Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.. Методы синтеза и биологическое значение негликозидных аналогов нуклеозидов . 9
1.1. Алкилирование нуклеиновых оснований. 9
1.1.1. Алкилирование нуклеиновых оснований пиримидинового ряда . 10
1.1.2. Алішлирование нуклеиновых оснований пуринового ряда. 1 б
1.2. Присоединение нуклеиновых оснований по Михаэлю как метод синтеза негликозидных ациклических аналогов нуклеозидов. 24
1.3. Применение реакции Мицунобу к синтезу негликозидных аналогов нуклеозидов . 25
1.4. Реакции циклизации в синтезе негликозидных аналогов нуклеозидов. 28
1.4.1. Применение реакций циклизации в синтезе негликозидных аналогов нуклеозидов пиримидинового ряда. 29
1.4.2. Применение реакций циклизации в синтезе негликозидных аналогов нуклеозидов пуринового ряда. 31
Глава 2. Обсуждение результатов. 37
2.1. Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с концевой В-дикарбонилъной группой. 37
2.1.1. Получение алісилирующих реагентов с концевой В-дикарбонилъной группой . 38
2.1.2. Получение полиметиленовых производных пиримидиновых и пуриновых нуклеиновых оснований с концевой 6-дикарбонилъной группой с использованием реагента (109а). 40
2.1.2. Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой (3-дикарбонильной группой с использованием реагентов (109Ь) и (109с). 49
2.2. Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований с концевой фенилкето группой. 57
2.2.1. Получение алкилирующих реагентов с концевой фенилкето группой. 57
2.2.2. Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой с использованием реагента (116а). 58
2.2.3. Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой с использованием реагентов (116b)-(116d). 63
2.3. Биологическая активность полиметиленовых; производных нуклеиновых оснований с концевыми функциональными группами. 73
Глава 3. Экспериментальная часть. 78
Выводы 110
Литература 111
- Алкилирование нуклеиновых оснований пиримидинового ряда
- Применение реакции Мицунобу к синтезу негликозидных аналогов нуклеозидов
- Получение алісилирующих реагентов с концевой В-дикарбонилъной группой
- Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой с использованием реагента (116а).
Введение к работе
Среди современных лекарственных средств, используемых для лечения заболеваний, вызванных вирусными инфекциями, значительную область занимают соединения, относящиеся к группе негликозидных аналогов нуклеозидов [1]. В случае вирусов HSV и VZV негликозидные аналоги нуклеозидов под действием вирусной тимидинкиназы (TIC) превращаются в соответствующие монофосфаты, последующее их фосфорилирование ферментами клетки приводит к трифосфатам, которые: 1) ингибируют вирусную ДНК-полимеразу; 2) терминируют рост цепи вирусной ДНК, встраиваясь по ее З'-концу.
Селективность действия аналогов нуклеозидов является следствием двух причин: 1) вирусная ТК, способная осуществить фосфорилирование нуклеозидных аналогов, присутствует только в инфецированных клетках; 2) соответствующие трифосфаты более эффективно ингибируют вирусную ДНК- полимер азу, нежели полимеразу клетки [2].
К полиметиленовым аналогам нуклеозидов относятся такие эффективные противовирусные препараты, как пенцикловир (1) и (-)2HM-HBG (2) [3].
он он (1) (2)
Вирус герпеса первого типа (HSVI) кодирует уникальную ТК, которая экспрессируется и в продуктивно и в скрыто инфецированных клетках как в культуре, так и in vivo. HSVI-специфическая ТК значительно отличается от TIC млекопитающих, как в отношении строения, так и в отношении каталитической активности. "Пластичность" активного сайта - это одно из уникальных свойств HSVI ТК, выявленное в процессе разработки селективных антивирусных аналогов нуклеозидов. В то время как ТК млекопитающих способна фосфорилировать лишь тимидин (TdR), HSVI ТК способна фосфорилировать тимидиловую кислоту (dTMP), а также различные пяримидиновые и пуриновые дезоксирибонуклеозиды и нуклеозидные аналоги, такие как ациклогуанозин и бромовинилдезоксиуридин. Результаты исследований патогенеза и репликации HSV in vivo свидетельствуют в пользу того, что функция вирус-специфичной ТК необходима для репликации вируса и скрытой инфекции неделящихся клеток, в которых процессы синтеза dTTP подавлены или отсутствуют. Например, ТК дефицитные (ТК) мутантные формы HSV практически не реплицируются или вообще не реплицируются в (TIC) тканях и тканях с дефицитом ТМР-синтетазы, таких как тригеминалъньгй ганглий и мозг [4].
