Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы... 10
Точки разрывов при хромосомных перестройках 10
Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания 10
Группы химерных белков 12
Кластеры точек разрыва 15
Механизм рекомбинации 18
Структура белка и кажущаяся кластеризация точек разрыва 20
Роль ядерной архитектуры в образовании хромосомных перестроек 25
Структура и механизм действия топоизомераз II типа 29
Основные свойства топоизомераз II 30
Структура белка 31
Механизм действия 34
Клеточная роль топоизомеразы II 36
Репликация 36
Транскрипция 38
Конденсация хромосом 39
Рекомбинация 40
Ингибирование топоизмеразы II 41
Постановка задачи и методические подходы 52
Материалы и методы 55
Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. coli 55
Трансформация бактериальных клеток 55
Манипуляции с плазмидной ДНК 56
Полимеразная цепная реакция 56
Выделениебакмидной ДНК из бактерий 56
Положительная селекция клонов, содержащих KIL 57
Декатенация плазмид 58
Индукция незаконной рекомбинации in vitro 59
Трансфекция 59
Выделение плазмидной ДНК из эукариотических клеток 60
Радиоактивное мечение олигонуклеотидов и гибридизация их с ДНК 61
Обработка ядер микрококковой нуклеазой и Саузерн-гибридизация 63
Конструирование плазмид 64
Результаты исследования и их обсуждение 67
Создание модельной системы для количественной оценки частоты незаконной
рекомбинации 67
Проверка функционирования гена KIL 71
Декатенирование модельных конструктов 72.
Количественная оценка частоты незаконной рекомбинации 73
Индукция незаконной рекомбинации in vitro 75
Эксперименты in vivo 76
Эписомная репликация модельных плазмид в эукариотических клетках 76
Индукция незаконной рекомбинации in vivo и влияние ингибиторов 78
Предположительная модель действия топоизомеразы II 80
Картирование участков разрыва в рекомбинантных плазмидах 81
Нуклеосомный статус трансфецированных модельных плазмид 84
Выводы 87
Список литературы. 88
Благодарности... 109
- Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания
- Роль ядерной архитектуры в образовании хромосомных перестроек
- Радиоактивное мечение олигонуклеотидов и гибридизация их с ДНК
- Эписомная репликация модельных плазмид в эукариотических клетках
Введение к работе
За последние годы появилось много данных, свидетельствующих о том, что противоопухолевая химиотерапия с использованием агентов, специфичных в отношении топоизомеразы II, очень часто вызывает вторичные лейкозы, для которых характерны определенные хромосомные перестройки [1-2].
Топоизомераза II относится к семейству ДНК-топоизомераз - ферментов-регуляторов топологического состояния ДНК [3-4]. Этот фермент способен снимать топологические напряжения в ковалентно-замкнутых молекулах ДНК (или в петельных доменах в случае эукариотических геномов) и разделять катенаны путём внесения временных двуцепочечных разрывов в ДНК. В определенных условиях (в частности, при подавлении лигирующей активности фермента) такие разрывы стабилизируются, что может привести к хромосомным аберрациям [5]. Клетка обладает двумя основными механизмами репарации двуцепочечных разрывов: один из них основан на гомологичной рекомбинации (homologous, recombination, HR), другой — на негомологичном соединении концов ДНК (nonhomologous end joining, NHEJ). Для гомологичной рекомбинации необходимы протяженные области гомологии между репарируемыми участками, при этом возможно полное восстановление последовательности ДНК. Белковый комплекс, осуществляющий NHEJ, соединяет тупые или липкие концы ДНК даже при полном отсутствии гомологии. Считается, что этот комплекс осуществляет процессинг концов двуцепочечных разрывов, который может вести к делеции, дупликации или инверсии фрагментов коротких ДНК [5]. При наличии большого числа двунитевых
разрывов NHEJ часто приводит к ошибочному соединению концов цепей ДНК, представляющих разные области генома
Топоизомераза II, по-видимому, способна осуществлять негомологичную (или незаконную) рекомбинацию in vitro [6-7]. В настоящее время рассматривается два механизма возникновения рекомбинаций при участии ДНК-топоизомеразы П. В соответствии с первой моделью (модель «субъединичного обмена») топоизомераза II и вносит двуцепочечные разрывы в ДНК, и «репарирует» их за счет своей лигазной активности [8-9]. При этом не исключён обмен субъединиц между молекулами топоизомеразы II, связанными с разными участками хромосомы (хромосом). Это приведёт к незаконной рекомбинации, проявлением которой могут быть те или иные хромосомные перестройки. Согласно альтернативной, «индукционной» модели, топоизомераза II только вносит двуцепочечные разрывы, а их репарация происходит за счет других клеточных систем [10]. Используемые в качестве противораковых средств ингибиторы топоизомеразы II (доксорубицин, амсакрин, тенипозид, этопозид) блокируют ее религирующую активность и оставляют ДНК в состоянии двуцепочечного разрыва, скрытого молекулой фермента [11]. Такие разрывы, по-видимому, репарируются путем NHEJ [12].' Достоверно показано, что этот путь репарации часто приводит к неправильному соединению концов ДНК (особенно в тех случаях, когда разрывов много).
Таким образом, топоизомераза II представляет большой интерес и с теоретической, и с практической точки зрения. Механизм действия и клеточные функции этого фермента до конца неясны. Кроме того, топоизомераза II представляет большой интерес как мишень противоопухолевых лекарств. Все это определяет большую важность дальнейшего изучения топоизомеразы II.
Настоящая работа посвящена изучению возможности участия топоизомеразы II в незаконной рекомбинации in vitro и in vivo и определению механизма незаконной рекомбинации, опосредованной топоизомеразой II в условиях ингибирования ее противоопухолевыми агентами.
Обзор литературы
Хромосомные перестройки, наблюдаемые при определенных видах опухолей, происходят не случайным образом. Точки разрывов хромосом при таких перестройках сосредоточены в определенных участках генома. В настоящем обзоре представлены данные по изучению положения точек разрывов и возможные механизмы возникновения хромосомных перестроек. Кроме того, рассмотрены структура, свойства и клеточная роль топоизомераз II типа.
Точки разрывов при хромосомных перестройках
Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания
Для многих опухолевых клеток характерно наличие тех или иных хромосомных перестроек. [1], [13]. Во многих случаях прослеживается четкая корреляция между наличием определенной хромосомной перестройки и типом опухоли, что особенно важно для клинической диагностики на ранних стадиях болезни[13] [14]. Тем не менее, до сих пор четко не доказано, что хромосомные перестройки являются непосредственной причиной развития опухолей (см. обзор [2]). В результате перестроек часто образуются слитые гены, продуктом экспрессии которых являются химерные белки. С практической точки зрения, существование таких генов позволяет использовать для диагностики этих опухолей быстрый и простой метод ОТ-ГЩР. Анализ структуры химерных белков позволяет сделать ряд предположений о возможной роли этих белков в развитии опухолей.
В таблице 1 приведены данные о связи ряда хромосомных перестроек и вовлеченных в них генов со злокачественными опухолями [15].
Заболевание
Ген,
перестройка
Хроническая миелоидная лейкемия
Острая миелоидная лейкемия Миксоидная липосаркома Ангиоматоидная фиброзная гистосаркома Фолликулярная лимфома
Промиелоцитная лейкемия
Саркома Юинга
Папиллярная карцинома
Миелодиспластический синдром
Острая нелимфоцитная лейкемия
Т-клеточная острая лимфобластная
лейкемия
Острые лейкемии
Т-клеточная острая лимфобластная
лейкемия, острая нелимфоцитная
лейкемия
Острая нелимфоцитная лейкемия
вовлеченный в перестройку
ABL1 t(9;12)(q34;pl3)
АВЫ t(9;22)(q34;qll)
CBFB inv(16)(pl3;q22)
TLS t(12;16)(ql3;pll)
t(8;21)(q24;q22)
Таблица 1. Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания
Группы химерных белков
В настоящее время известно более двухсот генов, которые могут участвовать в образовании химерных белков [1]. Во многих случаях существует четкая корреляция между экспрессией слитых генов, приводящей к формированию химерных белков, и развитием опухолей и лейкозов. Так, для некоторых типов лейкозов характерно наличие хромосомных перестроек, затрагивающих ген МЫ, кодирующий фактор транскрипции; другой яркий пример — саркома Юинга, которая характеризуется наличием хромосомных перестроек, затрагивающих ген EWS, также кодирующий некий фактор транскрипции. Образующиеся в результате перестройки химерные гены могут оказаться функционально активными: они экспрессируют химерные белки, сочетающие в себе домены двух гетерологичных белков, в норме не взаимодействующих в клетке. Кроме того, результатом транслокации может быть попадание кодирующей последовательности гена под контроль регуляторных элементов совершенно другого гена. При этом может происходить изменение профиля экспрессии ткане- и времяспецифичных факторов. Как правило, изменение характера экспрессии или возникновение новой (химерной) кодирующей последовательности происходит с участниками регуляторных каскадов: транскрипционными факторами ([16-17]), или протеинкиназами ([18]), которые участвуют в управлении клеточным циклом, дифференциррвкой или апоптозом. Дополнительные примеры можно найти в недавно опубликованных обзорах ([19-20]).
Многие злокачественные заболевания можно охарактеризовать определенной перестройкой, которая каждый раз возникает практически в одном и том же месте. С другой стороны, известные перестройки, затрагивающие
конкретные гены, могут служить маркером развития конкретной опухоли. Часто один и тот же ген формирует химеры с разными партнерами, образуя т.н. «семейства химерных белков». Примером образующего такое «семейство» гена является EWS. Его семейство включает несколько генов, с каждым из которых EWS образует химерный белок, характерный для того или иного заболевания. Так,
Рисунок 1. Примеры «химерных семейств».
