Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы Плазмидные системы биодеградации хлорированных ароматических соединений
1.1. Плазмиды бактерий 11
1.2. Организация и эволюция путей катаболизма хлорароматических соединений 13
1.3. Ключевые гены и ферменты верхних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот 15
1.4. Ключевые гены и ферменты нижних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот 27
1.5. Плазмида pJP4 - модельная плазмида деградации 2,4-Д 30
ГЛАВА 2. материалы и методы исследований
2.1. Объекты исследований 37
2.2. Получение чистых культур штаммов-деструкторов 37
2.3. Идентификация штаммов 38
2.3.1. Классификация штаммов по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам 38
2.3.2. Определение морфологических и морфометрических характеристик клеток методом электронной микроскопии 38
2.3.3. Молекулярно-биологическая идентификация штаммов на основе секвенирования гена 16S рРНК 39
2.3.3.1.Выделение и характеристика суммарной ДНК 39
2.3.3.2. Амплификация, секвенирование и анализ последовательностей генов 16SpPHK 39
2.4. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет 41
2.5. Определение количеств хлорированных феноксиуксусных кислот в культуральной жидкости 42
2.6. Идентификация продуктов метаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот 43
2.7. Выделение плазмидной ДНК 44
2.8. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле 44
2.9. Обработка препаратов плазмид рестриктазами и определение размеров фрагментов ДНК 45
2.10. Элиминация плазмид, индуцированная акридиновым оранжевым 45
2.11. Определение устойчивости бактерий к антибиотикам и тяжелым металлам 46
2.12. Трансформация штаммов 47
2.12.1. Приготовление компетентных клеток 47
2.12.2. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК 47
2.13. Конъюгация клеток бактерий 48
2.14. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре 49
2.14.1. Получение радиоактивного зонда методом замещения нуклеотидов 49
2.14.2. Иммобилизация плазмидной ДНК на нитроцеллюлозном фильтре 49
2.14.3. Дот-блот гибридизация препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре 50
2.15. Физико-химические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т) 50
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1.Идентификация штаммов 33-4ch, 36D и 36Т на основе морфолого-морфометрических, физиолого-биохимических признаков и анализа последовательностей генов 16S рРНК 52
3.1.1. Морфолого-морфометрические признаки штаммов 52
3.1.2. Физиолого-биохимические признаки штаммов 58
3.1.3. Анализ последовательностей генов 16S рРНК штаммов 33-4ch, 36D и 36Т 62
3.2. Динамика конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T в периодической культуре 66
3.3. Анализ этапов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T 72
3.4. Анализ плазмидного статуса клеток штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T 76
3.5. Участие плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T в генетическом контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот 80
3.6. Локализация детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмид ах pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T 83
3.7. Горизонтальный перенос плазмид RP33-4ch, pRP36D и pRP36T и экспрессия функций катаболизма и резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам в других хозяевах 85
3.8. Дот-блот гибридизация препаратов плазмид pRP33-4ch, pRP36D, рКР36ТирЛ 90
Выводы 92
Список литературы 93
- Ключевые гены и ферменты верхних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот
- Определение количеств хлорированных феноксиуксусных кислот в культуральной жидкости
- Физико-химические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т)
- Локализация детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмид ах pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T
Введение к работе
Актуальность проблемы. В современном мире хлорированные ароматические соединения широко используются в качестве компонентов пестицидов, хладагентов, красителей, растворителей, лекарств, в их составе поступают в окружающую среду. Большинство таких соединений опасны для человека и животных, а некоторые из них, например, хлорфеноксиуксусные кислоты, применяемые в качестве пестицидов и гербицидов, используются именно вследствие своей токсичности.
Известно, что микробная деградация является основным процессом,
приводящим к разрушению сложно утилизируемых соединений в природных
условиях. Штаммы бактерий, изолированные из загрязненных биотопов,
обладают высоким метаболическим потенциалом и генетической
пластичностью, которая в значительной степени обусловлена наличием в их
геномах внехромосомных элементов - плазмид. Автономно существуя в
бактериальных клетках-хозяевах, плазмиды способны к длительному
самоподдержанию, саморегуляции и самовоспроизведению.
