Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Дисахаридные нуклеозиды. Особенности структуры. Биологическая активность. Методы синтеза. Включение в олигонуклеотиды . 5
1.1 Природные дисахаридные нуклеозиды 5
1.1.1. Поли(АОР-рибоза) 6
1.1.2. Минорные нуклеозиды - компоненты тРНК 8
1.1.3. Дисахаридные нуклеозиды в составе низкомолекулярных биологически активных соединений 10
1.2 Методы синтеза дисахаридных нуклеозидов 18
1.2.1. Конденсация дисахаридов с нуклеиновыми основаниями (N-гликозилирование) 19
1.2.2. Конденсация моносахаридов с нуклеозидами (О-гликозилирование) 20
1.3 Дисахаридные нуклеозиды в составе олигонуклеотидов 32
Глава 2. Пуриновые дисахаридные нуклеозиды. Синтез и свойства . 44
2.1. Проведение реакции гликозилирования 45
2.2. Изучение стабильности 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-нуклеозидов в условиях реакции гликозилирования 47
2.3. Синтез 3'-0-Р-0-рибофуранозил-2'-дезоксиаденозина 55
2.4. Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозилнуклеоздов 66
2.5. Ингибирование поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 человека дисахаридными нуклеозидами - производными структурного элемента поли(АЛР-рибозы) 73
Глава 3. Экспериментальная часть 76
Выводы 101
Список литературы 102
- Поли(АОР-рибоза)
- Конденсация моносахаридов с нуклеозидами (О-гликозилирование)
- Изучение стабильности 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-нуклеозидов в условиях реакции гликозилирования
- Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозилнуклеоздов
Введение к работе
Дисахаридные нуклеозиды - важная группа природных соединений. Эти соединения являются структурными элементами биополимеров, таких как тРНК и поли(АБР-рибоза), входят в состав антибиотиков и других биологически активных соединений, проявляя широкий спектр биологической активности - антибактериальные, противогрибковые, гербицидные, инсектицидные, противоопухолевые и антивирусные свойства. В этих соединениях имеется дополнительный моносахаридный остаток, присоединенный к одной из гидроксильных групп нуклеозида 0-гликозидной связью. Наличие дисахаридного остатка и гетероциклического основания определяет свойства соединений, родственные свойствам углеводов и нуклеозидов.
Анализ литературных данных показывает, что дисахаридные производные нуклеозидов изучены недостаточно хорошо. Это объясняется отсутствием простых и эффективных методов их синтеза. Возможны два пути получения дисахаридных нуклеозидов. Синтез может быть осуществлен конденсацией соответственно защищенного дисахарида с нуклеиновым основанием или реакцией нуклеозида с моносахаридом. Большинство нуклеозидных антибиотиков были синтезированы по первому пути [1]. Эта схема синтеза многостадийна. Возможность использования природных нуклеозидов существенно упрощает схему синтеза. В литературе известны несколько примеров образования Огликозидной связи из частично защищенного нуклеозида и моносахарида. Однако выходы подобных реакций не превышали 20-40% из-за образования ряда побочных продуктов [1].
В нашей лаборатории был разработан метод получения 2'-0-p-D-рибофуранозилнуклеозидов [2, 3, 4]. В отличие от предыдущих синтезов выход дисахаридных нуклеозидов на стадии конденсации составлял 70-80% и реакция протекала стереоспецифично с образованием Р-аномеров. Разработанный метод был распространен на получение и других дисахаридных нуклеозидов [5-Ю].
С использованием этого метода был осуществлен первый химический синтез минорных компонентов тРНК - 2'-<9-(3-0-рибофуранозиладенозин-5'-фосфата (Агр) и 2'-0-Р-0-рибофуранозилгуанозин-5'-фосфата (Grp) [11-13]. Впервые синтезирован фрагмент тРНК, содержащий минорный нуклеотид Агр [14].
Следует отметить, что химические методы синтеза поли(АЕ)Р-рибозы) до последнего времени разработаны не были. Поли(АБР-рибоза) вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки клеток [15, 16]. Поли(АБР-рибоз)илирование белков катализируется несколькими полимеразами, которые постоянно и в значительном количестве имеются в клетке. Основным из этих ферментов является поли(АБР-рибозо)полимераза-1 (ПАРП-1). Она отвечает за синтез 90% поли(АВР-рибозы) в клетке [17]. В последние годы ведутся активные поиски ингибиторов полимеразы, которая является ферментом-мишенью для создания лекарственных препаратов. Представляется перспективным создание новых ингибиторов ПАРП-1 на основе дисахаридных нуклеозидов [18,19].
