях роста при пониженной температуре (30С), а время экспозиции варьировали от 5 до ПО минут. Скорость роста бактерий в этих условиях немного снижалась, но выход на стационарную фазу наблюдался приблизительно при тех же значениях оптической плотности, что и при 37С. В таких условиях для теплового шока температура, по крайней мере локально, должна повыситься на 12 градусов, что невероятно. перечисленных выше белковых полос было обнаружено уже после 5-20-минутной экспозиции. Таким образом, в том случае, если повышенное содержание полипептидов с молекулярной массой 70kDa и 32kDa, действительно, обусловлено увеличенной продукцией в клетках DnaK и о , их биосинтез активируется даже в условиях, максимально исключающих включение регулона теплового шока за счет нагревания (обычно 42 С). Т.е. полученные данные свидетельствуют против того, что зарегистрированные изменения опосредованы тепловым воздействием ЭМИ СВЧ. Полипептиды, содержание которых изменялось под действием ЭМИ, оказалось одинаковым для штаммов Е.соН W12 и E.coli W3110 (сравн. Рис. 5 и 6), поэтому в дальнейшем работали только со штаммом W3110.
Похожие диссертации на Влияние ЭМИ СВЧ на регуляторные системы Escherichia coli