ETV6 (слева) и RET (справа) и их партнеры по транслокациям. Прямоугольниками обозначены отдельные гены (серым цветом выделены гены, кодирующие транскрипционные факторы). Линии, соединяющие прямоугольники, указывают на существование транслокаций
между данными генами.
например, в клетках саркомы Юинга присутствуют белки, являющиеся продуктом экспрессии химерных генов, возникающих в результате слияния EWS с FLU, FEV, CHOP, ERG, ETV1. В клетках ряда других сарком обнаружен белок, кодируемый химерным геном, возникшим в результате слияния генов EWS и ETV4. Некоторые семейства химерных генов показаны на рис. 1. Как уже упоминалось, большинство генов, образующих эти семейства, кодируют транскрипционные факторы или
протеинкиназы [21]. Так, ген RET кодирует рецепторную тирозинкиназу, часто перестроенную в тироидных опухолях (см. обзор [22]).
В пределах семейств могут наблюдаться сложные отношения между членами. Химерные гены, возникающие в результате слияния одного и того же гена с разными партнерами, могут быть характерны для опухолевых клеток совершенно различной природы. Так, для миелодиспластического синдрома характерна перестройка между генами ETV6 и PDGFRfi, а для хронического миелоидного лейкоза — перестройка между генами PDGFR/5 и D10S170. В то же время при папиллярных карциномах щитовидной железы часто наблюдается
Рисунок 2. Связь между семействами различных опухолей.
Обозначения как на рис.1. Для миелодиспластического синдрома характерна перестройка между генами ETV6 и PDGFRJ5, а для хронического миелоидного лейкоза — между генами ETV6 и D10S170. Транслокация между геном D10S170 и геном, кодирующим тирозин киназу RET, часто наблюдается при папиллярных карциномах щитовидной железы.
транслокация между геном, кодирующим тирозинкиназу RET, и геном DJOS170 [18]. Таким образом, можно проследить некую связь между совершенно различными видами опухолей (рис. 2; более подробно см. обзор [22]).
*
10 т.п.н.
і і
MLL RET
~ФИіД||11йИ1іі И k— 444Н4Ш41
ЪсГ 10т.п.н. bcr
ТА SET CDH TM
1 Т.П.Н. bcr
I I
Рисунок 3. Кластеры точек разрывов MLL и RET.
Верхний ряд — схема генов. Черным цветом выделены экзоны, серыми прямоугольниками — bcr. Нижний ряд — карта кДНК. Серыми прямоугольниками выделены белковые домены: AT-hook (AT), «цинковые пальцы» (СххС), PHD-finger домен (PHD), трансактивирующий домен (ТА), SET-домен (SET), кадгериновый домен (CDH), трансмембранный домен (ТМ), каталитический домен тирозинкиназы (YT). Черным цветом показано соединение экзонов 11 и 12 RET, между которыми расположен bcr.
Кластеры точек разрыва
Среди множества генов, участвующих в транслокациях, некоторые принимают участие в различных транслокациях с широким кругом партнеров, тогда как другие — только в транслокациях с одним или несколькими партнерами. Это показано на рис. 1 и 2. Гены, находящиеся в центре «звезд», принимают участие в наибольшем количестве различных транслокаций (см. обзор Kim and Pelletier [19] и Bohlander [22]).
Одним из наиболее известных генов, перестройки которого связывают с развитием онкологических заболеваний, является ген, кодирующий фактор транскрипции MLL (называемый также HRX или ALL1), (см. обзор Ayton and Cleary [20]). Этот ген протяженностью 86 т.п.н. состоит из 37 экзонов и принимает
участие в десятках различных транслокаций. Клонирование и сиквенирование множества участков сочленения химерных генов показало, что подавляющее большинство точек разрыва в гене MLL сосредоточено внутри фрагмента длиной 8,3 т.п.н., включающего экзоны 7-13 (рис. 3). Этот фрагмент был назван «кластером точек разрыва» (breakpoint cluster region, bcr). Он содержит сайты расщепления топоизомеразой II, а также участки прикрепления к ядерному матриксу [23].
Такие кластеры, характеризующиеся наличием определенных структурных элементов (последовательности ДНК, в которых хроматиновые петли прикреплены к ядерному матриксу — S/MAR-элементы, , участки предпочтительного расщепления ДНК топоизомеразой II и участки гиперчувствительности к ДНКазе I), существуют не только в гене MLL. Кластеры точек разрыва, т.е. участки ДНК, в которых находится большинство точек разрыва соответствующих генов, были обнаружены в генах, кодирующих транскрипционные факторы AF4 и AF9 (см. обзор [24]). Эти гены являются наиболее частыми партнерами MLL по транслокациям. В локусе AF4 точки разрыва сосредоточены в области, расположенной между экзонами 3 и 7 и занимающей около трети длины гена [25]. В локусе AF9 находящийся в 5'-концевой области гена bcrl имеет протяженность, составляющую 6% от длины гена и включает в себя часть интрона 4, экзон 5 и половину интрона 5. Перестройки в этом районе наблюдаются при остром миелоидном лейкозе. Лежащий же в 3'-концевой области гена Ъсг2 расположен между экзонами 7 и 9 и, так же, как и bcr MLL, содержит сайты расщепления топоизомеразой И. Оба bcr AF9 фланкированы S/MAR-элементами [26].
Другой ген, который, участвует в развитии лейкоза, — это АМЫ (ген острого ми ел оидного лейкоза) [27]. Известно несколько генов, образующих химеры с АМЫ. Чаще всего партнером АМЫ является ген ЕГО, участвующий в. транслокации t(8;21). Как и МЫ, АМЫ кодирует фактор транскрипции. Как и в случае MLL, точки разрыва в АМЫ и ЕГО кластеризованы [28]. В интроне 5 АМЫ были обнаружены три близко расположенных фрагмента длиной 2,8, 5,3 и 2,3 т.п.н., в которых сосредоточены точки разрывов. Включая незначительные промежутки, эти bcr занимают 7% длины гена. В первом интроне ЕГО картировано также три bcr, длиной 2,6, 2,5 и 2,6 т.п.н. (10% длины гена). Четыре из шести упомянутых кластеров разрывов, а именно Ъсг2 и ЬсгЗ АМЫ и bcrl и Ъсг2 ЕГО, содержат сайты расщепления топоизомеразой II.
При развитии плотных опухолей в образовании химерных белков часто принимает участие ген саркомы ЮингаіїЖ? (см. обзор [19]). Этот ген участвует во множестве транслокаций. Как и в случае MLL и АМЫ, большинство точек разрыва в гене EWS расположены в относительно небольшом участке гена между экзонами 7 и 9 [28-29]. Остальные точки разрыва локализованы преимущественно от экзона 9 до экзона 12. Протяженность участка гена между экзонами 7 и 9 составляет 4,7 т.п.н., то есть он даже короче, чем 8.3 т.п.н. bcr гена MLL. Таким образом, представляется вполне разумным говорить о кластеризации точек разрыва в гене EWS. Интересно, что и в этом кластере были обнаружены сайты расщепления ДНК топоизомеразой II [29].
Как можно заметить, кластеризация точек разрыва — это общая черта-различных перестроек. Более того, общей чертой является не только кластеризация как таковая, но и некоторые сопутствующие свойства, например, наличие в
кластерах определенных последовательностей. Маловероятно, что это простое совпадение. Какова же природа такого сходства?
Механизм рекомбинации
Первыми генами, для которых было показано участие в транслокациях, характерных для определенных злокачественных опухолей, были с-тус и IgH [30]. Позднее были описаны перестройки, затрагивающие локусы иммуноглобулина и Т-клеточных рецепторов. Одним из генов, участвующих в этих транслокациях, является BCL6. Точки разрыва в гене BCL6 сосредоточены в двух областях — главном кластере точек разрыва (major breakpoint region, MBR, протяженностью 4 т.п.н.), расположенном в первом, некодирующем экзоне, и значительно более длинном (около 40 т.п.н.) дополнительном кластере точек разрыва (alternative breakpoint region, ABR), расположенным перед ним [31]. В каждом случае рамка считывания сохраняется, так как кодирующая часть гена не затрагивается. Злокачественная трансформация, скорее всего, происходит из-за нарушения-регуляции экспрессии онкогена, вызываемого попаданием кодирующей части гена под контроль иммуноглобулинового промотора или энхансера [32]. Поскольку партнером BCL6 по транслокациям обычно является кластер иммуноглобулиновых генов, было высказано предположение о том, что такие транслокации возникают из-за ошибок У(П)1-рекомбинации (см. [33] и цитированные в этой работе статьи); по такому же механизму, скорее всего, происходят транслокации многих других генов с генами иммуноглобулинов или Т-клеточных рецепторов.
Однако, У(0)1-рекомбинация — это далеко не единственный механизм, ошибки в работе которого могут приводить к возникновению хромосомных перестроек. Хотя есть свидетельства того, что У(Б)1-рекомбиназа, возможно,
участвует в некоторых транслокациях, не затрагивающих её природные мишени (гены антител и Т-клеточных рецепторов), большинство данных не подтверждают эту гипотезу [34]. Можно предположить, что механизм У(В)т-рекомбинации работает только в клетках лимфойдного происхождения. Но что же происходит в других случаях?