Конъюгативность или трансмиссивность многих плазмид, заключающаяся в их способности к переходу от одних клеток-хозяев к другим, является одним из важнейших свойств этих внехромосомных элементов. Представляется закономерным, что формирование и дальнейшая эволюция новых субстратных специфичностей у прокариот происходит, как правило, на уровне плазмидных генов, контролирующих первичные этапы окисления субстратов, в то время как гены центральных путей часто имеют хромосомную локализацию (Ribbons, Eaton, 1982).
До недавнего времени исследования разнообразия молекулярно-генетических систем катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот касались в основном плазмиды деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) pJP4 штамма Ralstonia eutropha JMP134 (Don et al., 1985; Kasberg et al., 1995; Plumeier et al., 2002) и ее гомологов. Вместе с тем, организация большинства плазмид катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот до сих пор остается
неизвестной. Несомненно, что изучение структурной организации новых D-плазмид, выделенных из природных штаммов, будет способствовать более глубокому пониманию эволюционных процессов, лежащих в основе возникновения и становления путей биодеградации ксенобиотиков, в том числе, хлорфеноксиуксусных кислот. Кроме того, исследование микробиологических процессов деградации на молекулярном уровне имеет важное экологическое значение с точки зрения возможного целенаправленного использования бактерий и их генетического пула в технологиях очистки окружающей среды нового поколения. Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось выявление особенностей структурно-функциональной организации плазмидных систем деградации хлорфеноксиуксусных кислот новых природных штаммов бактерий, выделенных из загрязненных биотопов.
Задачи:
идентифицировать штаммы-деструкторы хлорфеноксиуксусных кислот, в соответствии с молекулярным критериям систематики;
исследовать пути метаболизма молекул хлорфеноксиуксусных кислот и получить количественные и качественные характеристики процессов конверсии субстрата;
выявить роль плазмид в генетическом контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот;
изучить структурно-функциональные особенности D-плазмид катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, а именно:
4.1. установить размер и характер полиморфизма длин рестрикционных фрагментов плазмид;
показать плазмидное детерминирование процессов деградации хлорфеноксиуксусных кислот, а также устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов;
определить возможность горизонтального переноса плазмид и их экспрессии в разных бактериальных хозяевах;
выявить уровень гомологии плазмид с модельной плазмидой pJP4 штамма Ralstonia eutropha JMP134.
Объекты исследований. Объектами исследования служили природные штаммы бактерий, выделенные из почв, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства.
Научная новизна исследования. Выделены новые штаммы бактерий-
деструкторов 4-хлорфеноксиуксусной (4-ХФУК), 2,4-
дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной (2,4,5-Т)
кислот. Установлено, что последовательности генов 16S рРНК штаммов
идентичны и наиболее близки к последовательности типового штамма
Raoultella planticola. На примере R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R.
planticola 36T впервые описаны процессы использования молекул 4-ХФУК,
2,4-Д, 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии для
представителей рода Raoultella. Среди метаболитов деградации были
выявлены хлорфеноксиуксусная (для 2,4-Д и 2,4,5-Т), феноксиуксусная (для
4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т) и 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновая кислоты (для 4-
ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т). Эти данные свидетельствуют о наличии общего пути
деградации этих хлорфеноксиуксусных кислот. Установлено, что процесс
деградации хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов R. planticola 33-4ch, R.
planticola 36D и R. planticola 36T находится под контролем плазмид, которые
получили следующие обозначения: pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T. Поэтому
плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T были квалифицированы как новые
плазмиды деградации (или D-плазмиды). Обнаружен полиморфизм
вышеуказанных плазмид по ВатН I -, Hind III - и Pst I - сайтам рестрикции и
определены их размеры, которые составили для pRP33-4ch и pRP36T-ПОтпн, а для pRP36D-127 тпн. Выявлено, что на исследованных плазмидах, помимо генов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, локализованы детерминанты резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Установлено, что плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T являются конъюгативными и способны экспрессировать катаболические функции деградации хлорированных феноксиуксусных кислот, а также функции резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов в другом бактериальном хозяине. Выявлено, что исследованные плазмиды не имеют существенной гомологии с плазмидой деградации 2,4-Д pJP4 Ralstonia eutropha JMP134.