Вирусы герпеса первого и второго типов имеют длительный скрытый период жизни в нейронах. Скрытое состояние периодически прерывается реактивацией, вызывающей повторяющуюся время от времени болезнь, при этом значительное количество инфецированных людей может распространять инфекционный вирус и без видимых признаков заболевания. Помимо этого, HSV может вызывать опасный для лшзни энцефалит как у новорожденных в результате действия вируса во время внутриутробного периода, так и у взрослых с пониженным иммунитетом. Герпетический энцефалит приводит к высокой смертности, выжившие часто серьезно травмированы. Герпетический энцефалит ежегодно наблюдается у 3000 новорожденных в США. Если инфекция проявляется в виде рассеянного заболевания, то у 50%) младенцев наблюдаются заболевания ЦНС, в 75%о случаев приводящие к летальному исходу. 50-75% выживших имеют психомоторное замедление, Ацикловир и форсанет применялись для лечения HSV энцефалита у новорожденных с рассеянной и локализованной формой заболевания. Хотя лечение понизило смертность от энцефалита до 15%, только 50% выживших смогло дальше нормально развиваться. К сожалению, общая смертность от рассеяного неонатального герпеса остается крайне высокой (40-65%), несмотря на современную антивирусную терапию [5, 6]. Конкурентные ингибиторы HSV ТК предотвращают вирусную реактивацию in vitro и in vivo, при лечении ингибиторами ТК экспрессия вирусной ДНК в инфецированных нервных ганглиях падает. Ясно, что есть необходимость в противовирусных лекарствах, способных проникать в ЦНС и эффективно ингибировать HSV инфекцию. В рамках работ направленных на решение данной проблемы Райтом и сотр. [7] был синтезирован ряд гидрофобных полиметиленовых производных нуклиновых оснований (3), среди котрых были выявлены сильные ингибиторы HSVI и HSVII тимидинкиназ in vitro.
R" 4^
Липофильность молекулы лекарства способствует лучшему проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер и более эффективному захвату клетками.
Одним из основных препаратов, используемых для подавления репликации ВИЧ, является зидовудин (AZT), однако высокие дозы, необходимые для достижения требуемой концентрации в спинномозговой жидкости являются токсичными для клеток костного мозга, а также вызывают анемию и лейкопению.. С целью повышения эффективности действия AZT были синтезированы его многочисленные гидрофобные пролекарственные формы - производные по 5:-ОН-группе. Таким образом, было выявлено соединение (4), имеющее ЕСзо до 50 раз меньшее, чем для AZT в культурах клеток [8].
(4)
Наряду с AZT и другими нуіагеозидньїми ингибиторами, связывающимися в активном центре обратной транскриптазы ВИЧ, существует ряд ингибиторов, связывающихся в гидрофобном кармане, расположенном вблизи полимеразного каталитического центра, причем это взаимодействие не влияет на связывание нуклеотидного аналога, В связи с этим актуальным направлением исследований является изучение ингибиторов смешанного типа, одновременно связывающихся с двумя упомянутыми сайтами. Молекулы ингибиторов подобного типа содержат остаток нуклеозидного ингибитора, отделенный от остатка ненуклеозидного ингибитора спейсером, как правило гидрофобным [9].
Исследования полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с различными концевыми функциональными группами, выполненные ранее в нашей лаборатории [10,11], позволили выявить несколько соединений, ингибирующих или даже активирующих обратную транскриптазу ВИЧ.