Некоторые данные говорят о том, что в ряде случаев важную роль играет" транслин. Транслин — это кольцевой белок, основная биологическая роль которого остается загадкой. Однако ясно показано, что он переносится на разнесённые разрывы в ДНК. Консенсусный сайт связывания транслина часто встречается рядом с точками разрыва при незаконной рекомбинации [35]. Тем не менее, существующие факты едва ли подтверждают теорию о том, что транслин играет важную роль в развитии всех типов перестроек, наблюдаемых в опухолевых клетках.
На другие возможные механизмы проливает свет существование кластеров точек разрыва и их структура. Некоторые из описанных кластеров содержат участки узнавания ДНК топоизомеразой II и S/MAR-элементы. Последние представляют собой участки, в которых хроматиновые петли прикреплены к ядерному матриксу (см. обзор [36]). Известно, что ядерный матрикс обладает рекомбиногенной активностью [37]. Одним из главных компонентов ядерного матрикса является топоизомераза II [38]. Этот фермент способен осуществлять незаконную рекомбинацию in vitro, особенно в условиях избирательного подавления лигирующей активности фермента рядом ингибиторов [7, 39]). Такие ингибиторы, в частности, этопозид (также известный как VP-16), применяются при химиотерапии рака. Однако, лечение этими препаратами часто вызывает
вторичные лейкозы [40]. Как и в случаях первичных лейкозов, при вторичных лейкозах, возникающих в ответ на химиотерапию опухолей ингибиторами топоизомеразы II, часто наблюдаются перестройки генов MLL и, реже, АМЫ, причем позиции кластеров разрывов остаются там же, где и при первичных лейкозах [40]. Эти наблюдения хорошо согласуются с моделью, согласно которой перестройки индуцируются разрывами, вносимыми в ДІЖ топоизомеразой П. Образуемые ферментом двуцепочечные разрывы в дальнейшем могут соединяться неправильно, результатом чего и различные хромосомные перестройки. В рамках этой модели конкретный механизм соединения концов ДНК, содержащей двунитевые разрывы, совершенно не важен. Последние данные свидетельствуют о том, что соединение происходит путем лигирования двуцепочечных разрывов с участием одного из стандартных механизмов репарации таких повреждений [5]. Так или иначе, ключевую роль в образовании хромосомных перестроек играет негомологичная рекомбинация. Участие систем гомологичной рекомбинации в образовании хромосомных перестроек нельзя полностью исключить. Однако экспериментальных данных, свидетельствующих об этом, пока имеется крайне мало. Описано лишь несколько транслокаций между гомологичными повторяющимися последовательностями, расположенными в разных генах [41].
Структура белка и кажущаяся кластеризация точек разрыва
Говоря о хромосомных перестройках, типичных для опухолевых клеток вообще и для клеток лейкозов в частности, следует помнить о том, что опухолевые клетки возникают в результате селекции клеточных клонов, обладающих рядом специфических качеств, в том числе способностью к неограниченной пролиферации. Экспрессия химерных генов может способствовать приобретению
клетками тех свойств, которые необходимы для их превращения в опухолевые клетки. Поэтому чрезвычайно интересным представляется проанализировать, что, собственно представляют собой возникающие в результате известных транслокаций химерные гены и какие белковые продукты они могут кодировать. Сохраняются ли рамки считывания в слитых транскриптах (или в неправильно регулируемых генах)? Как соотносится структура образующегося химерного белка со структурой «сливающихся» белков и связана ли она с функциями этих «предшественников»?
На первый из поставленных вопросов можно дать совершенно четкий ответ. Химерные транскрипты, характерные для хромосомных аберраций, практически во всех случаях сохраняют рамку считывания обеих составляющих слитого белка [21]. Параллельный анализ генов-партнеров по транслокациям, возникающих в результате этих транслокаций химерных генов и кодируемых ими белков позволяет по-новому взглянуть и на кластеры точек разрыва.
Наиболее хорошо изучен Ъсг гена MLL. Как сказано выше, этот Ъсг расположен между 7 и 13 экзонами. Структура белка MLL дикого типа и химерных белков, производных от MLL, обсуждалась в недавнем обзоре [20]. Вкратце, точки разрыва почти всегда находятся после СххС домена, расположенного в N-концевой. части белка. Считается, что именно химерные белки-производные MLL вызывают трансформацию, однако ее механизм до сих пор не ясен. По-видимому, основным шагом является связывание MLL с последовательностью-мишенью. Кроме СххС домена, необходимого для специфичного в отношении последовательности связывания с ДНК, в N-концевой части MLL находятся три домена "AT-hook". В результате транслокаций удаляются части гена, кодирующие PHD,
трансактивационные и SET домены, необходимые для работы MLL дикого типа, но -не требующиеся для узнавания ДНК.
Более трети длины гена AF4 (MLLT2) составляет «bcr» длиной 47 т.п.н. На первый взгляд, едва ли столь протяженный фрагмент ДНК можно действительно назвать кластером точек разрыва. Но из этих 47 т.п.н. большую часть — 36 т.п.н. — занимает интрон, а проекция bcr на мРНК гена AF4 составляет всего 170 н. при общей протяженности мРНК в 9390 н. Структура и функции белка AF4 мало изучены, но при сравнении с недавно найденными сходными белками [42] был обнаружен консервативный участок, который, по-видимому, является сильным трансактивационным доменом (strong transactivator domain, STD). Интересно, что bcr в гене AF4 расположен перед частью гена, кодирующей этот домен, в силу чего STD сохраняется в химерных белках, содержащих AF4. При слиянии MLL и AF4 возникает химерный белок, имеющий участок связывания ДНК белка MLL и STD домен белка AF4.
В гене EWS bcr находится между экзонами 7 и 9. Кроме частых перестроек, этот фрагмент также подвергается альтернативному сплайсингу. Одна из белковых изоформ — EWSb — характеризуется отсутствием в соответствующей мРНК экзонов 8 и 9. Экзоны 1-7 кодируют домен активации транскрипции, экзоны 11-17 — РНК-связывающий домен. При перестройках N-концевой участок EWS присоединяется к С-концевым участкам различных транскрипционных факторов, в основном семейства Ets. Следовательно, bcr гена EWS расположен таким образом, что активационный домен белка EWS остается не затронутым при перестройках и входит в состав химерных белков (см. обзор [19]).
Рецепторная тирозин-киназа RET имеет внеклеточный рецепторный домен
на N-конце и цитоплазматический каталитический домен на С-конце. По всей
і видимости, важную роль в канцерогенезе играет химерный белок ELE1-RET, а не
его реципрокный партнёр RET-ELE1 [18]. Экзоны, начиная с двенадцатого,
кодируют киназный домен. При образовании химерных генов рамки считывания
обоих партнеров сохраняются, и каталитический домен в слитом белке такой же,
как и в исходной киназе. Функция N-концевого участка белка ELE1,
предположительно, заключается в активации рецептора андрогена. Этот участок
белка содержит суперспирализованный ("coiled-coil") домен [43], с помощью
которого слитый белок ELE1-RET может взаимодействовать с молекулами ELE1
mhELEI-RET.
Видно общее свойство всех рассмотренных выше транслокаций: граница"
между частями химерного белка всегда пролегает таким образом, что
функциональные домены исходных белков остаются не поврежденными. Иными
словами, положение всех точек разрыва в генах безусловно связано со структурой
соответствующих белков. Эта закономерность может быть выражена в большей
генов, участвующих
или меньшей степени но, тем не менее, она ясно показана для всех изученных
в образовании характерных для опухолей хромосомных перестроек. «Целесообразное» с функциональной точки зрения расположение кластеров точек разрыва хромосом в опухолевых клетках с теми или иными транслокациями едва ли может быть следствием кластеризации первичных
хромосомных разрывов. Здесь следует обратить особое внимание на то, что
!