Целью настоящей работы явился синтез новых дисахаридных нуклеозидов для создания на их основе ингибиторов ПАРП-1. В ходе исследования решались следующие задачи: оптимизация ранее разработанного метода гликозилирования (определение оптимальных условий проведения реакции: температуры, катализатора, времени взаимодействия и т.д.), исследование устойчивости в условиях реакции N-гликозидной связи и используемых защитных групп; синтез 2'-С>-а-В-рибофуранозиладенозина -структурного элемента поли(АЕ)Р-рибозы) и его аналогов для изучения ингибиторных свойств синтезированных дисахаридных нуклеозидов в реакции, катализируемой ПАРП-1 человека.
Поли(АОР-рибоза)
Поли(АЕ)Р-рибоз)илирование - посттрансляционная модификация белков, происходящая практически во всех клетках млекопитающих, растений и низших эукариот и отсутствующая у дрожжей. Процесс катализируется поли(АВР-рибозо)полимеразами (ПАРП). Эти ферменты, открытые в 1960-ых годах, осуществляют превращение никотинамидадениндинуклеотида (НАД+) в гомополимер, поли(АОР-рибозу), с высвобождением никотинамида (Схема 1, реакция і) [26]. В клетке поли(АЕ)Р-рибоза) ковалентно связана с ПАРП, гистонами и другими белками ядра, как правило, через остатки глутаминовой, аспарагиновой кислот или С-концевого лизина [15, 26]. Молекулы полимера, как выделенные из природных источников, так и синтезированные in vitro с использованием поли(АБР-рибозо)полимеразы, могут содержать более 200-300 мономерных звеньев. Линейные участки длиной 20-50 остатков чередуются с разветвленными фрагментами, которые, по-видимому, стабилизируют конформацию полимера [15,16,26].
В обзорах [15, 16] рассмотрена разнообразная биологическая роль поли(АБР-рибозы). Известно, что она вовлечена в процессы репарации ДНК и сохранения целостности генома, регуляции транскрипции, модуляции структуры хроматина, апоптоза protein и некроза, дифференциации клеток.
В процессе деградации поли(АБР-рибозы) участвуют два фермента: ADP-рибозилпротеинлиаза и поли(АОР-рибозо)гликогидролаза. ADP-рибозилпротеинлиаза отвечает за гидролиз связи между белком и ближайшим остатком ADP-рибозы. Гликогидролаза обладет экзо- и эндогликозидазной активностью и расщепляет связи между аденозином и рибофуранозным остатком с образованием ADP-рибозы [15, 16]. Ферментативный гидролиз поли(АБР-рибозы) фосфодиэстеразой змеиного яда и щелочной фосфатазой (Схема 1, реакции ii, iii) позволил получить дисахаридный нуклеозид 2 -(Э-а-В-рибофуранозиладенозин и соответствующий трисахаридный нуклеозид, расположенный в месте разветвления цепи. Структура этих соединений определена при помощи ЯМР спектроскопии [26, 27].
1.1.2. Минорные нуклеозиды - компоненты тРНК.
Как известно, в состав нуклеиновых кислот входят не только 8 основных рибо- и 2 -дезоксирибонуклеозидов, но и большое количество их производных, минорных нуклеозидов. К настоящему времени описаны более 100 модифицированных нуклеозидов, встречающегося в различных типах РНК (главным образом, в тРНК) [31, 32]. 2 - 9-P-D-Рибофуранозиладенозин 5"-фосфат (Агр) и 2 -ОР-В-рибофуранозилгуанозин 5"-фосфат (Grp) (Схема 2) вьщелены из инициаторных тРНК (т-РНКиМеі) клеток низших эукариот и некоторых растительных источников [33-35]. Данные минорные нуклеозиды находятся в основании Т-петли т-РНКиМет и занимают 64 положение в первичной структуре молекулы. В образовании межнуклеотидных связей участвуют 3 и 5 -гидроксильные группы нуклеозидного остатка.