Соединения (5) [12] эффективно ингибирут тимидин фосфорилазу Е.соїі за счет связывания фосфонатной группы в фосфатсвязывающем участке фермента, остаток тимина связывается в 2'-дезоксинуклеотидсвязывающем участке. Эти связьшающие участки фермента находятся на расстоянии 8-Ю А, комплиментарные им участки молекулы ингибитора отделены друг от друга полиметиленовой цепью приблизительно на такое же расстояние. д=8, 9 {СНа)п-Р О NH4 (5) Указанный фермент изучается в качестве модели тимидин фосфорилазы человека - фермента, уровень которого в многочисленных видах опухолей человека значительно повышен, более того, имеется ряд указаний на его вовлеченность в процессы ангиогенеза и апоптоза.
Кристаллографические исследования пуриннуклеозидфосфорилазы, выявившие в ее активном центре три связывающих участка; гуанинсвязывающий, гидрофобный карман, фосфатсвязывающий привели авторов работ [13, 14] к ингибиторам данного фермента общей формулы (6).
НО Р —CR2—(СНг)п n=4, R=H; n=4, R=F; =б, R=F; n=6, R=H; n=7. R=H; n=9. R=H
Ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы рассматриваются в качестве препаратов для лечения различньгх аутоиммунных дисфункций, лейкемии и предотвращения отторжения трансплантированных органов.
Спектр применения гидрофобных производных нуклеиновых оснований не ограничивается исследованиями по ингибированию ферментов, явно содержащих в своем активном центре участок связывания нуклеинового основания.
Так соединение (7) великолепно ингибирует липопротеин зависимую Аг фосфолипазу [15] - фермент, расщепляющий липопротеины низкой плотности до лизофосфатидил холина и окисленных жирных кислот.
Эти вещества, как известно, играют значительную роль в развитии атеросклероза. Соответственно ингибиторы этого фермента являются потенциальными препаратами для лечения атеросклероза.
При разработке антипсихотических агентов, не вызывающих экстр апиримидальных побочных эффектов, исследователями была выявлена большая группа гидрофобных производных пурина (8), обладающих значительной активностью [16]. R'=NH2; NHAJk; NAlkCHO; NAlk^ V R"=H; CI; CF3; NH^ NHAlk;
,N-A.R„ N(CH3)2;OAik;SCH3. R"'=Alk (8) Среди соединений, неспецифически стимулирующих иммунную систему, важное положение занимают нуклеозиды - различные представители этого класса избирательно действуют на разные типы клеток имммунной системы. К группе нуклеозидных аналогов, преимущественно действующих на Т-лимфоциты, относятся соединения, в которых остаток аргинина отделен от пуринового остатка полиметиленовым линкером длиной в пять углеродных атомов (9) [17].
N R=NH2; NHAJk; NAIt^; NHNH^ CI; SH; H;
Из вышеприведенных литературных данных следует важность изучения новых полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми функциональными группами в качестве потенциальных ингибиторов ферментов, что в ряде случаев поможет уточнить строение их активного центра и особенности механизма функционирования. При этом особенно ценной является легкореализуемая возможность плавного изменения геометрии молекулы ингибитора за счет длины полиметиленового спейсера.
Следует добавить, что соединения, содержащие два остатка нуклеиновых оснований, разделенных полиметиленовым спейсером различной длины (10, 11), служат моделями для изучения стекинг-взаимодействий нуклеиновых оснований [18,19]. Причем если остатки различные, например аденин и тимин (11), то в неполярных растворителях доминирующим типом внутримолекулярньгх взаимодействий становится образование водородных связей [201.
H.C R=H, CH3 R n=3-10 n=3-12 (CH2)n (CH2)n (11)
Повышенное внимание к молекулярным ансамблям, образованным за счет водородных связей, вызвано возможностью применения последних в качестве жидких кристаллов.
Алкилирование нуклеиновых оснований пиримидинового ряда
Основным положением электрофильной атаки алкилирующего реагента является iV -атом пиримидинового ядра. Тимин и урацил в условиях реакции алкилирования ведут себя идентичным образом, в то время как наличие экзоциклической МІ2-грутіьі у цитозина в ряде случаев требует несколько иных условий для получения соответствующих/ 1 -производных.
