Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Общая характеристика Neisseria gonorrhoeae 10
1.2 Гонококковая инфекция. 14
1.2.1 Основные факторы патогенности и патогенез гонореи 14
1.2.2 Эпидемиология 19
1.2.3 Лечение. Проблема лекарственной устойчивости 20
1.3 Внутривидовая вариабельность N. gonorrhoeae и гетерогенность популяции 25
1.3.1 Морфологический полиморфизм гонококков 25
1.3.2 Физиологическая и серологическая гетерогенность гонококков 27
1.3.3 Фенотипическая гетерогенность гонококков. Лекарственная устойчивость 29
1.3.3.1 Формирование устойчивости к различным классам антимикробных препаратов 30
1.3.3.2 Методы оценки лекарственной устойчивости возбудителя. Анализ генетических маркеров 40
1.3.4 Современные подходы к оценке гетерогенности популяции N. gonorrhoeae 45
1.3.4.1Типирование 46
1.3.4.2 Типирование мультилокусным секвенированием 48
1.3.4.3 Прямое белковое профилирование с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии 50
2 Материалы и методы 53
2.1 Бактериальные штаммы 53
2.2 Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae 54
2.2.1 Бактериальные клетки 54
2.2.2 Экстракция белков (грубый лизис бактериальных клеток) 54
2.2.3 Сокристализация матрицы и аналита 54
2.2.4 Масс-спектрометрический анализ 55
2.2.5 Интерпретация масс-спектров 56
2.3 Генетический анализ штаммов N. gonorrhoeae 57
2.3.1 Выделение тотальной ДНК N. gonorrhoeae 57
2.3.2 Амплификация фрагментов генома N. gonorrhoeae 57
2.3.3 Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа 61
2.3.4 Минисеквенирование и масс-спектрометрический анализ продуктов реакции 61
2.3.5 Секвенирование фрагментов генов рог, рагС, «домашнего хозяйства» 65
2.3.6 Анализ нуклеотидных последовательностей генов рог, рагС, «домашнего хозяйства» 66
2.4 Математический анализ данных 66
3 Результаты 68
3.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae 68
3.2 Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae 68
3.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae 78
3.4 Типировапие штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции 89
3.4.1 Типирование 89
3.4.2 Типировапие мультилокусным секвенированием 94
4 Обсуждение 98
4.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N .gonorrhoeae 98
4.2 Прямое белковое профилирование 98
4.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae 103
4.4 Типирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции. 109
Заключение 116
- Гонококковая инфекция.
- Современные подходы к оценке гетерогенности популяции N. gonorrhoeae
- Анализ нуклеотидных последовательностей генов рог, рагС, «домашнего хозяйства»
- Прямое белковое профилирование
Введение к работе
Гонорея - одна из наиболее распространенных на сегодняшний день инфекций, передающихся половым путём, остается актуальной проблемой в области практического здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость гонореей в мире составляет около 60 миллионов случаев в год [1]. В России этот показатель также остается на достаточно высоком уровне - около 100 случаев на 100 тысяч населения в год [2, 3]. По этой причине, как в Российской Федерации (РФ), так и во многих странах мира, гонорея включена в список инфекций, подлежащих обязательной статистической регистрации на национальном уровне (наряду с сифилисом, хламидийной инфекцией и др.) [4, 5].
Возбудитель гонореи - грамотрицательный диплококк Neisseria gonorrhoeae, способный колонизировать эпителий уретры, шейки матки, глотки, прямой кишки, конъюнктивы и некоторые другие эпителии с развитием инфекций нижних отделов мочеполового тракта, воспалительных заболеваний органов малого таза, конъюнктивита, проктита, фарингита, диссеминированной гонококковой инфекции. Особенностью современной гонореи является увеличение вялотекущих и асимптомных форм заболевания, хроническое течение, многоочаговость поражения верхнего и нижнего отделов мочеполового тракта. Отмечен высокий уровень постгонорейных осложнений, приводящих к женскому и мужскому бесплодию, случаев генерализации гонококковой инфекции с поражением суставов, клапанов сердца, аорты, кожи [6].