Предполагается, что присутствие дисахаридных нуклеозидов Агр и Grp в 64 положении является общим характерным свойством т-РНКиМст низших эукариот. По данным рентгеноструктурного анализа, объемный 5"-фосфорибофуранозный остаток нуклеозида Агр занимает строго определенное положение в малой бороздке на поверхности молекулы в третичной структуре дрожжевой т-РНК„Мет [36]. Дополнительная фосфатная группа образует водородную связь с 2-амино группой соседнего остатка гуанозина 63. Селективное удаление дополнительного 5"-фосфорибофуранозного остатка в результате окислительного элиминирования приводило к тому, что т-РНК начинала функционировать как, элонгаторная, но с меньшей эффективностью по сравнению с нативной т-РНКМет [37, 38]. Эти данные позволяют предположить, что наличие модификации пуринового нуклеозида 64 в т-РНК„Мет играет определенную роль в дискриминации процессов инициации/элонгации белкового синтеза, препятствуя образованию обязательного в процессе элонгации комплекса т-РНК с фактором элонгации EF-la и гуанозинтрифосфатом.
Механизм образования модифицированных нуклеозидов Агр и Grp в составе тРНК окончательно не установлен. Однако существует гипотеза о посттранскрипционном рибозилировании аденозина или- гуанозина в 64-ом положении предшественника-цитоплазматической инициаторной т-РНКиМет при участии 5-фосфорибозил-1-а-пирофосфата (Схема 2) [33].
Следует отметить, что из РНК выделено всего два типа нуклеозидов, модифицированных по углеводному остатку, 2 - 3-метил- и 2 -0-3-D-рибофуранозилнуклеозиды. Основная часть.минорных нуклеозидов имеет модификации по гетероциклическому основанию [31 , 32]. Недавно осуществлен полный химический синтез минорных нуклеозидов 2 -Ор-0-рибофуранозиладенозин 5"-фосфата и 2 -0-$-D-рибофуранозилгуанозин 5"-фосфата [11-13].
Таким образом, в составе биополимеров обнаружен только один тип дисахаридных нуклеозидов - пуриновые D-рибофуранозилнуклеозиды, относящиеся к первой группе предложенной классификации.
Структура нуклеозидных антибиотиков чрезвычайно разнообразна [20, 23, 24, 39, 40], и точное ее установление - довольно сложная задача. Помимо гетероциклического основания и моносахаридных остатков, эти соединения могут содержать различные функциональные заместители: ацильные и алкильные группы, остатки фосфорной и серной кислот, жирные кислоты и аминокислоты, пептиды и дополнительные углеводные фрагменты. Сочетание различных химических реакций: деградация с помощью кислотного и щелочного гидролиза, метанолиза, периодатное окисление с последующим восстановлением боргидридомпозволяет получить фрагменты, строение которых можно исследовать физико-химическими методами.
Липозидомицины А I (Рис. 2), В и С [41] - семейство липидсодержащих нуклеозидных антибиотиков, выделенных из Streptomyces griseosporeu и избирательно ингибирующих синтез гликопротеинов и пептидогликанов у бактерий. Формально липозидомицины можно отнести к первой группе классификации, поскольку они содержат уридин, гликозилированный 5-амино-5-дезокси-Б-рибофуранозой. В состав этих молекул также входят 1,4-диазепан и жирная кислота, ацилированная 3-метилглутаровой кислотой. Для липидного остатка липозидомицина А I характерна z/wc-конфигурация двойных связей [41]. Стереоселективный синтез дисахаридного [42] и 1,4-диазепан-З-онового [43] фрагментов и их сравнение с продуктами деградации липозидомицина позволили определить конфигурацию хиральных центров [44].
Конденсация моносахаридов с нуклеозидами (О-гликозилирование)
Способы образования О-гликозидной связи подробно рассматриваются в обзорах, посвященных химии углеводов [80-83]. В ранних работах для Огликозилирования применялся метод Кенигса-Кнорра и его модификации. Выход таких реакций обычно не превышал 20-40% из-за образования ряда побочных продуктов [1]. Использование более современных методов Огликозилирования позволило существенно повысить выходы при дисахариднонуклеозидном синтезе [23, 24]. Как и в случае синтеза N-гликозидов, наличие соучаствующей 2-0-ацильной группы в моносахариде обеспечивает стереонаправленное образование 1,2-транс-замещенных продуктов. При отсутствии такой группы обычно образуется смесь а- и Р-аномеров. Направленное получение 1,2-цис-замещенных продуктов значительно сложнее.