Ниже приводится сравнительный анализ методов и условий получения полиметиленовых производных нуклеиновых оснований пиримидинового ряда по реакции алкилирования. (12) (13) (14) В работе [24] авторами тщательно исследовано влияние условий реакции алкилирования натриевой соли тимина на состав смеси продуктов реакции. Посредством предварительного выдерживания тимина при 100 С в ДМФА в присутствии гидрида натрия нуклеиновое основание переводилось в натриевую и дииатриевую соли. Последующее взаимодействие с 4-бромбутилацетатом приводило к трем продуктам: W1-алкилирования (12), Л і -бис-алкилирования (13), и минорному продукту 04-алкшшрования (14).
Выявлено, что оптимальные выходы соединения (12) достигаются при использовании 2 экв. гидрида натрия и 2.3 экв. алкилирующего реагента и продолжительном нагревании при 100С (не менее 24ч.). (При переходе от 2 экв. к 2.3 экв. алкилирующего реагента выход продукта (12) увеличивается с 28% до 48%, но выход продукта бис-алкилирования (13) уменьшается с 38% до 23%).
Продолжительного нагревания реакционной смеси при высокой температуре, приводящего к значительному осмоленню реакционной смеси, можно избежать, если использовать для активации микроволновое облучение, причем для достижения хороших выходов требуется всего лишь 4 мин. [25]. Так, при переходе от термического метода активации к микроволновому выход эфира (12) несколько уменьшается при неизменном выходе продукта бис-алкилирования (13).
Применение карбоната калия в качестве основного катализатора также приводит к смеси продуктов моно- и бис-алкилирования (16) и (17), причем выход последнего при проведении реакции в ДМФА довольно высокий (43%), несмотря на использование пятикратного избытка тимина и карбоната калия [27].
К наилучшим результатам приводит использование DBU, который применяется в современной синтетической праісгике для катализа широкого спектра органических реакций [28]. Предложенная методика требует лишь небольшого (1.5 экв.) избытка основания и такого же избытка алкилирующего реагента, что делает ее пожалуй наиболее привлекательной для получения полиметиленовых производных с со-функциональными группами среди ряда методик, в которых алкилируются незащищенные 2,4(1Н,ЗН)-пиримидиндионы.
В ряде случаев, во избежание образования продуктов бис-алкилирования используется алкилирование пиримидиновьгх оснований, содержащих заместители по экзоциклическим атомам кислорода.
Некоторое значение для синтеза полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевыми фушсциональными группами имеет метод, использующий для алкилирования 2,4-бис-0-(триметилсилил)урацил или 2,4-бис- 9-(триметилсилил)тимин [29, 30].
При синтезе (Лг -пиримидил)-а-аминокислот авторами успешно использовалось алкилирование силилированных урацила и тимина. Реакцию проводили в отсутствие растворителя при 110С в течение 3 ч., причем использовался тринадцатикратный избыток алкилирующего реагента [29]. Последущая обработка реакционной смеси водой приводила с высокими выходами к продуктам (20), которые затем трансформировали в целевые аминокислоты.
К недостаткам метода можно отнести то, что для синтеза исходных 4-этокси-2(1Н)-пиримидинонов требуется осуществить пятистадийньгн синтез, на основе соответственно из 2-тиоурацила и 2-тиотимина, и необходимость деблокирования 4-оксогруппы соединений в довольно жестких условиях: кипячение в 1н. соляной кислоте в течение 2 ч. К достоинствам можно отнести высокие выходы продуктов N -алкилирования и возможность их перевода в производные цитозина (23) в мягких условиях. В литературе описан ряд методов трансформации соединений урацила в соответствующие цитозиновые производные. Первоначально взаимодействием с хлорокисью фосфора или 4-хлорфенилдихлорфосфатом в среде пиридина с последующим прибавлением 4Н-1,2,4-триазола синтезируют соединения (24), которые аммонолизом в смеси диоксан/МНз водн. переводят в целевые аналоги цитидина (25) [32,33]:
При алкилировании производных цитозина можно использовать и гораздо более доступный карбонат калия. Описана удобная методика синтеза производных цитозина, исходя из Л -ацетилцитозина: алкилирующий реагент, 1.6 экв. ацетипцитозина и 5.6 экв. К2СОз нагревали в ДМФА при 85С в течение Зч. Затем в реакционную массу для гидролиза ацетильной группы прибавляли воду и при той же температуре нагревали еще 2 ч. Выход производного цитозина составил 70% [30].