Объяснением указанных свойств гонококковой инфекции, очевидно, служит высокая изменчивость и пластичность возбудителя, способность к быстрому адаптивному изменению фенотипических и генетических характеристик. Так, предпосылки для хронизации и генерализации патологического процесса создает способность гонококка к L-трансформации и внутриклеточной инвазии. Генетические механизмы,
способствующие формированию гетерогенности популяции N. gonorrhoeae, включают внутри- и межвидовую ДНК-трансформацию, что примечательно, в любом периоде жизненного цикла, активную передачу информации с помощью плазмид, рекомбинацию. Гонококк характеризует высокое содержание в геноме супермутабельных и мозаичных генов, значительная вариабельность структуры пилей, белков наружной мембраны (Рог, Ора), и как следствие, культуральных и антигенных свойств гонококка (в частности, антигенная мимикрия), его вирулентных и персистентных характеристик. Благодаря высокой пластичности генома, под давлением воздействия антибактериальных средств N. gonorrhoeae реализует практически все известные механизмы лекарственной устойчивости.
Поэтому, с точки зрения современной клинической микробиологии, особенно актуальным становится разработка не только максимально точных, но и быстрых, сравнительно недорогих методик идентификации и характеристики N. gonorrhoeae по основным, клинико-эпидемиологическим параметрам (так называемых, методов «быстрой микробиологии»). Между тем, использование традиционных подходов к диагностике гонококковой инфекции сопряжено на практике с известными трудностями. Гонококки относятся к достаточно прихотливым бактериям, требуют сложных питательных сред для культивирования и высокой квалификации персонала лаборатории. Поэтому процедуры микробиологической идентификации гонококка, включающие высев на питательной среде отделяемого уретры или цервикального канала, выделение чистой культуры гонококка, поддержание жизнеспособности микроба для определения профиля чувствительности к антибиотикам, характеризуются сложностью стандартизации, трудоемкостью и длительностью анализа.
Тогда как современные достижения молекулярной биологии открывают возможности альтернативных подходов к идентификации и характеристике отдельных штаммов N. gonorrhoeae и популяции в целом. Вслед за
различными диагностическими тестами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (nucleic acid amplification tests, NAATs), для оценки лекарственной устойчивости возбудителя был предложен новый подход, представляющий собой определение генетических детерминант устойчивости. В его основе лежит амплификация мобильных детерминант устойчивости наравне с амплификацией генов, белковые продукты которых являются мишенями для действия антибиотиков, и определение в структуре детерминант точечных нуклеотидных полиморфизмов, являющихся маркерами формирования устойчивости, с помощью реакции минисеквенирования и анализом продуктов с использованием MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.
Этот же высокоточный и быстрый метод анализа молекулярных масс биополимеров (нуклеиновых кислот, белков, липидов) лежит в основе предложенного недавно подхода, предназначенного для быстрой идентификации и внутривидовой классификации микроорганизмов путём регистрации и сравнительного анализа белковых масс-спектров, специфичных для разных видов. Интересным представляется оценка возможности использования этого подхода для идентификации и, возможно, типирования гонококка, проявляющего, как указывалось выше, высокую пластичность и гетерогенность в популяции.
Действительно, давно описанный морфофизиологический полиморфизм, а затем и генетическая пластичность N. gonorrhoeae, являются центральными проблемами молекулярной эпидемиологии гонококка. Разрабатываются и совершенствуются различные методы штаммовой идентификации и типирования N. gonorrhoeae с целью прояснить некоторые общие аспекты структуры популяции гонококка, а также выявить локальные эпидемиологические особенности возбудителя, определить тенденции в динамике и распространении клинически значимых признаков в популяции.
Одним из перспективных признан подход, заключающийся в определении изменений последовательности рог гена гонококка (рог-типирование). Стоит отметить, что Рог белок, играющий важную роль в процессах адгезии к эпителиоцитам и инвазии внутрь клеток, характеризуется высокой изменчивостью, поэтому отдельные структурные вариации в соответствующих генетических локусах рог гена, могут иметь эволюционные преимущества, из чего следует подверженность их селекции. Эти свойства "объекта" типирования позволяют использовать данный подход для оценки быстрых адаптационных изменений гонококка, краткосрочных эволюционных тенденций развития популяции, а также для оценки её гетерогенности в небольших, относительно замкнутых группах пациентов.
Отличную идеологию содержит в себе, предложенный относительно недавно для типирования популяции N. gonorrhoeae, метод мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST, в основе которого лежит секвенирование строго определенного набора фрагментов «генов домашнего хозяйства», имеющих достаточное число аллельных вариантов, характеризующихся медленным накоплением мутаций и селективно нейтральных. Предполагаемая область его использования - это оценка макроэволюции популяции в целом и тенденций в динамике больших популяций, затрагивающих обширные территории.