Практическая значимость работы. Полученные данные раскрывают особенности строения молекулярно-генетических систем катаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот и вносят существенный вклад в понимание процессов формирования и эволюционирования путей биодеградации ксенобиотиков. Сведения о новых D-плазмидах расширяет представления о молекулярных механизмах адаптации бактерий к утилизации синтетических субстратов, которые ранее не присутствовали в окружающей среде. Выделенные штаммы и их плазмиды могут быть применены для создания новых штаммов-деструкторов in vitro, а также в разработках технологий очистки окружающей среды нового поколения.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работы VIII-го Экологического конгресса (Корея, 2002), Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), конференции ELSO (Германия, 2003), 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 2-го Международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Москва, 2004), 7-ой и 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2005), международной конференции «Проблемы
биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005).
Гранты. Работа была проведена при содействии Программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых», РФФИ №02-04-97911, и трех Грантов ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России», в том числе, исследовательского гранта Э0029, гранта № 3 4312 на проведение стажировки и гранта № Д 3278/12742003 для участия в работе Первого Конгресса европейских микробиологов (Словения, Любляна 2003г).
Публикации. Результаты диссертации изложены в 10 печатных работах.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 114 страницах, содержит 20 рисунков и 11 таблиц. Библиография включает 171 наименование, из них 12 отечественных и 159 зарубежных.
Ключевые гены и ферменты верхних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот
Представители одного из генных семейств имеют высокий уровень гомологии с tfdA геном плазмиды pJP4 штамма R. eutropha JMP134 и часто локализуются на плазмидах широкого круга хозяев (Top, Holben, Forney, 1995). Представители второго генного семейства характерны исключительно для бактерий рода Burkholderia штаммов RASC и TFD6 (Matheson et al., 1996; Suwa et al., 1996). Интересно, что гены этого семейства имеют хромосомную локализацию и обладают 77%-ой гомологией с геном tfdA плазмиды pJP4. Результаты анализа нуклеотидной последовательности представителей третьей группы показало их сходство, но не идентичность с геном tfdA бактерий рода Burkholderia. Генами третьего филогенетического семейства обладают штамм I-18, относящийся к семейству Halomonadaceae (Top, Maltseva, Forney, 1996), Rhodoferax fermentas 6-9 (Fulthorpe et al., 1995) и Alcaligenes paradoxus TV1 (Top, Maltseva, Forney, 1996). Эти штаммы, представляющие (3- и у- подгруппы Proteobacteria, были изолированы из различных географических районов США, Канады и Франции.
Фермент TfdA имеет гомологию (-30%) по аминокислотной последовательности с группой сульфат-деградирующих а-кГ-зависимых диоксигеназ (Eichhorn et al., 1997; Hogan, Auchtung, Hausinger, .1999) и алкилсульфатэфирдеградирующих а-кГ - зависимых диоксигеназ (Kahnert, Kertesz, 2000). Имеется сходство также в нуклеотидной последовательности гена tfdA (-30% гомологии) с последовательностями (/24-подобных генов бактерий, изолированных из образцов некоторых сельскохозяйственных почв (Hogan et al., 1997). Из данных ряда авторов известно, что помимо 2,4-Д субстратной активности, TfdA может катализировать трансформацию различных феноксиуксусных, тиофеноксиуксусных и феноксипропионовых кислот (Fukumori Hausing, 1993b; Saari, Hausinger, 1998). Кроме того, субстратом для а-кетоглутаратдиоксигеназы могут служить производные фенилакриловой (коричной) кислоты например: 2,4-дихлорофенилакриловая кислота. Интересно, что 2- или 4-монохлорофенилакриловые кислоты являются более сложными субстратами, а незамещенная фенилакриловая кислота практически не катаболизируется этим ферментом. (Hotopp, Hausinger, 2001). Известно, что замещенные фенилакриловые кислоты синтезируются растениями в значительных количествах и широко представлены в природе. Основываясь на субстратной специфичности TfdA, было высказано предположение, что, возможно, существовал предковый ген, кодирующий фермент с высокой специфичностью к природным субстратам (фенилакриловым кислотам). Мутационные события вызвали ослабление его специфичности по отношению к первоначальным субстратам и усиление - по отношению к новому субстрату 2,4-Д (Hotopp, Hausinger, 2001). Затем гомологи гена tfdA могли захватываться катаболическими плазмидами, несущими гены tfdB и tfdCDEF, что, возможно, привело к образованию катаболических плазмид, обладающих полным набором генов деградации 2,4-Д (Top, Holben, Forney, 1995).