Применение реакции Мицунобу к синтезу негликозидных аналогов нуклеозидов
Реакция спиртов с соединениями, имеющими подвижный атом водорода, в присутствии окислительно-восстановительной пары триарил- триалкилфосфин/ диалкилазодикарбоксилат известна как реакция Мицунобу. Возможность использования в данной реакции широкого спектра нуклеофилов делает эту реакцию эффективной для синтеза различных классов органических соединений.
В 1981г. Ойо Мицунобу опубликовал обзорную статью, посвященную применениям открытой им ранее реакции, в которой предложил ее механизм [60]: ОЕі ОЄІ ОЕ1 ;Nv. -OEl L ы OB Hy Л. „NH „OEt О +PPh3 +PPh3 (66) (67) X 9ЕІ ОН ОЕі NH OEt . N Г + - Ч. - " ОРРІїзХ" О ІН" +PPh3 о JL О (67) х- (68) W R (69) (70) +OPPh3X" X [ j + 0=РРЬд (69) (71) На первом этапе трифенилфосфин и диэтилазадикарбоксилат (DEAD) необратимо взаимодействуют с образованием аддукта (66). В присутствии кислотного компонента образуется соль (67), которая, реагируя с первичным или вторичным спиртом (68), образует промежуточную оксифосфониевую соль (69) и диэтил 1,2-гидразиндикарбоксилат (70). Последующее SN2 замещение приводит к целевому соединению (71).
Так в ряде исследований в качестве интермедиата был зафшссирован диалкоксифосфоран (72) [61]. На данный момент принято считать, что в реакции участвует равновесная смесь оксифосфониевой соли (67) и фосфорана (72), причем концентрации интермедиатов определяются природой спиртового и кислотного компонентов и растворителя.
Отметим, что как правило для реакции Мицунобу применяют довольно неполярные растворители: ТГФ, эфир, дихлорметан, хлороформ, бензол, толуол. По этой причине для реакции используют производные нуклеиновых оснований, хорошо растворимые в указанных растворителях.
Для получения производных нуклеиновых оснований пиримидинового ряда весьма удобными исходными соединениями являются Л -бензоилтимин и N5-бензоилурацил [62,63], что объясняется тремя причинами: 1) их превосходной растворимостью в ТГФ3 2) достигается образование исключительно N1 -замещенных продуктов, 3) удаление бензоильной группы происходит в мягких основных условиях.
Для получения производных цитозина сначала синтезируют производные урадила по схеме, аналогичной вышеприведенной, затем переводят их в промежуточные соединения (24), аммонолизом которых получают целевые продукты [63].
Синтез Л -замещенных производных аденина и гипоксантина посредством реакции Мицунобу осуществляют, вводя исходный спирт в реакцию с б-хлорпурином в присутствии редокс- системы. Последующий кислотный гидролиз или аммонолиз приводят к производным гипоксантина [64] и аденина [65], соответственно.
Одновременное удаление ацетильной и карбамоильной защитных групп проводят в метанолъном растворе аммиака. В качестве альтернативного варианта защищенного гуанина для использования в синтезе карбоцшашческих аналогов был предложен Л -изобутироил-С -р- -нитрофенил)этил)]гуанин [67]. Его взаимодествие с различными замещенными циклопентанолами в условиях реакции Мицунобу приводило исключительно к Л -изомерам с выходами 70-75%. Удаление защитных групп проводили выдерживанием соответствующих защищенных производных в пиридине в присутствии DBU.
Наряду с вышеописанными методами синтеза негликозидных аналогов нуклеозидов, в которых в качестве исходных соединений используются нуклеиновые основания или их производные, в значительном количестве работ находят применение методы синтеза, ключевой стадией которых является циклизация с образованием пиримидинового или пуринового гетероциклов.
Конденсация цитруллина (78) с малоновым эфиром в присутствии этилата натрия с хорошим выходом приводит к производному барбитуровой кислоты (79). При замене малонового эфира на формилуксусный и применении водной щелочи в качестве основания с невысоким выходом образуется исключительно -замещенное производное урацила (80). Но поскольку обычно требуется получить ./Vі-замещенные производные урацила, то в конденсацию с соответствующей замещенной мочевиной (81) вводят р-этоксиакрилоилхлорид, при этом образуется промежуточное соединение (82), которое циклизуют с высоким выходом в кислой среде в производные урацила (83). Если в качестве исходных соединений используются карбоновые кислоты, то мочевины (81).