Отдельно следует заметить, что в РФ отсутствует какая-либо развитая система типирования N. gonorrhoeae, информация о региональных особенностях лекарственной устойчивости крайне скудна, разрознена и зачастую неактуальна (ретроспективные исследования).
Таким образом, дальнейшая разработка и адаптация методов молекулярного типирования гонококка, а также комплексная характеристика популяции N.gonorrlweae, распространенной на территории РФ, представляются актуальными задачами, решение которых подразумевает фундаментальные и медицинские аспекты исследования.
Целью настоящей работы являлалсь разработка и сравнение различных методов молекулярного типирования N. gonorrhoeae и использование их для характеристики популяции возбудителя, распространённой на территории Российской Федерации.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Формирование коллекции образцов ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от больных из различных регионов Российской Федерации.
Разработка системы комплексной оценки антибиотикоустойчивости N. gonorrhoeae на основе знаний о генетических механизмах формирования устойчивости возбудителя, включающей определение известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.
Оптимизация методики прямого масс-спектрометрического белкового профилирования и оценка возможности типирования клинических штаммов N. gonorrhoeae с использованием данного подхода.
Реализация схемы por-типирования для характеристика коллекции российских клинических штаммов N. gonorrhoeae.
Анализ гетерогенности «генов домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae и разработка схемы типирования мультилокусным секвенированием клинических штаммов гонококка.
Молекулярно-эпидемиологическая характеристика группы клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных на территории РФ, включающая 1) анализ распространенности и вклада различных механизмов в формирование лекарственной устойчивости N.gonorrhoea, 2) анализ структуры и оценка гетерогенности исследуемой популяции N.gonorrhoea.
Гонококковая инфекция.
N. gonorrhoeae имеют множество факторов патогешюсти, хотя и не продуцируют каких-либо экзотоксинов. К основным факторам патогенности относят капсулу, пили, ЛОС, белки внешней мембраны, железо-связывающий белок, IgA-протеазу. Как уже говорилось выше, бактерии свежевыделенных культур имеют капсулу, которая проявляет антифагоцитарные свойства (препятствует прямому контакту микробицидных субстанций с клеточной стенкой, маскирует ее антигенные детерминанты). Важнейшим фактором адгезии служат многочисленные пили [9], обнаруживаемые только в колониях 1 и 2 типа по Келлогу. Показано, что гонококки, несущие пили более вирулентны, чем микроорганизмы лишенные пилей [19, 20]. В механизме прикрепления важное значение имеет гидрофобность поверхности: пили содержат до 25% гидрофобных аминокислот, благодаря которым осуществляется погружение гидрофобной части ворсинок в липиды клеточной мембраны хозяина. Генетически опосредованная вариабельность строения пилей обеспечивает антигенное разнообразие, прикрепление и выживаемость гонококков на клетках эпителия при смене хозяина или воздействии антител [21]. Липоолигосахарид - один из важнейших факторов вирулентности N gonorrhoeae. Этот гликолипид внешней мембраны участвует в процессах уклонения от реакций иммунной системы (связывание сиаловой кислоты и формирование микрокапсулы), прикрепления к эпителиальным тканям [22], инвазии, обуславливает токсическое повреждение эпителия фаллопиевых труб [23], стимулирует выработку антител, проявляющих бактерицидные свойства [24, 25]. Типично высвобождение во время роста фрагментов внешней мембраны, которые содержат, в том числе, и ЛОС, являющийся эндотоксином, который стимулирует развитие интенсивного воспалительного процесса, обуславливает лихорадку и другие симптомы. Белки наружной мембраны (или поверхностные белки) также проявляют сильные иммуногенные свойства. В присутствии комплемента антитела к белкам наружной мембраны проявляют бактерицидные свойства. Выделяют белки наружной мембраны I, II, и III классов [26]. Белки наружной мембраны I класса (ОМР I, P.I, porins) или Рог белки. Основной структурный белок наружной мембраны, он составляет 60% всех поверхностных белков [6]. Обеспечивает транспорт гидрофильных веществ (в том числе антибиотиков), может предотвращать формирование фаголизосом в нейтрофилах и/или снижать окислительный взрыв. Белки I и II класса усиливают адгезию патогена, его внутриклеточную инвазию, антифагоцитарную активность, устойчивость к бактерицидным факторам сыворотки. Белок I класса (Рог), являясь мишенью для бактерицидных антител, может избегать их действия благодаря выраженной эпитопной изменчивости.