Приведем несколько примеров недавно осуществленных синтезов дисахаридных нуклеозидов, чтобы проиллюстрировать основные подходы и методы. Получение аденофостина А удалось осуществить двумя способами (Схема 5). С использованием модифицированной конденсации Кенигса-Кнорра из гликозилбромида и защищенного аденозина синтезировали дисахаридныи нуклеозид, селективное фосфорилирование которого позволило получить аденофостин А с общим выходом 22% [84].
Для получения аналогов шимофуридина использовалось несколько методов О-гликозилирования (Схема 6). В первом случае (Схема 6, реакция і) активацию фенилтиогликозида проводили N-йодсукцинимидом [86]. Полученный с 37% выходом дисахаридныи нуклеозид далее превращали в 2 -Оа-Ь-фукопиранозилинозин. Во втором случае (Схема б, реакция іі) в качестве гликозильного донора использовали дибутилфосфат L-фукопиранозы, что позволило получить дисахаридное производное с а-Огликозидной связью с выходом 53% [87] (Схема 6). Более высокие выходы получены при 0-гликозилировании 3 ,5 -ди-0-бензилуридина 2-тиопиримидиновым производным L R30-\ A N Si-0 он фукопиранозы [88]. Для синтеза З -О-а и р -D-глюкопиранозилинозина использовали трихлорацетимидат D-глюкопиранозы [54]. Схема 7. Синтез 5 -(9-глюкуронидов пиримидиновых нуклеозидов: B=5FUra, 5FCyt. і. TMS2-5FCyt, SnCU, ДХЭ; ii. Ag20, MeCN, кипячение; iii. удаление защитных групп. Те же соединения удалось получить с использованием гликозилирования по Кенигсу-Кнорру (Схема 7, реакция Н); при этом выход дисахаридных нуклеозидов составил 65%. Недостатком предложенного метода явилось то, что последующее снятие 2 ,3 -0-изопропилиденовой защитной группы кипячением в 80% уксусной кислоте в значительной степени сопровождалось разрывом Огликозидной связи и приводило к низким выходам целевых нуклеозидов [89].
Структура некоторых нуклеозидных антибиотиков, таких как дапирамицин, характеризуется наличием необычной N-гликозидной связи между гетероциклическим основанием и дисахаридным фрагментом. Такие соединения до сих пор не удалось синтезировать. Совсем недавно опубликовано сообщение о получении аминонуклеозидного фрагмента спикамицина [90]. Ключевой стадией данного синтеза являлась реакция конденсации защищенного гликозиламина с 6-хлорпурином, катализируемая палладием.
Рассмотрим более подробно получение дисахаридных нуклеозидов, относящихся к первой группе классификации - О-пентафуранозилнуклеозидов. Недавно осуществлен простой и эффективный синтез 2 - Э-Р-В-рибофуранозилнуклеозидов [91 2-4]. Метод заключается в конденсации небольшого избытка 1-(9-ацетил-2,3,5-три-0-бензоил-[3-Б рибофуранозы с N-защищенными 3 ,5 -6 -тетраизопропилдисилоксан-1,3 диилрибонуклеозидами (3 ,5 -0-ТІРВ8і-рибонуклеозидами) в присутствии SnCU (Схема 9, реакция і). Реакцию проводят в ДХЭ, при достаточно мягких условиях: 0С, 2 часа для пиримидиновых нуклеозидов и 7-16 часов для пуриновых производных (в подобных условиях проводится получение нуклеозидов по методу Форбрюггена [79]). Выходы целевых соединений составили 74-82% [2-4]. ОГликозилирование протекает стереоспецифично с образованием р -гликозидной связи. Наличие соучаствующей 2-0-бензоильной группы обеспечивает получение исключительно 1,2-транс-рибофуранозидов. При комнатной температуре реакция протекает быстрее (30 минут), но выходы на стадии конденсации ниже - 40-77% [91]. Синтез 2 -С Р-0-рибофуранозилнуклеозидов. В= Ura, Thy, CytBz, AdeBz, GuaiBu, B = Ura, Thy, Cyt, Ade, Gua. R= H, OH. і. 1-0-ацетил-2,3,5-три-С -бензоил-Р-В-рибофураноза, SnCl4, ДХЭ, 0C; ii. ВщОТ/ТГФ; 5 M NH3/MeOH. Разработанный метод распространен на получение пиримидиновых З -Op-D рибофуранозил-2 -дезоксирибонуклеозидов [5], 5 -0-Р-О-рибофуранозил-2 дезоксирибонуклеозидов и 5 -ОР-0-рибофуранозилнуклеозидов [6-8]. С целью дальнейшего изучения возможностей метода в реакции О-гликозилирования успешно были использованы другие полностью ацилированные производные фураноз и пираноз (D-и L-арабинофураноза, D-рибопираноза, D-эритрофураноза) [9, 10].