позиции первичных разрывов вообще не изучались никем и никогда. На протяжении многих лет объектом изучения являлись транслокации, обнаруженные
в опухолевых клетках, которые, вне всякого сомнения, представляют собой результат отбора. Общепринятая теория канцерогенеза рассматривает неодарвинистский механизм развития опухоли [44]. Сначала тем или иным способом образуется аберрантная клетка, которая затем подвергается клональной селекции. Некоторые мутации могут давать клетке конкурентное преимущество, некоторые — быть легальны для клетки. Кроме того, мутация может быть безразлична для клетки и, следовательно, незаметна для исследователя. На белковом уровне, скорее всего, большинство транслокаций именно таковы. Учитывая количество генов в человеческом геноме [45], можно предположить, что вероятность образования функционально активного химерного белка в результате случайной хромосомной перестройки крайне мала. Учитывая же количество различных типов клеток и тканеспецифичных путей дифференцировки, размножения и апоптоза, вероятность того, что такой белок будет давать клетке-хозяину селекционное преимущество, еще ниже. Поэтому можно предположить, что описанные в литературе кластеры точек разрыва хромосом содержат не все точки разрыва, а лишь те из них, которые приводят к возникновению «полезных» для клетки-хозяина хромосомных перестроек, позволяющих опухоли развиться до наблюдаемого состояния. Таким образом, наблюдаемые при лейкозах и других опухолях кластеры перестроек в действительности могут отражать результат селекции клеточных клонов, являющихся предметом последующего исследования. Если это действительно так, то объяснением факта кластеризации будет следующее: как таковой кластеризации первичных точек разрыва хромосомных перестроек не существует. Существование, тем не менее, наблюдаемых кластеров, отражает тот факт, что выживают только некоторые клетки с перестройками,
причем такими, у которых точки разрыва находятся в определённых, весьма небольших районах ограниченного множества генов. Аналогичная теория уже выдвигалась [46].. С другой стороны, нельзя исключить и возможности того, что эволюция белков протекала посредством обмена функциональными доменами, которые разделяются рекомбиногенными зонами, в частности, участками прикрепления ДНК к ядерному матриксу [36]. Для окончательного ответа на-вопрос о том, существуют ли кластеры первичных точек разрыва хромосом необходимы дальнейшие исследования
Роль ядерной архитектуры в образовании хромосомных перестроек
Выше уже говорилось о том, что геномные фрагменты, в которых кластеризованы точки разрыва хромосом, обычно обладают рядом интересных особенностей. Среди них лучше всего изучены S/MAR элементы и участки расщепления ДНК топоизомеразой П. Такие особенности кластеров точек разрыва весьма интересны в свете модели, предполагающей, что в bcr сосредотачиваются точки первичных разрывов хромосом. Однако, как уже говорилось выше, наиболее-хорошо изученные в настоящее время кластеры хромосомных разрывов могут быть результатом селекции клеточных клонов. Правомерен вопрос о том, существуют ли вообще кластеры первичных разрывов и если да, то какова роль пространственной организации ДНК в возникновении таких кластеров? Для ответа на первую часть вопроса необходимо обратить внимание на те гены, перестройки которых не могут дать клетке каких либо селективных преимуществ. Понятно, что в подавляющем большинстве случаев перестройки таких генов не представляют большого практического интереса, в силу чего их не изучали. Существуют, однако, некоторые исключения. Речь идет о генах, перестройки которых приводят к
наследственным заболеваниям. В плане обсуждаемой нами проблемы наибольший интерес представляет ген дистрофина человека. По понятным причинам перестройки этого гена активно изучались. Оказалось, что позиции разрывов внутри этого гена распределены не случайно. Существуют две горячие зоны рекомбинации. В данном случае есть веские основания полагать, что в этих горячих точках сосредотачиваются именно первичные разрывы, так как продукт гена дистрофина не важен для жизнеспособности клетки, а играет роль лишь на" уровне организации мышечной ткани. Недавно в нашей лаборатории была построена карта организации гена дистрофина в петли-домены [47]. При этом была выявлена хорошая корреляция между позициями горячих точек рекомбинации и позициями протяженных зон прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу. В другой работе нашей лаборатории было продемонстрировано, что Ьсг-участш генов АМЫ и ЕЮ содержат S/MAR элементы и прикреплены к ядерному матриксу даже в тех клеточных линиях, где эти гены не перестроены. В совокупности с цитированными выше данными о том, что S/MAR элементы и участки расщепления ДНК топоизомеразой II присутствуют в большинстве изученных bcr, эти результаты указывают на то, что пространственная организация ДНК в ядре вносит существенный вклад в определение позиций хромосомных перестроек. Понятно, что эта проблема нуждается в дальнейшем изучении.
На данный момент положение S/MAR элементов определено только в двух генах, часто подверженных перестройкам — MLL и АМЫ. При этом продемонстрировано, что S/MAR элементы колокализуются с bcr. Получена также некоторая информация о расположении S/MAR в гене AF9 (за исключением длинных интронов 2 и 3 [26]). В гене AF4 картирование S/MAR элементов
проводилось только в Лсг-содержащих областях [26], в силу чего нельзя сказать, отличаются ли эти области от остальной части гена. Гены MLL [48], АМЫ [49] и ЕЮ [49] также изучались на предмет in vivo расщепления ДНК- топоизомеразой П. В этих случаях, опять-таки, рассматривались не целые гены, а только их bcr-содержащие участки. Понятно, что в плане обсуждаемого нами вопроса наиболее интересным представляется сравнение кластеров разрывов с остальными частями генов. Такую работу еще предстоит проделать.
Следует сказать о том, что пространственная организация ДНК в ядре влияет определенным образом на частоту транслокаций между различными хромосомами. Дело в том, что расположение хромосом (точнее, хромосомных территорий) в интерфазном ядре не является случайным [50-51]. Территории богатых генами хромосом (например, человеческих хромосом 9 или 19) находятся вблизи от центра ядра, а бедных генами (18 или 22) — ближе к ядерной периферии [52-53]. Локализация нескольких хромосомных территорий на одной и той же «ядерной орбите» существенно увеличивает вероятность рекомбинации между ними. Так, территории хромосом 9 и 22, почти равных по генной плотности, расположены на одной «орбите» — и транслокации между ними происходят относительно часто. В некоторых случаях специфичные хромосомы не просто находятся на общей ядерной орбите, а остаются ассоциированы друг с другом на протяжении всего клеточного цикла (или некоторых его фаз) [39]. Подробное обсуждение пространственной организации хромосом в интерфазном ядре и ее роли в осуществлении хромосомных перестроек выходит за рамки настоящего обзора. Дополнительную информацию можно найти в работах [54-55].
Принимая во внимание все данные, изложенные выше, наиболее вероятный вывод выглядит так: наблюдаемые в опухолевых клетках кластеры точек разрыва в действительности представляют собой результат того, что анализировались клоны опухолевых -клеток, сохранившиеся в ходе отбора из популяции клонов с многочисленными и рассредоточенными первичными транслокациями. Существование кластеров точек разрыва наглядно подтверждает хорошо известный в астрофизике антропный принцип: Вселенная такова, какой мы ее наблюдаем, просто потому, что в любой другой мы просто не смогли бы возникнуть [56]. Аналогично, положения точек разрыва при перестройках таковы, какими мы их наблюдаем, потому что все остальные перестройки никак не проявляются фенотипически или детальны для клетки. Эта гипотеза не исключает, однако, того, что в некоторых (а может быть, и во многих) случаях первичные точки разрыва могут быть уже кластеризованы вокруг или внутри подобных «функционально значимых» кластеров, как это, по-видимому, происходит в случае MLL или AML1. По-видимому, ядерная архитектура каким-то образом вовлечена в определение позиций транслокаций. Существование первичных кластеров разрыва не противоречит идее последующего отбора вариантов. Не вызывает особого удивления и то, что в ряде случаев кластеры первичных разрывов могут располагаться между фрагментами гена, кодирующими различные функциональные домены белков. В соответствии с общепринятой моделью, функциональные белковые домены представляют собой исторические единицы эволюции белка [57]. Предковые домены (а точнее, кодирующие их фрагменты ДНК) подвергались перетасовке в процессе эволюции, что привело к образованию современных белков. Возможно, гены, кодирующие современные белки могут
содержать некоторые следы этих древних событий. Границы между доменами на генном уровне все еще могут быть более подвержены рекомбинации, чем тела доменов.
Структура и механизм действия топоизомераз II типа
ДНК-трпоизомеразы — ферменты, изменяющие топологию ДНК в клетке за счет внесения временных разрывов в цепи ДНК. Такие разрывы сопровождаются образованием ковалентной связи между молекулой белка и одним из концов цепи ДНК. За время существования ковалентного комплекса топология ДНК меняется, после чего разрыв религируется, и ДНК высвобождается из интермедиата. Топологические проблемы, решаемые топоизомеразами, неизбежно возникают при любых процессах, затрагивающих ДНК, вследствие её двуспиральной геометрии и чрезвычайной протяжённости.
Многие процессы требуют определённого уровня сверхспирализации ДНК, который также контролируется топоизомеразами [4]. Существуют топоизомеразы, позволяющие снимать напряжение только при отрицательной суперспирализации ДНК, при суперспирализации любого знака, а также вносящие отрицательные (бактериальные ДНК-гиразы) или положительные (обратная гираза термофильных прокариот) сверхрвитки в ДНК [3].
Все топоизомеразы делят на два основных типа, исходя из общих свойств ферментов: топоизомераза I типа вносит в ДНК одноцепочечные разрывы, II — двуцепочечные. Дальнейшая классификация топоизомераз 1-го типа также основывается на особенностях катализируемой реакции: в зависимости от того, как фермент связывается с ДНК — с 5'-концом или 3' — выделяют подтипы ІА и IB, соответственно.
Топоизомеразы П-го типа до недавнего времени не делили на подтипы. Однако, обнаружение топоизомеразы VI архебактерии S. shibatae [58], структурно коренным образом отличающейся от всех ранее известных ферментов П-го типа,, привело к выделению её в подтип ПВ. Все остальные топоизомеразы II были отнесены к подтипу НА.
Следует особо отметить, что топоизомераза ИВ оказалась очень похожей на дрожжевой белок Spoil. Он играет важную роль в процессе рекомбинации [59], внося, как и топоизомераза И, двуцепочечный разрыв в молекулу ДНК. Такая связь между топоизомеразой II и рекомбинацией заслуживает пристального внимания в свете многочисленных данных о непосредственном участии топоизомеразы II
.' I- .Л-'\". v ' '
высших эукариот в незаконной рекомбинации. Некоторые аспекты этой проблемы давно изучаются в нашей лаборатории, и мы планируем продолжать эти исследования. Поэтому в настоящем обзоре в том числе коротко рассмотрены основные данные о структуре и функциях эукариотических топоизомераз П-го типа.
Основные свойства топоизомераз II
Топоизомераза II — фермент, катализирующий «протаскивание» одной двойной спирали 'ДНК через другую. Димерный фермент связывается с двумя тяжами двуспиральной ДНК и вносит разрыв в одну из них, обозначаемую «G-сегмент». При этом каждая субъединица фермента связывается с 5'-концом ДНК. Другой тяж, называемый «Т-сегмент» (он может принадлежать той же молекуле, что и G-сегмент, в случае релаксации или изменения степени суперспирализации, или же другой — в случае образования или распада катенанов), транспортируется
через разомкнутый G-сегмент [3]. Для реакции необходимы ионы магния и гидролиз АТФ в качестве источника энергии.