Различают два подкласса Рог белка (А и В), различающихся поверхностными концевыми структурами. Гонококки, экспрессирующие разные варианты этого белка, проявляют различные вирулентные свойства (см. раздел 1.3.2). Белки наружной мембраны II класса (ОМР II, Р.П, Ора proteins) участвуют в процессах прикрепления к эпителию, инвазии [27], эндоцитоза в слизистые оболочки, взаимодействия с фагоцитами. Характерна вариабельность в экспрессии: различие в количестве белков у разных штаммов, вплоть до полного отсутствия. Отсутствие экспрессии Ора белков ассоциировано с устойчивостью к фагоцитозу полиморфноядерными лейкоцитами, а также характерно для штаммов, выделенных из фаллопиевых труб, крови, синовиальной жидкости. Такие штаммы считаются наиболее вирулентными и устойчивыми к бактерицидному действию сыворотки. Кроме того, Ора белки характеризуются также высокой вариабельностью [28]. Показана антигенная вариабельность Ора белков внутри штамма in vivo, детерминированная кодированием их в нескольких генах (11 копий), размером около 800 п.н., а также интер- и интрагеномной рекомбинацией. Гипервариабельные районы белков Ора используют в типировании N. gonorrhoeae. Белки наружной мембраны III класса (ОМР III, Р.Ш, reduction-modifiable proteins) или Rmp белки. Их функции мало изучены. Известно, что связывание Rmp белком специфичных ему антител вызывает блокирование антител к Рог белкам и ЛОС гонококков, что защищает бактерию от комплимент-опосредованного лизиса. Следует отметить, что попадание гонококков в организм человека не всегда приводит к развитию заболевания, так как значение имеют вирулентность возбудителя, инфекционная доза, место проникновения, функциональное состояние факторов неспецифической защиты и скорость развития иммунных реакций. Патогенез гонореи включает комплекс взаимодействий различных бактериальных факторов с иммунной системой человека, где ключевым моментом является взаимодействие бактерии с субстратом колонизации. N. gonorrhoeae способна колонизировать цилиндрический эпителий уретры, шейки матки, фаллопиевых труб и яичников, глотки, конъюнктивы и прямой кишки и вызывать развитие широкого спектра заболеваний: 1) инфекции нижних отделов мочеполового тракта: цервицит, простатит, орхит, уретрит; 2) инфекции верхних отделов мочеполового тракта: воспалительные заболевания органов малого таза - эндометрит, сальпингит, оофарит; 3) инфекции прочих органов и тканей: конъюнктивит, проктит, фарингит, бленнорея, тазовый перитонит, фарингальная гонорея; 4) диссеминированная гонококковая инфекция: синдром дерматита-артрита-тендосиновиита, септический моноартикулярный артрит, эндокардит, менингит.
Бактерия прикрепляется к клеткам эпителия (с участием пилей и Ора белков), где мишенью для их цитотоксического действия служат поверхностные структуры клеток. Бактерии вызывают гибель и слущивание клеток, что нарушает процесс самоочищения слизистых оболочек. Колонизируя эпителий, даже тот, который содержит реснитчатые клетки (например, однослойный цилиндрический эпителий маточных труб), гонококки всегда прикрепляются к клеткам, лишенным ресничек. Однако, микроворсинки этих клеток, стимулируемые гонококком, действуют как псевдоподии и, таким образом, захватывают бактерии. Подобное явление известно как эндоцитоз, опосредованный паразитическим микроорганизмом. В цитоплазме клеток эндосомы, содержащие бактерии, сливаются в гигантские вакуоли, где гонококки размножаются, оставаясь недоступными действию антител, фагоцитов и многих антибиотиков. Вакуоли транспортируются к базальной мембране, и путем экзоцитоза бактерии попадают в прилегающую соединительную ткань, где вызывают местное воспаление, либо проникают в кровоток с возможным последующим диссеминированием. Одновременно с адгезией и инвазией часть клеток бактерии может фагоцитироваться полиморфноядерными лейкоцитами (нейтрофилами), и поэтому гонококки часто обнаруживаются внутриклеточно [7, 29, 30, 31]. Бактериальный Рог белок блокирует способность фагоцитов убивать поглощенный микроорганизм, что также способствует хронизации и генерализации патологического процесса. При острой гонорее обычно процесс начинается с поражения цилиндрического эпителия слизистой оболочки мочеполового тракта: у мужчин поражается передний отдел уретры, а у женщин - цервикальный канал. Однако в 60-80% случаев у женщин гонорея протекает скрыто, бессимптомно, что ведёт к генерализации процесса. Поэтапная инвазия гонококка сквозь эпителий и по лимфатическим сосудам приводит к поражению соседней ткани и органов. У мужчин, в таких случаях, в процесс вовлекаются железы Литтре, предстательная железа, семенные пузырьки, куперовы железы, семявыносящий проток, придатки яичек. У женщин развивается восходящая инфекция малого таза: поражение эндометрия, фаллопиевых труб, яичника, брюшины [6]. В последнее время чаще стали встречаться экстрагенитальные формы гонореи. Кроме известного поражения глаз у новорожденных (острый гнойный коныоктивит или бленнорея), описаны случаи поражения гонококком полости рта и глотки, печени, суставов, кожи, нервной системы, легких и других органов. В настоящее время отмечено увеличение торпидно протекающих субъективно-асимптомных форм неосложнённой и осложненной гонореи не только у женщин, но и у мужчин, что представляет большую эпидемиологическую опасность.