Помимо узнавания и инициации катаболизма, ферменты верхних путей модифицируют (хлор)ароматический субстрат, активируя и подготавливая его таким образом к расщеплению. При всем множестве возможных реакций у всех аэробных бактерий наблюдается общая реакция, а именно: моно- или диоксигенирование, в результате которого образуется дигидроксильные производные бензольного кольца. Катехол, протокатехоат или их производные могут образовываться в результате активности двух различных ферментных систем: диоксигеназ ароматического кольца или монооксигеназ (однокомпонентные гидроксилазы). Оксигеназы первичной микробной атаки ароматических углеводородов характеризуются общими принципами структурно-функциональной организации и представляют собой короткие цепи переноса электрона, в функционировании которых важное значение играют внутриклеточные мембраны. Все оксигеназы - это белки, комбинированные с небелковыми кислород-реагирующими группами, такими как железо, флавин и ионы переходных металлов (Entsch, van Beckel, 1995; Leahy et al., 2003).
Однокомпонентные (флавинсодержащие) гидроксилазы, являются особенно востребованными при деградации галогенированных соединений (van der Meer, 1997). Монооксигеназы этой группы индуцируют разрыв связи 0-0 (молекулярного кислорода воздуха) и вводят один атом кислорода в субстрат, а второй - восстанавливают до Н20. Все истинные монооксигеназы имеют три субстрата: 1) NAD(P)H - используется для восстановления флавина; 2) субстрат окисления (органическое соединение); 3) молекулярный кислород, который является сильным окислительным агентом (Massey, 1994). Флавопротеиновые оксигеназы, участвующие в путях конверсии (хлор)ароматических соединений, почти всегда атакуют позиции углерода с высокой электронной плотностью, подходящей для замещения. В этом состоит их главное отличие от других монооксигеназ, таких как цитохромы Р450 (Dawson, 1988), которые способны вводить кислород практически в любую углеродную связь. Флавопротеиновые монооксигеназы лимитированы типом окисления, которое возможно с кислородом в отсутствии ионов металлов (Entsch, van Beckel, 1995). К этой группе ферментов относится 2,4-дихлорфенолгидроксилаза (кодируемая геном tfdB плазмиды pJP4) (Perkins et al., 1990), а также хлорфенол-4-монооксигеназа штамма Burkholderia cepacia АСІ 100 (Martin et al., 1999; Gisi, Xun, 2003).
Диоксигеназы ароматического кольца представляют собой мультикомпонентные комплексы, состоящие из ферредоксина, флавопротеина и обязательного компонента МАЕ)(Р)Н-зависимой терминальной оксидазы, которая, собственно, и осуществляет инкорпорирование двух атомов кислорода в молекулу субстрата, приводя к образованию реактогенного диола, легко доступного последующему действию дегидрогеназ (van der Meer, 1997). По строению и количеству субъединиц диоксигеназы ароматического кольца делятся на несколько классов (Harayama, 1992; Mason, Cammack, 1992; Powlowski, Shingler, 1994).
Класс IA включает диоксигеназы, образуемыми двумя субъединицами, например, фталатдиоксигеназа (Nomura, et al., 1992) и З-хлорбензоат-4,5-диоксигеназа (Nakatsu, Wyndham, 1993). В классе IB диоксигеназы ароматического кольца имеют три субъединицы, две из которых формируют терминальную оксигеназу, а третья является флавинсодержащим белком с ферредоксин АІШ-редуктазной активностью. Примерами ферментов этой группы являются бензоат-1,2-диоксигеназа или толуат-1,2-диоксигеназа. Самые большие диоксигеназы ароматического кольца (II и III классы) образуются из четырех субъединиц, к ним относятся толуолдиоксигеназа, бифенилдиоксигеназа или нафталиндиоксигеназа. Кластерный анализ большого количества генов диоксигеназ этой группы показал, что все классы являются родственными по большой субъединице терминальной оксигеназы, хотя ферменты класса ІА сохраняют наибольшую дистанцию от ферментов классов II и III. За исключением ферментов этого класса, все остальные имеют малую субъединицу терминальной оксигеназы (Neidle, 1991).