Начиная с середины 20го века для синтеза аденинов, гипоксантинов и б меркаптопуринов, замещенных по положению bf, в качестве исходного соединения, на основе которого достраивается имидазольньгй фрагмент пуринового гетероцикла, был предложен 5-амино-4,6-дихлорпиримидин (90) [76,77]. Традиционно последовательность превращений включала: взаимодействие пиримидина (90) с спиртовым раствором соответствующего первичного амина при высокой температуре в стальной бомбе с образованием продукта аминирования (91), его циклизацию в I f-замещенное производное б-хлорпурина (92) посредством нагревания в диэтоксиметилацетате при 120С. Соединения типа (92) использовались для получения производных: аденина (93) - аммонолизм; производных гипоксантина (94) - кислотным гидролизом; производных б-меркаптопурина (95) - взаимодействием с тиомочевиной с последующей обработкой щелочью и др.
Еще легче происходит замещение б-хлора в 4,б-ддхлор-5-нитропиримидине: реакция завершается за 30 мин при комнатной температуре в хлористом метилене в присутствии триэтиламина. Последующее восстановление 5-нитрогруппы удобно производить действием спиртового раствора двуххлористого олова. Описанньш подход был применен в синтезе циклобутеноБых аналогов нуклеозидов [86].
Для синтеза . -замещенных производных гуанина и 2,6-диаминопурина в основном используется два исходных соединения: 2-амино-4,б-дихлорпиримидин и 2,5-диамино-4,б-дихлор пиримидин. Разработаны нашедшие широкое применение эффективные методики для их трансформации в целевые продукты. Если в качестве исходного соединения применяют 2-амино-4,б-дихлорпиримидин (99), то последовательность превращений включает: нуклеофильное замещение 6-хлоргруппы; азосочетание пиримидина (100) и хлорида л-хлорфенилдиазония, восстановительное расщепление диазасоединения (101) с образованием производного 2,5,б-триамино-4-хлорпиримидина (102); его циклизация в производное 2-амино-б-хлорпурина (103), которое легко трансформировать в производные гуанина (104) и 2,6-диаминопурина (105):
Получение алісилирующих реагентов с концевой В-дикарбонилъной группой
В соответствии с поставленной задачей и выбранным методом, на первоначальном этапе нами были синтезированы алкилирующие реагенты (109а-с). о О о он (109 а-с) В качестве исходных соединений для синтеза (109а) и (109с) мы использовали 1,1,1,7-тетрахлоргептан (теломер С?) и 1,1,1,9-тетрахлорнонан (теломер Сэ), которые стали доступны после открытия Джойсом и сотр. реакции радикальной теломеризащш этилена и четыреххлористого углерода [102]. Оптимизация условий теломеризации и глубокое изучение химических свойств теломеров подробно описано в трудах А.Н. Несмеянова и его сотрудников. Кислотным гидролизом трихлорметильной группы теломеров получали со-хлоркислоты.
Для получения хлорида (109Ь) нам потребовалось синтезировать коммерчески недоступный хлорангидрид ш-хлоркаприловой кислоты. Взаимодействием гексаметиленбромгидрина с диэтилмалонатом, последующим гидролизом и декарбоксилированием была синтезирована га-гидр оксикаприловая кислот, которая без дальнейшей очистки переводилась взаимодействием с хлористым тионилом в целевой хлорангидрид (Схема 2). Поскольку гексаметиленбромгидрин был необходим нам в значительном количестве, а его стоимость неоправданно высока, мы синтезировали его, исходя из доступного є-капр о лактона (Схема 2),
В литературе описан двухстадийный метод получения этилового эфира є-гидроксикапроновои кислоты, заключающийся в гидролизе є-капролактона в щелочных условиях с последующей обработкой йодистым этаном. Для достижения высокого выхода целевого эфира необходимы значительные количества органических растворителей, как непосредственно для проведения реакций, так и для обработки реакционных масс [104].