Современные подходы к оценке гетерогенности популяции N. gonorrhoeae
Как альтернатива A/S-типированию для характеристики и штаммовой дифференциации N. gonorrhoeae были предложены новые подходы, как правило, основанные на анализе изменчивости отдельных генов или бактериального генома в целом. К таким подходам относятся амплификация фрагментов генома с использованием случайных праймеров (AP-PCR) [119, 120], анализ полиморфизма длин амплифицируемых фрагментов генома (AFLP) [121, 122]. Для оценки генетической гетерогенности штаммов и их дискриминации использовали анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для всего генома или отдельных его участков. В этой области нашли широкое применение методы пульс-гель электрофореза (PFGE) [123, 124, 125, 126]. Для разделения штаммов гонококков в рамках одного ауксотипа был использован анализ рестрикционного полиморфизма генов рРНК (ribotyping) [127, 128,], но он выявил лишь ограниченное число подтипов. Позже ПДРФ-анализ был использован для предварительно амплифицированных генов. Например, был продемонстрирован рестрикционный анализ рибосомальной ДНК [129, 130]. Особенно эффективным оказался ПЦР-ПДРФ анализ гетерогенности ора генов, предложенный O Rourke (ора-типирование) [131]. Метод включает стадию амплификации многокопийного гена (11 копий), кодирующего второй белок наружной мембраны N. gonorrhoeae (Р.П, Ора-белок) с последующим рестрикционным анализом. Сравнение нескольких подходов показало, что анализ полного генома методами AFLP, AP-PCR, PFGE и ора-типирования позволяет идентифицировать клинические изоляты N. gonorrhoeae с большей эффективностью, нежели при использовании классического серотипирования. Более того, наивысшей эффективностью дискриминации (дискриминационный индекс 0,9) обладают методы PFGE и ора-типирования [132]. Как и все гель-электрофоретические методики, эти методы с трудом стандартизируются и характеризуются сложностью обработки результатов (полоски на снимке гель-электрофореза) и поэтому относятся к так называемым «методам одной лаборатории». 1.3.4.1 /jor-типирование Рог белок является структурным компонентом наружной мембраны гонококка и экспрессируется постоянно.