Определение количеств хлорированных феноксиуксусных кислот в культуральной жидкости
Анализ содержания хлорированных феноксиуксусных кислот в культуральной жидкости проводили согласно руководству «Методы определения микроколичеств пестицидов» с небольшими модификациями (1984). Для анализов отбирали 5мл культуральной жидкости. Пробы освобождали от клеток штамма центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляли добавлением нескольких капель 2н соляной кислоты до рН2. В каждую пробу в качестве стандарта добавляли при определении 4-ХФУК - 2,4,5-Т, при измерении 2,4-Д - 2,4,5-Т, а для 2,4,5-Т - 2,4-Д до конечной концентрации 100 мг/л. Затем из проб проводили 3-кратную экстракцию хлорфеноксиуксусных кислот равными объемами хлороформа. Далее хлороформ удаляли отгонкой на вакуумном роторном испарителе. Экстракты хлорфеноксиуксусных кислот метилировали, переводили в гексан и фракционировали методом тонкослойной хроматографии. Для тонкослойной хроматографии использовали пластины силуфол UV-254 (Чехия). Сканирование образцов проводили при длине волны 260-280 нм в камере Хромоскана (Jouce-Loebl, Великобритания). Для визуальной оценки результатов хроматографии пластины обрабатывали 0,001% раствором бромкрезолового зеленого в 96% этаноле. Содержание хлорфеноксиуксусных кислот определяли по калибровочному графику для чистого стандарта.
Для идентификации продуктов метаболизма 4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т проводили отбор проб по 5 мл культуральной жидкости в ходе инкубации штаммов. Пробы освобождали от бактериальных клеток центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин. Далее проводили 3-х кратное экстрагирование равными объемами хлороформа и эфира 4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т и продуктов их деградации. Затем хлороформ и эфир удаляли отгонкой на роторном вакуумном испарителе. Экстракты метилировали свежеприготовленным диазометаном, переводили в гексан. Затем объединяли по 0,2 мл из каждой полученной пробы и объединенную пробу подвергали анализу.
Идентификацию продуктов метаболизма хлорфеноксиуксусных кислот проводили на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360. Условия определения: капиллярная колонка 15м х 0,25мм, привитая фаза ДВ-1, растворитель - гексан, температура инжектора +200С, интерфейса +250С, колонки от +80С до +250С, скорость нагрева 3,5 мин. Масс-спектры электронного удара получали при температуре источника ионов, равной +250С, энергии электронов, равной 70эВ.
Идентифицировали полученные соединения, анализируя совокупность данных о сроках удерживания соединений в хроматографической колонке и данных анализа масс-спектров, основанных на зависимости структура-характер распада. Данные интерпретировали, используя «внутренний интеллект» системы обработки данных MS HP ChemStation, содержащей библиотеку из 138000 масс-спектров Base Date WILEY138L.
Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса с небольшими модификациями (Маниатис и др., 1984). Биомассу наращивали при +30С на термостатированной качалке УВМТ-12-250 до достижения значения ОД590 равного 0,8 ОЕ. Затем клетки собирали центрифугированием в течение 7 минут при 5000 об/мин и суспензировали в 2 мл буфера, содержащего 25% сахарозы; 50 мМ Трис-HCl рН 8,0; 50 мМ ЭДТА; ЮмМ NaCl; 3-5мг лизоцима. Затем к лизату добавляли 4 мл смеси 0,2 М NaOH и 1% SDS и выдерживали до просветления. Далее смесь нейтрализовали 0,75 объемами ЗМ охлажденного ацетата натрия. Через 20 минут выдержки при +4С лизат центрифугировали в течение 2 часов при 18000 об/мин и температуре +4С. К супернатанту добавляли РНКазу А до конечной концентрации 2 мкг/мл и выдерживали при комнатной температуре в течение 40 минут. Смесь 2 раза депротеинизировали фенолом с рН 8,0 и 1 раз хлороформом. Нуклеиновые кислоты осаждали 2,5 объемами этанола. Осадок собирали центрифугированием в течение 30 минут при 10000 об/мин, затем подсушивали на воздухе и растворяли в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl с рН 7,4; 1мМ ЭДТА; 10 мМ NaCl.
Фракционирование препаратов ДНК осуществляли методом электрофореза по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). Агарозный гель готовили из расчета 1 г агарозы на 100 мл раствора трис-ацетатного буфера следующего состава: 15 мМ ЭДТА; 100 мМ CH3COONa; 400 мМ Трис-HCl рН 7,5. Проводили электрофорез при напряжении 25В в течение 16 часов. Исследуемые пробы нуклеиновых кислот смешивали с буфером, содержащем 5% глицерина и краситель (0,025% бромфенолового синего или 0,025% ксиленцианола). По окончании электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидиума в концентрации 0,5 мкг/мл. После окрашивания гель просматривали в проходящем УФ-свете и фотографировали на пленку "Микрат-300" через светофильтр ОС - 12.