Разные ферменты II типа различаются между собой между собой; так, все прокариотические ферменты состоят из четырёх субъединиц, т.е. являются гетеротетрамерами (А2В2), в то время как эукариотические ферменты
DNA Binding/Cleavage Domain
C-terrmnal tail
ATPase
S. cerevuiae topoll
Human topo Ha |
Human topo lip
coft topo IV
:. v.-..,. .. '
ParC
E.coli DNA
gyrase 1
GytA
J» 719
Рисунок 4. Сравнение первичной структуры топоизомераз II типа.
(подробнее см. в тексте)
гомодимерны. Кроме того, только бактериальная ДНК-гираза способна использовать энергию гидролиза АТФ для внесения отрицательных супервитков в ДНК [60].
Структура белка
Анализ аминокислотных последовательностей различных топоизомераз подкласса IIA, в том числе бактериальной ДНК-гиразы, позволил выделить три основных структурных домена (рис. 4).
Последовательности этих доменов у различных представителей семейства весьма схожи. За исключением небольшой (170 аминокислотных остатков) вставки ближе к С-концу субъединицы GyrB бактериальной ДНК-гиразы, удаление которой приводит к потере активности фермента in vivo, степень гомологии между N-концевыми доменами различных топоизомераз II весьма высока: эти домены представляют собой АТФ-связывающие сайты, а С-концевые — сайт связывания (и разрыва) ДНК. Непосредственно возле С-конца расположен участок, сильно различающийся у разных представителей этого семейства белков [61-62]. Кроме
Yeast topo II В'-А' (М) Yeast topo II В'-А' (О)
Рисунок 5. Структуры субъединицы А ДНК-гиразы Е. coli и участка В'-А' топоизомеразы дрожжей.
, . того, у бактериальной ДНК-гиразы на С-конце расположен участок, ответственный
за внесение отрицательной суперспирализации в ДНК [63-65].
Как было сказано ранее, прокариотические ферменты П-го типа
»
представляют собой гетеротетрамеры. С-концевой участок GyrB таких ферментов
отвечает за взаимодействие субъединиц GyrA и GyrB или их гомологов [66].
У дрожжевой топоизомеразы С-конец GyrB-подобного фрагмента называется В' и вместе с участком А' (гомологичным GyrA) образует сайт, связывания/разрыва ДНК (В'-А').
На данный момент получены данные рентгеноструктурного анализа обеих субъединиц ДНК-гиразы E.coli (с разрешением 2.80 и 2.30 D соответственно) и большого фрагмента дрожжевой топоизомеразы II (с разрешением 1.90 D) (рис. 5).
Структура N-концевого участка GyrA субъединицы E.coli (называемой также GyrA') показана на рис.2 [67]. Вместе с GyrB этот участок осуществляет АТФ-зависимую релаксацию супервитков; в то же время С-концевой участок, необходимый для внесения отрицательной суперспирализации, в GyrA' отсутствует [64].
Для большого фрагмента дрожжевой топоизомеразы, содержащего участок
^ В'-А', возможны две кристаллические структуры (рис. 5), отличающиеся
ориентацией домена В' относительно остальной части молекулы. Эти структуры, по-видимому, являются альтернативными конформациями фермента, что объясняет открытие ворот перед протаскиванием ДНК [68]. В целом структура домена (В'-А')2 очень похожа на структуру димера GyrA'.
Механизм действия
Хотя многие детали расщепления ДНК топоизомеразой НА требуют дальнейшего изучения, биохимические данные и информация о структуре белка позволяют предложить следующую молекулярную модель действия топоизомеразы II [69-71].
Структуру топоизомеразы II без С-концевого домена можно рассматривать как совокупность GyrA и N-концевой части GyrB [72-73]. Для одной субъединицы фермента С-конец не является необходимым для разрыва и религирования ДНК [63].
Молекула фермента содержит сайт связывания ДНК и два «кармана» для Т-сегмента ДНК — до и после его прохождения через разомкнутый G-сегмент (рис. 3). Полость, в которой происходит первоначальное связывание ДНК, называется N-воротами. Вторая полость, в которую Т-сегмент ДНК попадает после прохождения через разрыв G-сегмента, — С-ворота, также называемые «выходом».
В процессе реакции фермент подвергается крупномасштабным конформационным изменениям. Такие изменения, вероятно, происходят при взаимодействии с ДНК или при связывании АТФ и высвобождении продуктов ее гидролиза [74-76].
Рисунок 6. Предположительный механизм действия топоизомеразы II типа
В присутствии АТФ N-ворота фермента постоянно переходят из открытого состояния в закрытое и обратно [63], [77]. Связывание АТФ с одним из АТФазных доменов изменяет конформацию домена, что приводит к закрытию ворот, и позволяет связать вторую молекулу АТФ [77-78]. Для нового открытия ворот необходим гидролиз АТФ и высвобождение АДФ. Следующим шагом является взаимодействие G-сегмента и ДНК-связывающего участка фермента при открытых N-воротах. После связывания фермента с ДНК конформационные изменения приводят к увеличению скорости перехода N-ворот из открытого состояния в закрытое и обратно [77], [79]. При каждом цикле без участия Т-сегмента G-сегмент на короткое время разрывается, но такой разрыв не сопровождается открытием N-ворот. Связывание АТФ приводит к закрытию ворот, при этом Т-сегмент ДНК оказывается внутри полости фермента, после чего происходит быстрый транспорт Т-сегмента через разомкнутый G-сегмент в нижнюю полость и выход Т-сегмента.
Этот процесс существенно ускоряется в присутствии АТФ, хотя он возможен и в присутствии негидролизуемых аналогов [74-76], [64]. Цикл завершается закрытием С-ворот, предположительно происходящим при гидролизе АТФ. Высвобождение продуктов гидролиза АТФ приводит к размыканию N-ворот, после чего система готова к новому циклу.
и реплисома, и дочерние дуплексы могут свободно вращаться вокруг оси реплицируемой ДНК. Однако, в
f\ <г
^^XIKIjOCjOQ'OO^' (JV'v***/
Клеточная роль топоизомеразы II Репликация
Рисунок 7. Топологические проблемы при репликации.
a) репликативный аппарат неподвижен
b) репликативный аппарат может свободно
вращаться вокруг оси реплицируемой ДНК.
Репликация
протяжённых
двуспиральных молекул
ДНК неизбежно
приводит к
пространственным
затруднениям,
независимо от того,
зафиксированы
репликативный комплекс и сама ДНК в клетке или нет. Отсутствие таких затруднений возможно только в том случае, если
реальности такая свобода практически недостижима ни в прокариотических, ни в эукариотических клетках. Редким исключением являются самые маленькие хромосомы дрожжей (см. ниже).
Если представить, что невозможно вращение ни репликативного аппарата, ни дочерних двуспиральных молекул, то продвижение реплисомы увеличивает степень сверхспирализации ДНК спереди от себя (рис. 7а).
В случае вращения
аппарата
репликативного
1SS80^»>
Рисунок 8. Топологические проблемы, возникающие при схождении двух репликативных вилок
сверхвитки, расположенные спереди от него, могут перемещаться в область позади реплисомы, что приводит к переплетению дочерних дуплексов и/или положительной суперспирализации ДНК позади репликативной вилки (рис. 76).
Механизм действия
различных классов топоизомераз позволяет предположить, что топоизомераза II действует позади
репликативной вилки, удаляя переплетения двойных спиралей новосинтезированных молекул ДНК, и таким образом снимает положительную суперспирализацию ДНК, возникающую в процессе репликации (рис. 7) [80]. Топологические проблемы возникают также при схождении двух репликативных
вилок, когда между ними остается короткий нереплицированный участок ДНК. В этом случае остаточные переплетения родительских цепей преобразуются в переплетения новосинтезированных дочерних молекул (рис. 8), после чего топоизомераза II завершает окончательную сегрегацию образовавшихся хромосом. Существует наглядное свидетельство того, что топоизомеразы II необходима для сегрегации хромосом [81-82]. При отсутствии в клетках топоизомеразы II митоз приводит к возникновению значительного количества разрывов в больших хромосомах дрожжей [83]. В то же время в маленьких хромосомах, способных относительно беспрепятственно вращаться, сбрасывая переплетения, разрывов наблюдается мало или не наблюдается вовсе. Это наблюдение поддерживает гипотезу о том, что топоизомераза II решает топологические проблемы при удлинении ДНК.
Транскрипция
На первый взгляд, транскрипция не должна представлять проблемы с
топологической точки
зрения. Однако это верно
только в том случае,
если транскрипционный аппарат может свободно вращаться вокруг оси дуплекса (см. рис. 9). В
Рисунок 9. Топологические проблемы при транскрипции.
противном
случае
возникает сложности,
аналогичные таковым при репликации. А, поскольку транскрипция у высших эукариот, по-видимому, жестко иммобилизована на так называемых «транскрипционных фабриках» [84-85], то и топоизомераза также оказывается необходимой для нормальной экспрессии генов. Но, поскольку в случае транскрипции (в отличие от репликации) задействован только один дуплекс ДІЖ, то возникающие напряжения имеют несколько иную природу. В ходе элонгации перед полимеразой возникает область положительной сверхспирализации, а за ней — отрицательной [86]. Такие напряжения могут быть сняты не только топоизомеразой II, но и топоизомеразой I.
Тем не менее, для транскрипции большинства генов наличие топоизомеразы (не важно, какого типа) вообще не строго необходимо [87-88]. РНК-полимераза может преодолевать топологические трудности, возникающие как следствие ее перемещения вдоль ДНК [63]. Однако для интенсивно транскрибируемых генов, например, генов рРНК, способностей РНК-полимеразы явно недостаточно. Демонстрацией этого является заметное снижение уровня синтеза рРНК при непермессивной температуре у двойного topl-topll температурочувствительного мутанта дрожжей [87-88].