В большинстве случаев выходы дисахаридных нуклеозидов составляли 70-80%. Для подобных реакций конденсации между защищенными нуклеозидами и моносахаридами, о которых сообщалось ранее, характерны более низкие выходы [1]. Однако и при использовании разработанного метода в некоторых случаях образовывалось существенное количество побочных продуктов. Это может быть вызвано двумя факторами: нестабильностью защитных групп и разрывом N-гликозидной связи (в случае защищенных пуриновых нуклеозидов) в присутствии кислот Льюиса. Известно, что N- и О-гликозидные связи нестабильны в кислой среде. Неустойчивость к гидролизу может являться фактором, препятствующим использованию подобных соединений. Обнаружено, что в пуриновых дисахаридных нуклеозидах разрыв N- и Огликозидных связей при кислотном гидролизе протекает примерно с одинаковой скоростью. В случае пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов наблюдался разрыв только О-гликозидной связи [6].
Кроме того, при рибозилировании 3 ,5 -ОТІРВ8і-рибофуранозилуридина при комнатной температуре в присутствии тетрахлорида олова (Схема 9) было обнаружено образование существенного (до 20%)) количества 5 -0-р-0-рибофуранозного производного [93]. Это может объясняться тем, что в присутсвии кислот Льюиса 3 ,5 -0IPDSi-рибонуклеозиды подвергаются изомеризации с образованием более стабильных 2 ,3 производных. Это согласуется и с предложенным ранее внутримолекулярным механизмом изомеризации в присутствии кислот в безводных условиях [94].
При конденсации 5 -0-/ярет-бутилдифенилсилил-тимидина (или N -бензоилцитидина) с полностью ацилированной рибозой в присутствии SnCLt в ДХЭ при 0С получали соответсвующие дисахаридные нуклеозиды (Схема 10, реакция і) [5]. Последующее удаление защитных групп (Схема 10, реакция и) давало- З -O-p-D-рибофуранозил-2 -дезоксирибонуклеозиды с хорошим общим выходом. Реакция гликозилирования заканчивалась через 40 минут [5]. Увеличение времени взаимодействия (16 часов) приводило к образованию трисахаридного нуклеозида (B=Thy) в качестве основного продукта (Схема 10, реакция iii).
Изучение стабильности 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-нуклеозидов в условиях реакции гликозилирования
Ранее при использовании: предложенного метода; для г рибозилирования;. пиримидиновых 2 ,3 -ди-0-ацшшуклеозидов наблюдалось образование соответствующих 5 -0-р-В-рибофуранозилнуклеозидов с выходами 74-78% [7, 8]; При замене SnGl на триметилсилилтрифторметансульфонат (TMSOTf) были получены аналогичные результаты [7, 8]: В настоящей работе исследовалась возможность использования данного; катализатора при синтезе 2 -0-Р-О-рибофуранозилнуклеозидов. Следует отметить, что: TMSOTf широко используется в химии нуклеозидов и имеет ряд существенных преимуществ перед SnCU [79]. Однако, конденсация небольшого избытка рибофуранозы 2 с 3 ,5 -0IPDS-ypHn.HHOM Га при 0Є в ДХЭ в присутствии TMSOTf давала смесь двух продуктов. Основной продукт по спектральным характеристикам, оказался; идентичен защищенному 2 -Орибофуранозилуридину За; побочным продуктом предположительно являлся соответствующий! 5 -0-рибофуранозил-изомер 7а.
Образование 5 -0-рибофуранозилуридина в качестве побочного продукта при конденсации 3 ,5 -OTIPDS-ypHflHHa la с рибофуранозой 2 описывалось ранее [93]. При проведении реакции в ДХЭ при 20С через 30 мин образовывалась смесь 2 -0-рибофуранозил- и 5 -0-рибофуранозил-производных в соотношении 4:1. Структуру побочного продукта удалось подтвердить проведением встречного синтеза, в котором в качестве исходного соединения использовался 2 ,3 -0IPDS-ypHflHH 6а. Соединение 6а получали взаимодействием 1,3-дихлор-тетраизопропилдисилоксана и 5 -0-монометокситритилуридина с последующим удалением тритильной защитной группы [127].