Ферментативное расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили по стандартной методике согласно рекомендациям производителя (Promega, США). Изображение разделившихся фрагментов ДНК получали после окрашивания и фотографирования геля, как указано выше. В качестве маркера брали препарат ДНК фага X, рестрикцированный Hindlll и Pstl. Для определения размеров фрагментов ДНК использовали пакет программ Gel Analysis.
Элиминацию плазмид проводили согласно стандартной методике с небольшими модификациями (Герхард, 1990). Вначале проводили подбор оптимальной концентрации элиминирующего агента (акридинового оранжевого), для чего из культуры анализируемого бактериального штамма, находящейся в фазе логарифмического роста, отбирали аликвоты и вносили по 10 - 10 клеток в пробирки с МПБ. В МПБ отдельно добавляли акридиновый оранжевый в следующих концентрациях: 5 мг/мл, 50 мг/мл, 500 мг/мл, 1000 мг/мл. Культуры выдерживали в течение ночи при температуре +30С. Затем отбирали образец, в котором появлялась едва заметная мутность, и высевали его аликвоту на мясопептонный агар (МПА), после чего проверяли отдельные колонии на потерю функций, определяемых плазмидами. Для подтверждения потери плазмид проводили выделение и фракционирование препаратов плазмидной ДНК по вышеописанной методике.
Физико-химические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т)
На следующем этапе работы были получены физиолого-биохимические характеристики исследуемых объектов. Бьшо установлено, что клетки штаммов 33-4ch, 36D и 36Т на плотных средах образуют крупные гладкие блестящие колонии выпуклой формы, слизистой консистенции. Оптимальный рост культур наблюдался в пределах от +22С до +37С, при значениях рН близких к нейтральным. Окраска по Граму отрицательная. Определено отношение штаммов к различным источникам углерода, оксидазная и каталазная активности. Результаты определения физиолого-биохимических характеристик исследуемых штаммов суммированы в таблицах 3,4 и 5.
На основании анализа выявленных физиолого-биохимических и культурально-морфологических признаков штаммы были идентифицированы как бактерии, принадлежащие к роду Klebsiella (Определитель бактерий Берджи, 1997).
Род Klebsiella относится к семейству Enterobacteriaceae, он объединяет палочковидные неподвижные хемоорганотрофные факультативно-анаэробные бактерии, которые обитают в воде, почве, в пищевых продуктах, в кишечнике и дыхательных путях млекопитающих, включая человека, птиц.
Можно отметить, что в настоящее время таксономия рода Klebsiella строится на номенклатуре, отражающей их историю. Первоначально, медицинское значение рода Klebsiella, привело к его подразделению на три вида, которые были обозначены соответственно вызываемым заболеваниям: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, и Klebsiella rhinosderomatis. Позднее была выделена группа "oxytocum" (Jain, Radsak, Mannheim, 1974), а природные штаммы рода Klebsiella, предварительно классифицированные как «Klebsiella - подобные организмы» (Gavini et al., 1977), образовали четыре новых вида: Klebsiella terrigena (Izard et al., 1981), Klebsiella ornithinolytica (Sakazaki et al., 1989), Klebsiella planticola (Bagley, Seidler, Brenner, 1981) и Klebsiella trevisanii (Ferragut et al., 1983). Последние два вида были впоследствии объединены в один - К planticola, на основе их значительной ДНК-ДНК гомологии (Gavini et al., 1986). В редакции Bergeys Manual of Systematic Bacteriology 1984 г. род Klebsiella подразделяется на пять видов, а именно: К. pneumoniae, Klebsiella oxytoca, К. terrigena, К. ornithinolytica и К. planticola. Вид К. pneumoniae составляют три подвида: К. pneumoniae subsp. pneumoniae, К pneumoniae subsp. ozaenae, и К. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis. Указанная классификация основана на нумерологической таксономии, использующей фенотипические, биохимические признаки и данные ДНК-ДНК гибридизации (Brenner, Falkow, 1971; Wayne et al,, 1987). Однако в современной систематике при классификации микробных объектов предпочтение отдается использованию молекулярных критериев.