Структура его антигенных детерминант остается неизменной у данного штамма, культивируемого in vitro, а значит, служит его уникальной характеристикой. Вместе с тем, Рог белок, играющий важную роль в процессах адгезии к эпителиоцитам и инвазии внутрь клеток и являющийся мишенью для антител, характеризуется ярко выраженной адаптивной изменчивостью. В геноме кодируется однокопийным рог геном (длина варьирует в пределах 1000-1100 п.н.), высокая частота рекомбинационных и мутационных событий в котором и определяет значительную гетерогенность поринов в популяции гонококка. Очевидно, отдельные структурные варианты Рог белка, а с ними и изменения в соответствующих генетических локусах рог гена, в определенных условиях, будут иметь эволюционные преимущества, из чего следует подверженность их селекции. Генетический анализ изменчивости поринов, вероятно, позволил бы фиксировать быстрые адаптационные изменения N. gonorrhoeae, оценивать гетерогенность и прогнозировать краткосрочную динамику развития небольших относительно замкнутых популяций бактерии, проводить точную штаммовую идентификацию. Аналогично с методикой оря-типирования, был исследован полиморфизм рог гена с помощью амплификации и рестрикционного анализа. Это подход показал степень дискриминации штаммов гонококка схожую с таковой для A/S-типирования [133]. Благодаря развитию и доступности методик секвенирования нуклеиновых кислот стало возможным говорить о прямом определении нуклеотидной последовательности рог гена с целью изучения его изменчивости и мозаичности, и в дальнейшем характеристики популяции N. gonorrhoeae (ряг-типирование) [134, 135, 136, 137, 138]. Окончательно, этот подход был сформулирован в 2000 году и проведено его сравнение с ора-типированием, показавшее достаточно высокую дискриминирующую способность обоих методов [139]. Однако, методы, сопряженные с анализом и сравнением полос на гель-электрофоретических снимках (PFGE, ора-типирование), явно уступают рог-типированию, в основе которого лежит более объективный, прямой анализ нуклеотидных последовательностей гена. Очевидным преимуществом также является легкость стандартизации и возможность сравнения данных, получаемых в разных лабораториях и группах. Была также предложена схема гибридизационного анализа генетического полиморфизма рог гена, позволяющая проводить генотипирование штаммов N. gonorrhoeae на основании взаимодействия олигонуклеотидных зондов с типоспецифичными локусами (петлями) этого гена [140]. Типирование штаммов N. gonorrhoeae осуществляется по аналогии с серотипированием на основании различных сочетаний уникальных фрагментов рог гена. Такой подход открывает прекрасные возможности для масштабирования технологии типирования N. gonorrhoeae, перевода всей процедуры в формат ДНК-микрочипа, но однозначно применим только для типирования генетически охарактеризованной популяции N. gonorrhoeae. Таким образом, наиболее информативным на сегодняшний день подходом генотипирования локальных популяций N. gonorrhoeae представляется /юг-типирование. Этот подход даёт возможность проводить штаммовую идентификацию, отслеживать генетическую изменчивость штаммов N. gonorrhoeae при заражении полового партнера и дальнейшем распространении инфекции, и при проведении курса антибиотикотерапии.
Анализ структуры популяции возбудителя, оценка её гетерогенности и скорости накопления новых свойств позволит, например, дифференциировать эндемичную для данной территории инфекцию (характеризующуюся циркуляцией штаммов в популяции и, как следствие, их высокой гетерогенностью) от инфекции, носящей характер эпидемии, вызванной новым штаммом, привнесенным в популяцию извне. 1.3.4.2 Типирование мультилокусным секвснированием Как показано выше, ог-типирование N. gonorrhoeae - один из лучших методов, фиксирующих быстро развивающиеся изменения в популяции, что позволяет решать задачи локальной эпидемиологии. Однако, подобные подходы оказываются неэффективными при глобальном анализе популяции возбудителя, затрагивающем значительные ареалы распространения или всю популяцию в целом. Альтернативные подходы используют анализ изменений, которые происходят относительно редко, медленно накапливаются и, вероятно, селективно нейтральны. Каждый из анализируемых локусов даёт небольшое число аллелей, но анализ нескольких локусов одновременно позволяет достичь высокой дискриминирующей способности метода. К таким методам можно отнести мультилокусный белковый электрофорез (multilocus enzyme electrophoresis, MLEE) [141, 142, 143, 144]. Главным недостатком этого метода, как и других электрофоретических методик, считается трудность сравнения результатов, полученных в разных лабораториях. В 1998 году М. С. J. Maiden et al. был предложен подход, развивающий и совершенствующий принцип мультилокусного белкового электрофореза, но основанный на прямом определении нуклеотидной последовательности соответствующих генов [145]. Метод получил название типирования мультилокусным секвенированием (Multi Locus Sequence Typing, MLST). Он заключается в секвенировании определенного набора «генов домашнего хозяйства» (обычно 6-7 генов), имеющих достаточное число аллелей (более 10), характеризующихся медленным накоплением мутаций и селективно нейтральных. В результате, каждый штамм характеризуется специфическим «аллельным профилем» (или «сиквенс-типом») по выбранным локусам. Сравнение полученных данных между собой, выяснение эволюционных связей между штаммами, их генетического расстояния производится с использованием специализированного программного обеспечения.
