Введение к работе
Актуальность работы. Одной из основных задач современной молекулярной биологии является всестороннее изучение процесса экспрессии генетической информации. Современные данные свидетельствуют о том, что экспрессия подавляющего большинства генов регулируется на многих уровнях. Тончайшая настройка всех клеточных систем в соответствии с потребностями клетки обеспечивается функционированием сложных многокомпонентных регуляторных сетей. В случае прокариотических организмов основная часть регуляторных событий приходится на уровень транскрипции, поэтому всестороннее, в том числе структурно-функциональное, изучение белковых транскрипционных регуляторов является приоритетной фундаментальной задачей молекулярной биологии прокариот.
Bacillus cereus - широко распространенный грам-положительный, спорообразующий, условно-патогенный для человека микроорганизм. Некоторые штаммы B.cereus могут вызывать пищевые отравления, пост-травматические инфекции, а также другие заболевания. Патогенные свойства B.cereus определяются синтезом многочисленных белковых токсинов, различающихся по механизму действия на ферментативные (например, сфингомиелиназа и др.) и порообразующие (гемолизин BL, гемолизин II и др.). В настоящее время в научной литературе охарактеризовано всего три регулятора, контролирующих экспрессию токсинов B.cerevs. Это (і) глобальный регулятор PlcR, активирующий более ста генов и оперонов, (if) плейотропный регулятор Fur, контролирующий синтез металлопротеинов и некоторых токсинов, а так же (iii) HlyllR - регулятор экспрессии гена гемолизина II. Следует отметить важность работ по выяснению деталей функционирования транскрипционных регуляторов, контролирующих синтез токсинов B.cereus, ведь они закладывают основы нашего понимания логики принятия решений патогенными микроорганизмами, а значит, в перспективе, позволят более эффективно проводить терапию вызванных ими заболеваний.
Цели и задачи исследования:
Целью настоящей работы являлось детальное изучение структуры транскрипционного регулятора НІуІШ. B.cereus. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:
определение олигомерной формы HlyllR в растворе и в бактериальной клетке, как в свободном состоянии, так и при взаимодействии с оператором;
получение кристаллов HlyllR и экспериментальное определение его пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа;
анализ структуры HlyllR и выявление структурно и функционально важных областей с помощью направленного мутагенеза, экспериментальное определение структур мутантов;
кристаллизация комплекса HlyllR с операторной ДНК.
Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Т.К. Скрябина РАН.
Научная новизна работы. Впервые определена пространственная структура транскрипционного регулятора, участвующего в контроле синтеза токсинов B.cereus, установлено, что белок HlyllR в растворе и при взаимодействии с ДНК, in vitro и in vivo существует в виде димера. Впервые получены данные, указывающие на возможное участие стероидных производных в регуляции экспрессии гена гемолизина П, и показана способность мутантного варианта белка TetR-семейства к образованию альтернативного димера.
Координаты атомов транскрипционного регулятора HlyllR и его мутантов, определенные методом рентгеноструктурного анализа, занесены в Protein Data Bank (коды PDB 2FX0,2JJ7 и 2ЖЗ).
Практическое значение работы. Определение структуры HlyllR создает основу для понимания молекулярной логики регуляции экспрессии гена гемолизина II B.cereus, а точная идентификация яизкомолекулярного лиганда, взаимодействующего с HlyllR, мойсет оказаться важной для терапии инфекций и пищевых отравлений, вызванных данным микроорганизмом. Выявление неожиданной способности мутанта HlyllR образовывать альтернативный димер представляет интерес с фундаментальной точки зрения, для углубления нашего понимания деталей белок-белковых взаимодействий и образования четвертичной структуры белка.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в реферируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на Пущинской школе-конференции молодых ученых (2006), конференции молодых ученых
«Ломоносов» (МГУ, 2008), конференциях «Molecular Genetics of Bacteria and Phages» (Колд-Спринг-Харбор, США, 2008) и «Gram-positive pathogens» (Омаха, США, 2008).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 136 источников. Работа содержит 28 рисунков и 4 таблицы.