Конденсация хромосом
Упаковка хроматина, сегрегация хромосом и топология ДНК глубоко взаимосвязаны. Изучение ранних стадий деления дрожжей, цитологические исследования эукариотических клеток, обработанных ингибиторами топоизомеразы II, и биохимические данные о конденсации хромосом в клеточных экстрактах свидетельствуют об участии топоизомеразы II в этом процессе при подготовке клетки к митозу [81-82], [89].
Гипотеза о необходимости по крайней мере одной из топоизомераз для хромосомной конденсации подтверждается наблюдаемыми изменениями величины суперспирализации ДНК, происходящими при компактизации ДНК [90]. Изучение конденсинов — АТФ-зависимых белковых комплексов, необходимых для конденсации хромосом, — также доказывает вовлечение топоизомеразы II в хромосомную конденсацию [90]. Однако, несмотря на то, что топоизомераза II всегда считалась необходимым для хромосомной конденсации белком, ее точная роль в изменениях, происходящих при переходе хромосомы от интерфазы до" высококонденсированного состояния в метафазе, до сих пор не ясна. Так, роль топоизомеразы IIS. pombe в конденсации хромосом при мейозе до сих пор остается предметом дискуссий.
Рекомбинация
Анализ аминокислотной последовательности топоизомеразы ПВ показал наличие целого ряда ее гомологов у различных организмов [91], [58]. Одним из таких гомологов является Spoil. Этот дрожжевой белок катализирует разрыв и религирование ДНК в ходе мейотической рекомбинации. Однако, в отличие от реакции, катализируемой топоизомеразой ИВ, в ходе рекомбинации нет стадии протаскивания одного дуплекса ДНК через другой [58]. Интересно, что, хотя субъединица А топоизомеразы ПВ содержит все необходимые для катализа разрыва и восстановления ДНК структурные аналоги топоизомеразы ПА, при отсутствии В-субъединицы разрыва ДНК не происходит [92]. Тем не менее, до сих
. '. \;;'!-
пор точно неизвестно, необходим ли гомолог В-субъединицы для разрыва ДНК белком Spoil, и сходны ли механизмы Spoil-рекомбинации и топоизомеразной (ПВ) реакции.
Ингибирование топоизмеразы II
Как и любой другой фермент, топоизомераза II может ингибироваться различными химическими соединениями. Топоизомеразные ингибиторы можно разделить на несколько групп в зависимости от механизма их действия. Они блокируют разные стадии сложной реакции, катализируемой топоизомеразой II. Каталитический цикл этого фермента выглядит следующим образом (см. рис. 6): топоизомераза «протаскивает» один интактный дуплекс ДНК через временный двуцепочечный разрыв во второй молекуле, после чего лигирует образованный двуцепочечный разрыв (double-strand break, DSB). В активном центре фермента находится остаток тирозина, который атакует фосфодиэфирную связь в ДНК, образуя свободный З'-ОН конец и фосфотирозильную связь с 5'-концом ДНК. Топоизомераза II — гомодимер, и расщепление проходит симметрично — получается «липкий» DSB, концы которого ковалентно связаны с субъединицами фермента [11], [9]. Это — основной интермедиат топоизомеразной реакции, т.н. промежуточный комплекс, или ковалентный аддукт (cleavable complex). Как уже упоминалось выше, в нормальных условиях процесс образования ковалентного аддукта обратим. При физиологической активности топоизомеразы II ковалентный аддукт в небольших количествах всегда присутствует в клетке. При условиях, увеличивающих время жизни ковалентных интермедиатов, или резко отличающихся от физиологических, происходит накопление промежуточных комплексов. Это делает более вероятным появление продуктов ненормального поведения таких промежуточных комплексов, а именно, хромосомных аберраций. Еще опаснее для клетки ситуация, при которой некоторые ферменты, например полимеразы или хеликазы, пытаются преодолеть участок ДНК, связанный в
ковалентный аддукт [93-95]. При столкновении упомянутых ферментов с ковалентным аддуктом топоизомеразы II процесс образования ковалентного аддукта становится необратимым, а временные двуцепочечные разрывы превращаются в постоянные. Поскольку такие разрывы больше не защищены белковым мостиком, они легко подвергаются действию репарационных и рекомбинационных систем, что приводит к еще большему росту числа хромосомных аберраций [6], [96-101]. Когда количество двуцеп очечных разрывов достигает определенного уровня, в клетке запускаются механизмы апоптоза, что в конечном итоге приводит к гибели клетки.
Остановимся подробнее на некоторых механизмах ингибирования топоизомеразы П.
В соответствии с механизмом действия топоизомеразные яды можно
Хромосомные перестройки и ассоциированные с ними заболевания
В настоящее время известно более двухсот генов, которые могут участвовать в образовании химерных белков [1]. Во многих случаях существует четкая корреляция между экспрессией слитых генов, приводящей к формированию химерных белков, и развитием опухолей и лейкозов. Так, для некоторых типов лейкозов характерно наличие хромосомных перестроек, затрагивающих ген МЫ, кодирующий фактор транскрипции; другой яркий пример — саркома Юинга, которая характеризуется наличием хромосомных перестроек, затрагивающих ген EWS, также кодирующий некий фактор транскрипции. Образующиеся в результате перестройки химерные гены могут оказаться функционально активными: они экспрессируют химерные белки, сочетающие в себе домены двух гетерологичных белков, в норме не взаимодействующих в клетке. Кроме того, результатом транслокации может быть попадание кодирующей последовательности гена под контроль регуляторных элементов совершенно другого гена. При этом может происходить изменение профиля экспрессии ткане- и времяспецифичных факторов. Как правило, изменение характера экспрессии или возникновение новой (химерной) кодирующей последовательности происходит с участниками регуляторных каскадов: транскрипционными факторами ([16-17]), или протеинкиназами ([18]), которые участвуют в управлении клеточным циклом, дифференциррвкой или апоптозом. Дополнительные примеры можно найти в недавно опубликованных обзорах ([19-20]).
Многие злокачественные заболевания можно охарактеризовать определенной перестройкой, которая каждый раз возникает практически в одном и том же месте. С другой стороны, известные перестройки, затрагивающие конкретные гены, могут служить маркером развития конкретной опухоли. Часто один и тот же ген формирует химеры с разными партнерами, образуя т.н. «семейства химерных белков». Примером образующего такое «семейство» гена является EWS. Его семейство включает несколько генов, с каждым из которых EWS образует химерный белок, характерный для того или иного заболевания. Так, ETV6 (слева) и RET (справа) и их партнеры по транслокациям. Прямоугольниками обозначены отдельные гены (серым цветом выделены гены, кодирующие транскрипционные факторы). Линии, соединяющие прямоугольники, указывают на существование транслокаций между данными генами. например, в клетках саркомы Юинга присутствуют белки, являющиеся продуктом экспрессии химерных генов, возникающих в результате слияния EWS с FLU, FEV, CHOP, ERG, ETV1. В клетках ряда других сарком обнаружен белок, кодируемый химерным геном, возникшим в результате слияния генов EWS и ETV4. Некоторые семейства химерных генов показаны на рис. 1. Как уже упоминалось, большинство генов, образующих эти семейства, кодируют транскрипционные факторы или протеинкиназы [21]. Так, ген RET кодирует рецепторную тирозинкиназу, часто перестроенную в тироидных опухолях (см. обзор [22]).
В пределах семейств могут наблюдаться сложные отношения между членами. Химерные гены, возникающие в результате слияния одного и того же гена с разными партнерами, могут быть характерны для опухолевых клеток совершенно различной природы. Так, для миелодиспластического синдрома характерна перестройка между генами ETV6 и PDGFRfi, а для хронического миелоидного лейкоза — перестройка между генами PDGFR/5 и D10S170. В то же время при папиллярных карциномах щитовидной железы часто наблюдается
Обозначения как на рис.1. Для миелодиспластического синдрома характерна перестройка между генами ETV6 и PDGFRJ5, а для хронического миелоидного лейкоза — между генами ETV6 и D10S170. Транслокация между геном D10S170 и геном, кодирующим тирозин киназу RET, часто наблюдается при папиллярных карциномах щитовидной железы. транслокация между геном, кодирующим тирозинкиназу RET, и геном DJOS170 [18]. Таким образом, можно проследить некую связь между совершенно различными видами опухолей (рис. 2; более подробно см. обзор [22]). Верхний ряд — схема генов. Черным цветом выделены экзоны, серыми прямоугольниками — bcr. Нижний ряд — карта кДНК. Серыми прямоугольниками выделены белковые домены: AT-hook (AT), «цинковые пальцы» (СххС), PHD-finger домен (PHD), трансактивирующий домен (ТА), SET-домен (SET), кадгериновый домен (CDH), трансмембранный домен (ТМ), каталитический домен тирозинкиназы (YT). Черным цветом показано соединение экзонов 11 и 12 RET, между которыми расположен bcr.
Среди множества генов, участвующих в транслокациях, некоторые принимают участие в различных транслокациях с широким кругом партнеров, тогда как другие — только в транслокациях с одним или несколькими партнерами. Это показано на рис. 1 и 2. Гены, находящиеся в центре «звезд», принимают участие в наибольшем количестве различных транслокаций (см. обзор Kim and Pelletier [19] и Bohlander [22]).