Изомеризация 3 ,5 -0-Т1РВ8-нуклеозидов в 2 ,3 -0-ТШО8-нуклеозиды также происходит в безводной кислой среде (мезитиленсульфокислота, ДМФА, 20С, 6-10 ч, выход 30-60%) [128], Для более детального изучения этого процесса, в ходе данной работы исследовалась изомеризация 3 , 5 -0-Т1Р08-нуклеозидов la-d,f,g в присутствии TMSOTf. При воздействии 2-3-кратного избытка TMSOTf на 3 , 5 -0-Т1РВ8-нуклеозиды la-d,f,g в ДХЭ при 0С в атмосфере азота изомеризация протекала достаточно быстро (1,5-4 ч). Соответствующие 2 , З -О-ТГРБЗ-производные 6a-d,f,g выделяли с выходом 55-90% (Схема 3, реакция і, Табл. 1). Важно отметить, что в случае пуриновых нуклеозидов изомеризация протекала с существенно более высокими выходами 72-90%.
Полученные данные согласуются с предложенным ранее механизмом изомеризации (Схема 3), по которому сначала под воздействием кислоты происходит разрыв связи Si-O при первичной 5 -гидроксигруппе, после чего происходит образование 2 ,3 -0IPDS-нуклеозидов [94]. Равновесие смещено в сторону 2 ,3 -производных 6 за счет большей термодинамической стабильности образующегося семичленного внутримолекулярного цикла по сравнению с восьмичленным в исходных нуклеозидах la-d,f,g. Таблица 1. Изомеризация 3 ,5 -ОТІРВ8-нуклеозидов 1 в присутствии TMSOTf (ДХЭ, 0 С). Условия реакции и выходы 2 ,3 -0-Т1РО8-нуклеозидов 6.
Структура полученных изомеров 6a-d,f,g была подтверждена данными Н- и С-ЯМР-спектроскопии. Был проведен сравнительный анализ ЯМР-спектров исходных 3 ,5 -OIPDS-нуклеозидов la-d,f,g и продуктов изомеризации 6a-d,f,g в ДМСО б (Табл. 2 и 3). Сигналы вторичных 2 -гидроксигрупп в спектрах нуклеозидов la-d,f,g находятся в области более слабого поля (дублет, 5.60-5.69 м.д.) и характеризуются константам спин-спинового взаимодействия (КССВ) ./ 0//=3.9-4.8 Гц. За счет спин-спинового взаимодействия с обоими протонами СНг-группы свободные первичные 5 -гидроксигруппы нуклеозидов 6a-d,f,g в спектрах проявляются в виде дублета дублетов или триплета в области 5.15-5.33 м.д. Сравнение КССВ показало, что для 3 ,5 -0IPDS-нуклеозидов la-d,f,g константы Jv? достаточно малы [129], в то же время Jyj имеют значения около 8 Гц. В случае 2 ,3 -ОТ1РВ8-нуклеозидов 6a-d,f,g Ji- viJ r имеют более близкие значения, при этом сумма КССВ Jj и Jyj для нуклеозидов обеих серий примерно одинакова, 9.0-9.6 Гц [130].
Проведение реакции конденсации 3 ,5 -0-Т1РБ8-нуклеозидов с полностью ацилированной рибофуранозой при 0С в присутствии SnCU является оптимальным и позволяет получать соответствующие производные дисахаридных нуклеозидов с высокими выходами.