В настоящее время в основу определения бактериальных видов положен уровень гомологии последовательностей генов 16S РНК (Stackebrandt, Goebel, 1994), а использование многоэтапной таксономии обеспечивает хорошо сбалансированную детерминацию таксономических отношений (Vandamme et al., 1996). Сравнение по 16S рРНК последовательности является одним из самых эффективных инструментов для исследования бактериальной филогении (Woese, 1987; Weisburg et al., 1991) и его использование приводило к реклассификации бактериальных видов и родов (Brenner et al., 1993; Tamura et al., 1995; Rikihisa et al., 1997), включая энтеробактерии (Kwon et al., 1997; Sproer et al., 1999).
Следует отметить, что до недавнего времени члены семейства Enterobacteriaceae не являлись предметом интенсивной классификации на основе молекулярно-генетических критериев, в то время как некоторые роды были исследованы в деталях, например Yersinia (Ibrahim et al., 1994), Salmonella (Chang et al., 1997; Christensen, Nordentoft, Olsen, 1998), Serratia (Dauga, Grimont, Grimont, 1990; Harada, Oyaizu, Ishikawa, 1996) и Erwinia (Kwon et al., 1997; Hauben et al., 1998).
Новейшие результаты анализа последовательности генов 16S рРНК штаммов рода Klebsiella показали гетерогенную таксономическую структуру этого рода. По данным ряда авторов, род Klebsiella состоит из трех филогенетических линий: кластер I составляют подвиды К pneumoniae: pneumoniae, ozaenae и rhinoscleromatis; кластер II - К. ornithinolytica, К. planticola и К. terrigena; в кластер III входит только один вид К. oxytoca (Carter et al., 1999; Drancourt et ah, 2001).
Дифференциация на генном уровне трех кластеров рода Klebsiella подтверждается характерным ростом при низкой температуре членов кластера II, что понятно, учитывая их естественную среду обитания на листьях растений, в почве и воде. Представители кластера I не растут при +10С и в основном выделяются из тканей млекопитающих. Кроме того, только члены кластера II растут в присутствии L-сорбозы - источнике углерода, характерном для растений. Таким образом, экологические и фенотипические данные отражают эволюционное разделение этих трех кластеров.
Вследствие того, что штаммы 33-4ch, 36D и 36Т были выделены из почвенных местообитаний, а также вследствие характерного роста при +10С и утилизации L-сорбозы (табл. 3, 4, 5) в качестве единственного источника углерода, штаммы были отнесены к кластеру II рода Klebsiella. В 2001 г. этот филогенетический кластер энтеробактерий, содержащий виды К. planticola, К. ornithinolytica и К. terrigena, был выделен в новый род Raoultella (Drancourt et al., 2001), поэтому изучаемые штаммы следует идентифицировать как принадлежащие роду Raoultella.
Для уточнения филогенетического положения штаммов 33-4ch, 36D и 36Т был проведен их анализ на основе секвенирования последовательностей генов 16S рРНК. Первичный анализ секвенированных фрагментов, содержащих вариабельные участки нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК, показал, что штаммы принадлежали к филогенетической подгруппе энтеробактерий гамма-подкласса протеобактерий. Для окончательного анализа были секвенированны почти полные последовательности (не менее 1400 нуклеотидов, соответствующие позициям 42-1481 тпн по номенклатуре E.coli) генов 16S рРНК.
Локализация детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмид ах pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T
Задача следующего этапа работы заключалась в получении более полных характеристик катаболических плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T.
Известно, что на больших конъюгативных плазмидах могут располагаться детерминанты экологически важных признаков, в частности, такие как устойчивость к антибиотикам и солям тяжелых металлов.
Механизм резистентности к антибиотикам, реализуемый через плазмиды, в основном направлен на инактивацию самого соединения, поступающего в клетку; кроме того, уменьшение концентрации вредного агента может достигаться за счет усиленного выведения его из клетки (тетрациклин), или могут возникать новые метаболические пути в обход уязвимого звена (Прозоров, 2000).