Одним из наиболее известных генов, перестройки которого связывают с развитием онкологических заболеваний, является ген, кодирующий фактор транскрипции MLL (называемый также HRX или ALL1), (см. обзор Ayton and Cleary [20]). Этот ген протяженностью 86 т.п.н. состоит из 37 экзонов и принимает участие в десятках различных транслокаций. Клонирование и сиквенирование множества участков сочленения химерных генов показало, что подавляющее большинство точек разрыва в гене MLL сосредоточено внутри фрагмента длиной 8,3 т.п.н., включающего экзоны 7-13 (рис. 3). Этот фрагмент был назван «кластером точек разрыва» (breakpoint cluster region, bcr). Он содержит сайты расщепления топоизомеразой II, а также участки прикрепления к ядерному матриксу [23].
Роль ядерной архитектуры в образовании хромосомных перестроек
Выше уже говорилось о том, что геномные фрагменты, в которых кластеризованы точки разрыва хромосом, обычно обладают рядом интересных особенностей. Среди них лучше всего изучены S/MAR элементы и участки расщепления ДНК топоизомеразой П. Такие особенности кластеров точек разрыва весьма интересны в свете модели, предполагающей, что в bcr сосредотачиваются точки первичных разрывов хромосом. Однако, как уже говорилось выше, наиболее-хорошо изученные в настоящее время кластеры хромосомных разрывов могут быть результатом селекции клеточных клонов. Правомерен вопрос о том, существуют ли вообще кластеры первичных разрывов и если да, то какова роль пространственной организации ДНК в возникновении таких кластеров? Для ответа на первую часть вопроса необходимо обратить внимание на те гены, перестройки которых не могут дать клетке каких либо селективных преимуществ. Понятно, что в подавляющем большинстве случаев перестройки таких генов не представляют большого практического интереса, в силу чего их не изучали. Существуют, однако, некоторые исключения. Речь идет о генах, перестройки которых приводят к наследственным заболеваниям. В плане обсуждаемой нами проблемы наибольший интерес представляет ген дистрофина человека. По понятным причинам перестройки этого гена активно изучались. Оказалось, что позиции разрывов внутри этого гена распределены не случайно. Существуют две горячие зоны рекомбинации. В данном случае есть веские основания полагать, что в этих горячих точках сосредотачиваются именно первичные разрывы, так как продукт гена дистрофина не важен для жизнеспособности клетки, а играет роль лишь на" уровне организации мышечной ткани. Недавно в нашей лаборатории была построена карта организации гена дистрофина в петли-домены [47]. При этом была выявлена хорошая корреляция между позициями горячих точек рекомбинации и позициями протяженных зон прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу. В другой работе нашей лаборатории было продемонстрировано, что Ьсг-участш генов АМЫ и ЕЮ содержат S/MAR элементы и прикреплены к ядерному матриксу даже в тех клеточных линиях, где эти гены не перестроены. В совокупности с цитированными выше данными о том, что S/MAR элементы и участки расщепления ДНК топоизомеразой II присутствуют в большинстве изученных bcr, эти результаты указывают на то, что пространственная организация ДНК в ядре вносит существенный вклад в определение позиций хромосомных перестроек. Понятно, что эта проблема нуждается в дальнейшем изучении.
На данный момент положение S/MAR элементов определено только в двух генах, часто подверженных перестройкам — MLL и АМЫ. При этом продемонстрировано, что S/MAR элементы колокализуются с bcr. Получена также некоторая информация о расположении S/MAR в гене AF9 (за исключением длинных интронов 2 и 3 [26]). В гене AF4 картирование S/MAR элементов проводилось только в Лсг-содержащих областях [26], в силу чего нельзя сказать, отличаются ли эти области от остальной части гена. Гены MLL [48], АМЫ [49] и ЕЮ [49] также изучались на предмет in vivo расщепления ДНК- топоизомеразой П. В этих случаях, опять-таки, рассматривались не целые гены, а только их bcr-содержащие участки. Понятно, что в плане обсуждаемого нами вопроса наиболее интересным представляется сравнение кластеров разрывов с остальными частями генов. Такую работу еще предстоит проделать.
Следует сказать о том, что пространственная организация ДНК в ядре влияет определенным образом на частоту транслокаций между различными хромосомами. Дело в том, что расположение хромосом (точнее, хромосомных территорий) в интерфазном ядре не является случайным [50-51]. Территории богатых генами хромосом (например, человеческих хромосом 9 или 19) находятся вблизи от центра ядра, а бедных генами (18 или 22) — ближе к ядерной периферии [52-53]. Локализация нескольких хромосомных территорий на одной и той же «ядерной орбите» существенно увеличивает вероятность рекомбинации между ними. Так, территории хромосом 9 и 22, почти равных по генной плотности, расположены на одной «орбите» — и транслокации между ними происходят относительно часто. В некоторых случаях специфичные хромосомы не просто находятся на общей ядерной орбите, а остаются ассоциированы друг с другом на протяжении всего клеточного цикла (или некоторых его фаз) [39]. Подробное обсуждение пространственной организации хромосом в интерфазном ядре и ее роли в осуществлении хромосомных перестроек выходит за рамки настоящего обзора. Дополнительную информацию можно найти в работах [54-55]. Принимая во внимание все данные, изложенные выше, наиболее вероятный вывод выглядит так: наблюдаемые в опухолевых клетках кластеры точек разрыва в действительности представляют собой результат того, что анализировались клоны опухолевых -клеток, сохранившиеся в ходе отбора из популяции клонов с многочисленными и рассредоточенными первичными транслокациями. Существование кластеров точек разрыва наглядно подтверждает хорошо известный в астрофизике антропный принцип: Вселенная такова, какой мы ее наблюдаем, просто потому, что в любой другой мы просто не смогли бы возникнуть [56]. Аналогично, положения точек разрыва при перестройках таковы, какими мы их наблюдаем, потому что все остальные перестройки никак не проявляются фенотипически или детальны для клетки. Эта гипотеза не исключает, однако, того, что в некоторых (а может быть, и во многих) случаях первичные точки разрыва могут быть уже кластеризованы вокруг или внутри подобных «функционально значимых» кластеров, как это, по-видимому, происходит в случае MLL или AML1. По-видимому, ядерная архитектура каким-то образом вовлечена в определение позиций транслокаций. Существование первичных кластеров разрыва не противоречит идее последующего отбора вариантов. Не вызывает особого удивления и то, что в ряде случаев кластеры первичных разрывов могут располагаться между фрагментами гена, кодирующими различные функциональные домены белков. В соответствии с общепринятой моделью, функциональные белковые домены представляют собой исторические единицы эволюции белка [57]. Предковые домены (а точнее, кодирующие их фрагменты ДНК) подвергались перетасовке в процессе эволюции, что привело к образованию современных белков. Возможно, гены, кодирующие современные белки могут содержать некоторые следы этих древних событий. Границы между доменами на генном уровне все еще могут быть более подвержены рекомбинации, чем тела доменов.
Радиоактивное мечение олигонуклеотидов и гибридизация их с ДНК
Плазмидную ДНК в количестве 1 мкг инкубировали 30 мин при 37С с 1 ед" топоизомеразы II (Topogen) в буфере для декатенации (50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 120 мМ КС1, 100 мМ MgCl2, 0,5 мМ АТФ, 0,5 мМ ДТТ и 30 мг/мл БСА) в общем объеме 30 мкл. После этого к реакционной смеси добавляли 1,2 мкл 0,5М EDTA и 3 мкл 5М NaCl, выдерживали 10 мин при 30 С для инактивации топоизомеразы и экстрагировали последовательно одним объёмом фенола, одним объёмом смеси фенол-хлороформ и одним объёмом хлороформа. Затем добавляли в качестве носителя линейный акриламид до конечной концентрации 15 мкг/мл, 2,5 объёма 96% этанола и центрифугировали 12 мин при 13200 об/мин на центрифуге Eppendorf 5415R. Осадок растворяли в 20 мкл (ШНгО, трансформировали полученным препаратом компетентные клетки и высевали половину на чашку Петри с LB-агаром и ампициллином, а половину - на чашку с агаром, ампициллином и 5мМ ИПТГ. Отмечали на чашке с ампициллином несколько колоний, штрихом переносили их на чашку с ИПТГ и растили ночь в термостате при 37 С. В том случае, если на чашке с ИПТГ бактериальные клетки не вырастали, из отмеченных колоний растили ночную культуру в жидкой среде LB с ампициллином. Из выросших бактерий выделяли плазмидную ДНК, как описано ранее, и проверяли рестриктным анализом. Гомогенность полученного препарата проверяли следующим образом: декатенированные плазмиды, полученные из индивидуальных клонов, повторно декатенировали, трансформировали бактерии и параллельно высевали на чашки с LB-агаром и антибиотиком, содержащей и не содержащей ИПТГ. Если плазмида декатенирована полностью и не содержит исходного вектора, на чашке, содержащей ИПТГ, колоний не вырастает Плазмидную ДІЖ в количестве ОД мкг инкубировали с 5 ед. топоизомеразы. II (Topogen) и 0,3 мкг VM-26 (Bristol-Myers Squibb) в расщепляющем буфере (30 мМ трис-HCl рН 7,6, 60 мМ NaCl, 8 мМ MgCl2, 3 мМ АТФ и 15 мМ 2-меркаптоэтанрл) в течение 30 мин при 37 С (суммарный объем реакции 30 мкл), и выделяли ДНК по описанной в предыдущем разделе методике. Клетки Е. coli трансформировали реакционной смесью и высевали на чашки Петри с LB-агаром и антибиотиком или LB-агаром, антибиотиком и ИПТТ.