Было показано, что изомеризация 3 ,5 -0-Т1РБ8-нуклеозидов 1 в присутствии TMSOTf может быть использована для получения 5 -Орибофуранозилнуклеозидов. Так, нами был получен 5 -0-рибофуранозиладенозин 7Ь (Схема 3). К нуклеозиду lb в ДХЭ при 0С добавляли 2 эквивалента TMSOTf (Схема 3, реакция і). Через 12 часов, когда по данным ТСХ реакция изомеризации закончилась, к реакционной смеси добавляли рибофуранозу 2 и выдерживали реакционную смесь при 0С 20 часов (Схема 3, реакция іі). 5 -0-Рибофуранозиладенозин 7Ь был выделен с 60% выходом. Последующее удаление защитных групп позволило получить 5 -0-р-В-рибофуранозиладенозин 8Ь, по спектральным характеристикам идентичный дисахаридному нуклеозиду, полученному ранее, исходя из 2 ,3 -0-изопропилиденаденозина [8]. Проведенные исследования позволили установить, что 3 ,5 -ОТ1РВ8-нуклеозиды 1 в присутствии TMSOTf эффективно (с выходом 55-90%) изомеризуются в 2 ,3 -0IPDS-производные 6. В присутствии SnCl4 и BF3 Et20 3 ,5 -0-Т1РВ8-нуклеозиды 1 значительно более стабильны. Только, в случае уридинового. производного 1а наблюдалось образование заметного количества продукта изомеризации 6а (до 35% при проведении реакции при 0С и до 70% при 20С). Таким образом, было показано, что оптимальным для реакции гликозилирования 3 ,5 -ОТ1РВ8-нуклеозидов 1 является проведение реакции при 0С и использование в качестве катализатора SnCLj.
Разработанный метод- гликозилирования был успешно, применен для получения \ пиримидиновых аналогов- 3 -0-р-В-рибофуранозил-2 -дезоксирибонуклеозидов [5]. Конденсация 5 -0-трети-бутилдифенилсилил-тимидина 9а с рибофуранозой 2 приводила к, образованию дисахариди ого нуклеозида-10 с выходом 79% (Схема 4). После удаления защитных групп получали дисахаридный нуклеозид 11 с высоким общим выходом. Однако, при аналогичной реакции небольшого избытка ацилированной рибофуранозы 2, активированной SnCLj, с 5 -0-защищенным Л -бензоил-2 -дезоксиаденозином 9Ь при 0 С была получена сложная смесь продуктов. Аналогичные результаты были получены и при использовании производного 2 -дезоксиаденозина 9с (схема 4). Это может объясняться неустойчивостью и возможной аномеризацией iV-гликозидной связи в условиях реакции гликозилирования. Было решено более подробно исследовать данную реакцию конденсации, установить структуру основных продуктов и механизм их образования.
Анализ полученных смесей проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Рис. 2 и 3). После стандартной обработки реакционные смеси для удаления защитных групп обрабатывали тетрабутиламмонийфторидом (B114NF), а затем раствором NH3 в МеОН.
Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозилнуклеоздов
2 - 9-а-0-Рибофуранозиладенозин 29Ь является структурным элементом поли(АБР-рибозы). Сложность синтеза 2 -0-а-В-рибофуранозиладенозина заключается в том, что нуклеозид и дополнительный рибозный остаток должны быть связаны 1"- 2 гликозидной связью, имеющей а-конфигурацию. В ходе работы впервые был осуществлен стереоселективный синтез 2 -0-а-Б-рибофуранозиладенозина 29Ь (Схема 6) и его пиримидинового аналога - 2 -Оос-В-рибофуранозилуридина 29а, исходя из производных 2 -0-сЯ арабинофуранозилнуклеозидов24а,Ь.
Соответственно защищенные 2 -6)-а-Б-арабинофуранозилнуклеозиды 24а,Ь получали по разработанному методу конденсацией небольшого избытка 1-Оацетил-2,3,5-три-0-бензоил-Р-Б-арабинофуранозы 23 с 3 ,5 -ОТИЧ}8-нуклеозидами 1 а,Ь в присутствии SnCU- Реакция протекала в мягких условиях (0С, ДХЭ, 30 ч в случае аденозинового производного, 3 ч в случае уридинового) (Схема 6, реакция і). О-Гликозилирование протекало стереоспецифично, с образованием а-гликозидной связи. Наличие в присоединяемом моносахариде соучаствующей Обензоильной группы обеспечивало образование 1,2-транс-арабинофуранозидов [9]. Выход целевых соединений 24а,Ь составил 63 и 62% соответственно.
О-Дебензоилирование проводили с использованием раствора MeONa в метаноле (Схема 6, реакция іі). Для селективной защиты 3 ,5 -ОН-групп арабинозы в соединениях 25 а,Ь использовали TIPDS-защитную группу [127]. При комнатной температуре реакция протекала довольно медленно, поэтому реакцию проводили при 35С (Схема 6, реакция ш). Ключевой стадией синтеза стало обращение конфигурации при С-2" дополнительного моносахаридного остатка, которое было осуществлено по методу Робинса окислением — восстановлением [141]. Для окисления 2"-ОН группы защищенного соединения 26 выбрали процедуру с использованием системы ДМСО - АсгО (Схема 6, реакция iv). Восстановление кето-группы соединения 27 проводили ЫаВЩ (Схема 6, реакция v).