Так как карбометоксигруппа восстанавливается алюмогидридом лития легче, чем карбоэтокси- мы были заинтересованы в синтезе метилового эфира є-гидроксикапроновой кислоты. Используя способность є-капр о лактона подвергаться алкоголизу в кислых условиях [105], выдерживанием лактона в метаноле в присутствии каталитического количества я-толуолсульфокнслоты нами был синтезирован целевой эфир, который посредством двустадийного превращения переводили в гексаметиленбромгидрин.
В 1954г. Сторком и сотр. был предложен метод получения а-моноалкилированных и а-моноацилированных кетонов алкилированием или ацилированием енаминов, соответственно [106]. Вскоре условия метода были оптимизированы. Было установлено, что ацилирование морфолиновых енаминов кетонов приводит к более высоким выходам а-ацилкетонов [107, 108], чем ацилирование пиперидиновых и пироллидиновых енаминов. Применение последних наиболее оправдано для синтеза сс-моноалкилированньгх кетонов [108, 109].
При попытке алкилирования цитозина с использованием DBU в качестве основания происходило сильное осмоление реакционной смеси, целевой продукт Л"1-алкилирования (110с) был выделен с низким выходом (б%). Для получения цитозинового производного (110с) нами также применялось алкилирование JV4-бензоилцитозина в присутствии DBU с последующим аммонолизом бензоильной группы. В этом случае суммарный выход (110с) на две стадии составил 27%.
Алкилирование адекина в присутствии DBU также проходило, в основном, по атому 7V9, что позволило получить соединение (110f) с выходом 48%. УФ-, масс-спектры и данные ЛМР-спектров (табл. 1 и 2) согласуются с его строением. Помимо изомера (110І), с выходом 5% был выделен более полярный продукт. Из спектров ЯМР следовало, что он отличается от Л -изомера лишь положением боковой цепи при пуриновом ядре. Для доказательства строения полученного изомера использовалась двумерная гетероядерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса. В то время как для /V-изомера (110І) проявлялись дополнительные сигналы, свидетельствующие о спин-спиновом взаимодействии дальнего порядка между атомами С4, С8 и НГ, для минорного продукта наблюдались взаимодействия С2, С4 и НГ, что говорит о том, что заместитель находится при атоме iv пуринового ядра.
Известно, что реакция алкилирования гуанина не приводит к удовлетворительным результатам в связи с плохой растворимостью последнего в апротонных биполярных растворителях. Поэтому обычно алкилируют не сам гуанин, а его производные по экзоциклическим заместителям с последующим удалением защитных групп. В качестве растворимого производного гуанина мы применяли 2-изобутироилгуанин, который с 80% вьгходом получали по описанной методике [67]. Реакция алкилирования 2-изобутироилгуа-Нина соединением (109а) в присутствии DBU приводила к смеси V- (110h) HJV7- (110І) изомеров. Из этой смеси индивидуальные вещества удалось выделить с выходами 8 и 12%о, соответственно.
Получение полиметиленовых производных нуклеиновых оснований с концевой фенилкетогруппой с использованием реагента (116а).
Попытка алкилирования тимина бутирофеноном (Пба) по разработанной нами ранее методике с применением DBU приводила, вместо ожидаемых W -моно- И N1 -биспроизводных, к циклопропилфенилкетону (117) с выходом 55% (Схема 11), продуктов же алкилирования нуклеинового основания в реакционной смеси обнаружено не было. Сопоставимый выход соединения (117) (78%) был получен в классических условиях синтеза производных циклопропана обработкой водной щелочью у-хлоркетонов [115]. Для подтверждения того, что азотсодержащие органические основания (например DBU) в данном случае действуют аналогичным образом, а присутствие нуклеинового основания не влияет на ход реакции, мы нагревали в ДМФА эквимолъные количества фенона (116а) и DBU в течение 20 ч при 80-100С, при этом циклопропилфенон (117) был получен с выходом -60%.
Таким образом, кетогруппа алкилирующего агента должна быть защищена, и удобной защитной группировкой оказалась 1,3-диоксолановая, которая легко вводится кипячением в толуоле у-хлорбутирофенона (116а) и избытка этиленгликоля в присутствии триэтилортоформиата и каталитического количества я-толуолсульфокислоты с азеотропной отгошшй воды. Таким образом был синтезирован алкилирующий реагент (118).