Клеточную линию COS-1 (иммортализованные клетки почки африканской зеленой мартышки [144] культивировали в среде DMEM (Dulbecco s modified-Eagle s medium, Пан-Эко) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen), 1% пирувата натрия (Пан-Эко), 0,67 мг/мл L-глутамина (Пан-Эко), 100 ед./мл пенициллина и 100 ед./мл стрептомицина. После достижения монослоя клетки рассевали, для чего их обрабатывали раствором 0,2 % раствором EDTA 1 мин, EDTA сливали и клетки инкубировали в 0,25% растворе трипсина 2-4 мин при 37 С. После этого клетки собирали центрифугированием при 800 об/мин в течение 5 мин в центрифуге Jouan B4i, промывали їх PBS и высевали на культу рал ьные чашки.
За сутки до транфекции высевали на каждую лунку шестилуночного планшета для трансфекции около 0,15 млн. клеток в 2 мл полной среды и растили в инкубаторе до 50-80% монослоя. Растворяли 1 мкг ДНК для трансфекции в 20 мкл культуральной среды без сыворотки. Растворяли 3 мкл унифектина-56 (Unifect Group) в 100 мкл среды без сыворотки (не перемешивая), по каплям добавляли раствор унифектина к раствору ДНК и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Добавляли к раствору 80 мкл среды без сыворотки. По 100 мкл раствора по каплям добавляли в лунку планшета для трансфекции и инкубировали клетки 18 ч в стандартных условиях, после чего выделяли плазмидную ДНК.
Оценку эффективности трансфекции проводили при трансфекции стандартного количества плазмиды pEGFP-Nl (Clontech). После трансфекции клетки собирали как для выделения плазмидной ДНК, осадок клеток ресуспендировали в 50-100 мкл PBS и наносили суспензию на предметное стекло, накрывали покровным стеклом. Препарат просматривали на флуоресцентном микроскопе Leica DMR при освещении видимым светом (видны все клетки) и при освещении светом длиной волны 450-490 нм через зеленый фильтр (видны только те клетки, которые экспрессируют GFP с трансфецированной плазмиды).-Полученные изображения фотографировали на встроенную фотокамеру. Эффективность трансфекции оценивали как отношение числа светящихся клеток к общему числу клеток
Плазмидную ДНК из клеток COS-1 выделяли по ранее описанному методу [145] с незначительными изменениями. Снимали клетки трипсином, как описано выше, после центрифугирования осадок клеток ресуспендировали в 15 мл буфера ТЕ (ЮмМ трис-НС1 рН 8,0, 1мМ ЭДТА рН 8,0) и вновь центрифугировали 5 мин при 800 об/мин на центрифуге Jouan B4i. Осадок ресуспендировали в 500 мкл ТЕ, переносили в пробирку на 1,5 мл, добавляли 100 мкл 5М NaCl и 500 мкл раствора 1% SDS в ТЕ, перемешивали. Реакционную смесь инкубировали во льду 30 мин, центрифугировали 7 мин при 13200 об/мин при 4 С в центрифуге Eppendorf 5415R, переносили супернатант в новую пробирку и экстрагировали половиной объёма фенола (рН 8,0), центрифугировали 5 мин при 13400 об/мин на центрифуге Eppendorf 5410. Верхнюю (водную) фазу отбирали и экстрагировали её равным объёмом смеси фенола и хлороформа (1:1), центрифугировали 1 мин при 13400 об/мин на центрифуге Eppendorf 5410. Водную фазу экстрагировали равным объёмом хлороформа и центрифугировали 1 мин при 13400 об/мин на центрифуге Eppendorf 5410.
После экстракции хлороформом супернатант переносили в пробирку на 2 мл, добавляли 5 мкл раствора линейного акриламида (с концентрацией 15 мкг/мл) и 1 мл 96% этанола, центрифугировали 15 мин при 13400 об/мин на центрифуге Eppendorf 5410. Осадок ДІЖ промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли в 30 мкл dd Н20.
Эписомная репликация модельных плазмид в эукариотических клетках
Для использования в дальнейшей работе полученных модельных конструктов в первую очередь необходимо было проверить, насколько адекватно функционирует ген KIL, находящийся под контролем индуцибельного промотора.. Для этого анализируемую плазмиду трансформировали в две аликвоты клеток Е. coli. После теплового шока в аликвоту «2» добавляли свежеприготовленный ИПТГ до конечной концентрации 2мМ и подращивали в течение 40 мин при 37 С и перемешивании. Затем высевали аликвоту «1» на чашку без ИПТГ, а аликвоту «2» — на чашку, содержащую 5мМ ИПТГ, и растили ночь в термостате. Отсутствие ИПТГ-устойчивых колоний при достаточном большом количестве колоний на чашке без ИПТГ служило подтверждением нормального функционирования гена KIL.
Кроме того, мы проводили дополнительную проверку: колонии с чашки без ИПТГ засевали в жидкую среду LB с ампициллином и в жидкую среду LB с ампициллином и ИПТГ, и растили ночь при перемешивании. В том случае, если ген KIL функционирует, культура не растет в жидкой среде, содержащей ИПТГ, и растет в среде без ИПТГ.
Необходимо заметить, что финальные плазмиды могут содержать небольшое число промежуточных продуктов клонирования — катенанов, состоящих из плазмиды, содержащей KIL, «сцепленной» с исходным вектором, не содержащим KIL (рис. 17). После обработки топоизомеразой II в присутствии ингибиторов, топологически связанные интермедиаты могут высвобождаться. Соответственно, при отборе рекомбинантов такие интермедиаты будут вести себя подобно делеционным мутантам, так как они также не содержат ссаВ, и, следовательно, будут давать. колонии клеток, растущих в присутствии ИПТГ. Разумеется, это приведёт к искажению экспериментальных данных. Поэтому препарат ДНК полученного модельного конструкта был предварительно подвергнут декатенированию и затем трансформирован в бактериальные клетки, которые в дальнейшем выращивались в присутствии и в отсутствие ИПТГ. Затем на чашке с ампициллином отмечали несколько колоний и штрихом переносили их на чашку с ИПТГ. В том случае, если на чашке с ИПТГ бактериальные клетки не вырастали, из отмеченных колоний растили ночную культуру в жидкой сред, из которой затем выделяли плазмидную ДНК, и проверяли рестриктным анализом. Гомогенность полученного препарата проверяли следующим образом: декатенированные плазмиды, полученные из индивидуальных клонов, повторно декатенировали, трансформировали бактерии и параллельно высевали на чашки с LB-агаром и антибиотиком, содержащей и не содержащей ИПТГ. Если плазмида декатенирована полностью и не содержит исходного вектора, на чашке, содержащей ИПТГ, колоний не вырастает
Для количественной оценки частоты незаконной рекомбинации препаратами ДНК декатенированных модельных плазмид, подвергшихся воздействию потенциально рекомбиногенных условий, трансформировали бактериальные клетки, половину которых затем выращивали в присутствии ИПТГ (индуктора гена K1L), а другую половину — без ИПТГ. Частота рекомбинации определялась отношением числа ИПТГ-устойчивых колоний к числу колоний, выросших на среде без ИПТГ. Для определения чувствительности системы были посталены контрольные эксперименты: бактериальные клетки трансформировали препаратами ДНК (в количестве 0,1 мкг), не обработанными топоизомеразой II. Количество колоний в таких экспериментах достигало нескольких тысяч (от пяти до двенадцати в зависимости от серии экспериментов) на чашке без ИПТГ, в то время как на чашке с ИПТГ колоний не наблюдалось. Таким образом, модельная система позволяет детектировать события, происходящие с частотой не менее 0,008-0,02%.
Разработанная нами тест-система представляет собой простой и удобный метод количественной оценки незаконной рекомбинации. Следует отметить, что такая система может быть использована для тестирования рекомбиногенных событий, на любых последовательностях ДНК. Для этого достаточно всего лишь заменить в нашей модельной системе Ъсг на интересующие последовательности ДНК. Наша модельная система может быть использована для изучения рекомбиногенного эффекта различных (в том числе лекарственных) соединений, не обязательно являющихся ингибиторами ДНК топоизомеразы II. Тем не менее, система имеет некоторые ограничения; так, рекомбинационные события, не приводящие к делеции гена ccdB, а также рекомбинация между двумя плазмидными молекулами, в данной системе не обнаруживаются. Однако, маловероятно, что механизмы межмолекулярной и внутримолекулярной-рекомбинации имеют принципиальные различия. Наша система, основанная на детекции внутримолекулярной рекомбинации, имеет одно важное преимущество: результаты количественного анализа рекомбинации не зависят от концентрации модельной плазмиды, в то время как для достоверного анализа данных о межмолекулярной рекомбинации (например, происходящих между двумя плазмидами с различными маркерами), необходимо, чтобы концентрация используемых плазмид была абсолютно одинаковой.
В первую очередь мы проанализировали возможность осуществления незаконной рекомбинации в минимальной in vitro системе, содержащей только саму топоизомеразу II, ее ингибитор и субстрат (модельные плазмиды). Для индукции незаконной рекомбинации 0,1 мкг полученной плазмиды инкубировали с 200 ед. топоизомеразы II в присутствии ионов магния и АТФ. В параллельном эксперименте в реакционную смесь добавлялся ингибитор топоизомеразы IIVM-26 (тенипозид). Реакцию останавливали добавлением EDTA до 250мМ и NaCl до 1М,. после чего выделяли ДНК, и проводили описанный выше тест на наличие делеционных мутантов. В случае использования в качестве субстрата плазмиды pKIL2BCR-ori количество колоний, выросших на среде без ИПТГ было около двух тысяч. При этом нам не удалось обнаружить продукты незаконной рекомбинации ни при эксперименте с тенипозидом, ни без него.