Структура полученных соединений была подтверждена данными ЯМР- и УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии. Н ЯМР-спектры дисахаридных нуклеозидов (Рис. 6 и 7) достаточно сложны. Отнесение сигналов в спектрах соединений 24-26 и 28 удалось осуществить при помощи спектров двойного резонанса и спектров COSY, а также сравнением со спектрами родственных нуклеозидов [3]. 13С ЯМР-спектры были отнесены подобным образом с использованием спектров HSQC (пример Рис. 5).
Анализ спектров 2 -Оа-В-арабинофуранозилнуклеозидов 26а,Ь и 30а,Ь и 2 -0-a-D-рибофуранозилнуклеозидов 28а,b и 29а,Ь показал, что обращение конфигурации при С-2 атоме в пентафуранозном остатке приводит к значительным изменениям значений КССВ. Взаимное «транс-расположение атомов НГ-Н2 и Н2 -Н3 в Т-0-a-D-арабинофуранозилнуклеозидах 26а,Ь и 30а,Ь изменяется на z/мс-расположение в Т-0-a-D-рибофуранозилнуклеозидах 28а,Ь и 29а,Ь. В Таблице 9 для сравнения приведены данные ЯМР-спектроскопии для 2 -0-Р-О-рибофуранозиладенозина 5Ь [3] и. 2 -0-cc-D-арабинофуранозиладенозина ЗОЬ и 2 -0-а-О-рибофуранозиладенозина 29Ь. В случае. a-D-рибофуранозного производного 29Ь для дополнительного углеводного остатка Ji j =4.2 Гц, J2 ,3,= 6.2 Гц и Jy,4 2.7 Гц, в случае a-D-арабинофуранозного ЗОЬ - 1.6, 3.5 и 6.0 Гц, соответственно, и те же константы для p-D-рибофуранозного производного 5Ь равны 0, 4.6 и 7.5 Гц.
В ходе проведенных совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН исследований изучено влияние на активность ПАРП-1 различных дисахаридных нуклеозидов. Для определения ингибиторных характеристик дисахаридных нуклеозидов в реакции поли(АОР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1, была использована тест-система, основанная на полимеризации меченного тритием по адениновому остатку NAD+. В качестве показателя эффективности ингибирования использовали значение ICso.
Как видно из Таблицы 11, среди 2 -0-Р-В-рибофуранозилнуклеозидов ингибиторами оказались производные тимидина и гуанозина. При этом значение 1С5о для 2 -0-p-D-рибофуранозилгуанозина вдвое превышает IC50 для 2 -0-Р-О-рибофуранозилтимидина. 5 -О-Рибофуранозное производное гуанозина не оказывает влияния на активность ПАРП-1 в концентрации 1 мМ. Тимидиновые производные ингибируют фермент со значениями ICso от 0,05 мМ до 0,02 мМ. Причем, наименьшие значения IC50 оказались у Ъ -О-рибофуранозилтимидина 11, (ICso 0,07 мМ) и его окисленного производного (IC50 0,02 мМ). Среди производных аденозина незначительную ингибирующую активность проявил только 3-0-Р-Б-рибофуранозил-2-дезокси-а-В-аденозин 19 (ICso 0,2 мМ).
В ходе исследований влияния различных дисахаридных нуклеозидов на активность рекомбинантной ПАРП-1, в ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы с ICso Ю 5 М. Таким образом, разработка методов химического синтеза структурного элемента поли(АДФ-рибозы) и родственных дисахаридных нуклеозидов открывает новые возможности для создания на их основе новых ингибиторов ПАРП-1. В настощее время ПАРП-1 рассматривается как перспективная мишень для создания лекарственных препаратов для лечения ряда таких заболеваний как инсульт, ишемическая болезнь, диабет, травматические повреждения ЦНС, артрит, колиты и другие формы воспаления [18, 19]. Ингибиторы ПАРП также могут быть использованы как потенциальные противораковые и противовирусные агенты [18, 19]. Таблица 11. Значения IC50 в реакции поли(АОР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1 для различных дисахаридных нуклеозидов [142, 143].