Применение соединения (11S) для алкилирования пиримидиновых нуклеиновых оснований в условиях, указанных на схеме 12, с хорошими выходами приводило к моноалкилированным производным (119а-с). В случае урадила и тимина наблюдалось также образование продуктов Л Л -бисалкилирования (120а-Ь).
Гипоксантин и аденин при ашшлировании реагентом (118) в присутствии DBU главным образом давали Дг -замещенные продукты (119d, е) (Схема 13). Реакция (118) с аденином приводила также к образованию небольшого количества сильнозагрязненного 1г-изомера (119f).
В ультрафиолетовых; спектрах синтезированных соединений полоса поглощения, обусловленная переносом электрона от карбонильной группы к фенильному радикалу, находится в области 245 нм (є 13000 Ы [см 1), перекрыв аясь для большинства синтезированных соединений с полосой поглощения хромофора нуклеинового основания, что делает УФ-спектры мало информативными.
Строение синтезированных соединений (121а) - (121h) полностью доказывают их Н-ЯМР- и 13С ЯМР-спектры (табл.7 и S). В ЯМР спектрах присутствуют три группы сигналов: сигналы соответствующих атомов ядра нуклеинового основания, сигналы атомов полиметиленовой цепи и сигналы концевой функциональной группы. Как и в случае р-дшсето производных, изомерным соединениям (121е) и (121f); (121g) и (121h) строение приписывалось на основании наличия "характерных эффектов ал копирования" в спектрах 13С-ЯМР. По сравнению с 7/-изомером (121 е) для А -изомера (1211) наблюдается сдвиг сигнала С2 в сильное поле (-8.9 м.д.) и сигнала С8 в слабое поле (-11.6 м.д.).
При взаимодействии в вьппеописанных условиях нуклеиновых оснований с реагентами (116b)-(116d), имеющими полиметиленовую цепь из 4, 6 и 8 метиленовых звеньев, реакция проходила гладко, приводя к ожидаемым продуктам алкилирования. Алкилированием тимина и урацила в присутствии DBU и алкилированием натриевой соли цитозина фенонами (116b)-(116d) с хорошими выходами были получены целевые //-замещенные пиримидины (122а)-(122с), (123а)-(123с), и (124а)-(124с) (Схема 15). Как и в предыдущих случаях, образование моиоалкилированых тимина и урацила сопровождалось образованием значительных количеств продуктов бис-алкилирования.
Производные JV7- и і -замещенного гуанина (122І), (122j); (123i), (123j); и (124i), (124j), были получены посредством хорошо себя зарекомендовавшего подхода, основанного на алкилировании Я2-изобутироилгуанина в присутствии DBU, с последующим удалением изобутироильной группы в основных условиях (Схема 17).
Полиметиленовые производные нуклеиновых оснований, несущие в ш-положении углеродной цепи различные функциональные группы - удобные и перспективные инструменты для изучения функционирования ферментов нуклеинового обмена. Отдельные представители данного класса соединений являются потенциальными кандидатами на роль лекарственных препаратов
Ранее в нашей лаборатории были синтезированы такие производные, несущие в со-положении углеродной цепи гидроксильные, карбоксильные и карбалкоксильиые функциональные группы. Было найдено, что подобные производные урацила, тимина, аденина и гипоксантина способны эффективно взаимодействовать с участком обратной транскриптазы ВИЧ, отвечающим за узнавание антикодона тРНКЬуЕ, и активировать этот фермент, ускоряя реакцию полимеризации. Причем сила взаимодействия зависит от природы основания и длины углеродной цепи.
При изучении взаимодействия с ДНК-топоизомеразой оказалось, что такие производные слабо ингибиругот фермент, причем активность производных урацила выше, чем у производных тимина [10].
Нам представлялось интересным и важным определить, влияют ли синтезированные в данной работе (3-дикетосоединения на энзиматическую активность обратной транскриптазы ВИЧ. В качестве тест-системы использовали реакцию синтеза ДНК в присутствии активированной ДНК, четырех dNTP (один РІЗ которых содержит в сс-положении [32Р]-метку) и обратной транскриптазы ВИЧ.