Механизмы устойчивости/гомеостаза к действию солей тяжелых металлов являются более разнообразными. Для поддержания гомеостаза клеток микроорганизмов, на уровне микроэлементов необходимы такие катионы металлов, как Со , Си , Fe , Mn , Ni и Zn . Другие ионы, например, Cd или РЬ могут усваиваться в комплексе с жизненно важными катионами. Показано, что все ионы в высоких концентрациях являются токсичными для клетки, что делает необходимыми механизмы их гомеостатической резистентности (Rosen, Silver, 1987). Наиболее общим путем предотвращения образования токсичного уровня катионов металлов является их активный отток, катализируемый детерминантами резистентности/гомеостаза металлов (Silver, Phung, 1996). Все организмы, исследованные до сих пор, имеют генетические детерминанты, ответственные за толерантность к солям тяжелых металлов, некоторые из них могут располагаться на плазмидах и транспозонах (Rensing et al., 2002).
Учитывая вышесказанное, исследуемые плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T были охарактеризованы на предмет наличия детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Для этого клетки штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T и их бесплазмидные варианты, были протестированы на селективных средах. В качестве тестируемых признаков были взяты устойчивость к нескольким антибиотикам: тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину, биомицину и стрептомицину; а также к некоторым ионам тяжелых металлов: Си2 ", Са2+, Сг +, Со2+,Ре3+(табл.9).
Как видно из результатов таблицы сравнительного тестирования плазмидных и бесплазмидных штаммов, pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T содержат общие детерминанты устойчивости к антибиотикам: тетрациклину, хлорамфениколу и канамицину. Плазмида pRP36D обладает также дополнительными генами резистентности к биомицину и стрептомицину. Отметим, что эта плазмида имеет больший размер по сравнению с pRP33-4ch и pRP36T.
На исследованных плазмидах также были обнаружены детерминанты устойчивости к солям тяжелых металлов. Гены устойчивости к меди (И), железу (III) и кадмию (II) были локализованы на всех трех плазмидах. Однако устойчивость к кобальту (II) была характерна только для pRP33-4ch, резистентность к серебру (I) была свойственна для pRP36T, а устойчивость к хрому (ДО) - для pRP36D.
Таким образом, плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T имеют значительные структурно-функциональные различия.
Локализация генов катаболизма ксенобиотиков, детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмидах позволяет клетке - хозяину в изменяющихся условиях окружающей среды не только продуктивно функционировать и регулировать такие опероны, но и делает эффективным горизонтальный перенос генов, которые склонны к потерям при генном дрейфе (Lawrence, Roth, 1996).
Отметим, что горизонтальный перенос плазмидных генов резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов хорошо известен (Stotzky, Babich, 1986; Trevors, Berg, 1989; Smit, van Elsa, 1990; Top et al., 1990), тогда как количество работ по переносу плазмидных генов деградации в экосистемах ограничено (Fulthorpe, Wyndham, 1991).
Современные исследования показали, что перенос и экспрессия плазмидных генов деградации представляет собой уникальное событие по сравнению с переносом генов устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам по различным причинам.
Так, гены деградации обычно локализуются на больших, низкокопийных плазмидах, которые имеют свои особенности переноса по сравнению с маленькими, высококопийными плазмидами лекарственной устойчивости. Кроме того, кодируемые плазмидами гены катаболизма по разным причинам могут не экспрессироваться в другом хозяине. Например, pJP4 (80 тпн) катаболическая плазмида широкого круга хозяев содержит только часть генов деградации 2,4-Д до 2-хлормалеилацетата и проявляет 2,4-Д фенотип при переносе в микроорганизмы, у которых отсутствует хромосомно-кодируемая малеилацетатредуктаза (Kinkle et al., 1993). В исследовании трансфера плазмиды pJP4, несущей гены деградации, в почвенных популяциях ризобий трансконьюганты детектировались через экспрессию генов резистентности к ртути, тогда как гены деградации 2,4-Д не экспрессировались (Kinkle et al., 1993). Также при мониторинге переноса pJP4, проводимой в чистой культуре, было обнаружено, что гены конверсии 2,4-Д экспрессируются в штаммах Alcaligenes eutrophus, Variovoraxparadoxus и Pseudomonas putida, но не в Escherichia coli, Rhodopseudomonas sphaeroides, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium sp., Pseudomonas fluorescens и Acinetobacter calcoaceticus (Don, Pemberton, 1985). Авторы указывают, что перенос генов деградации ксенобиотиков следует исследовать в совокупности с фенотипической экспрессией этих генов для выявления потенциала различных штаммов к ремедиации.