Анализ нуклеотидных последовательностей генов рог, рагС, «домашнего хозяйства»
Для учёта результатов исследования, формирования промежуточных таблиц, осуществления элементарных расчётов, описательной статистики, построения диаграмм использовали программные ресурсы пакета Microsoft Office Excel 2003. Все статистические тесты проводили для уровня значимости /? 0,05. Так как в исследовании мы имели дело с качественными номинальными признаками (значения которых не могут быть упорядочены по какому-либо семантическому принципу), для подтверждения наличия ассоциации генотипов и категорий чувствительности, оценки силы связи были выбраны критерий % -квадрат и коэффициент сопряженности Крамера, соответственно. Основные статистические расчёты производили с помощью пакета Statistica 6.0. Для численной оценки дискриминирующей способности методов типирования использовали индекс разнообразия Симпсона [163], который вычисляется по следующей формуле: , s ;=i где S - число групп, на которое данный метод разделяет всю выборку штаммов, п, - число штаммов в j-й группе и N - общее число штаммов в исследованной выборке. что означает определение вероятности того, что два разных штамма из тестируемой выборки, будут отнесены с использованием данной методики к разным типам. Согласно общепринятой практике, приемлемыми считаются методы типирования (или их комбинации), имеющие значение индекса Симпсона 0,9 и выше [164]. 3.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae В исследование включена группа из 464 клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от пациентов из 14 региональных центров РФ. Для всех исследованных штаммов в бактериологической лаборатории ФГУ ЦНИКВИ Росздрава были определены МПК к 5 антибиотикам, относящимся к разным классам (пенициллин, тетрациклин, ципрофлоксацин, спектиномицин, цефотаксим). Нами проведено выделение ДНК клинических штаммов, сформирован лабораторный банк ДНК. Количество штаммов, проанализированных несколькими использованными в данной работе молекулярными методами было неодинаковым: анализ генетических маркеров резистентности проведен для всех 464 клинических штаммов; в исследовании возможностей прямого белкового профилирования с помощью MALDIOF масс-спектрометрии было использовано 278 штаммов; сравнение методов /w-типирования и MLST было проведено с использованием группы, состоящей из 84 штаммов. 3.2 Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae Цельные бактериальные клетки культуры N. gonorrhoeae подвергали прямому белковому анализу с использованием MALDIOF масс-спектрометрии.
Для этого на первом этапе с использованием лабораторного штамма Е. coli DH5a отработали методики получения белкового экстракта и масс-спектрометрического анализа, с целью получения воспроизводимых и максимально насыщенных масс-спектров. При выборе оптимального протокола лизат клеток Е. coli DH5a в растворе AT анализировали с помощью MALDIOF MS с использованием 3-х вариантов матричных Для анализа воспроизводимости полученных масс-спектров определяли дисперсии значений m/z, относительной интенсивности и частоты регистрации отдельных пиков. В таблице 7 представлены результаты анализа 10 масс-спектров в виде их пик-листов, объединяющих данные двух разных экспериментов (двух культивирований штамма АТСС 49226). Максимальное среднеквадратичное отклонение составило для m/z - 2,8 Да, для относительной интенсивности - 0,24. Из всего набора регистрируемых сигналов выделены 20 устойчиво воспроизводимых пиков, для которых частота регистрации была равной или более 0,7. Из них 12 пиков удалось соотнести с рибосомальными белками бактерии. Разработанный протокол использован для проведения прямого белкового профилирования 278 клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от пациентов из различных региональных центров России. На основании сравнительного анализа полученных масс-спектров и пик-листов выявлены три пика со значениями m/z равными 4473, 5051 и 8165 (согласно масс-спектру N. gonorrhoeae АТСС 49226), которые меняются у ряда штаммов на 4487, 5081 и 8146, соответственно. По результатам поиска в базе данных, они были, предположительно, соотнесены с рибосомальными белками RL36, RL34 и RL31, соответственно. Для подтверждения этого предположения, а также установления молекулярной основы наблюдаемых изменений, были амплифицированы и секвенированы последовательности соответствующих генов N gonorrhoeae - rpmJ, гртН и гртЕ.
В каждом из генов был обнаружен единственный значимый нуклеотидный полиморфизм, приводящий к соответствующей аминокислотной замене (рис.6). Осуществлен дизайн праймеров для реакций амплификации (частично использованы ранее предложенные последовательности праймеров [14, 72, 82, 83, 139, 159]), минисеквенирования и секвенирования 15 генетических локусов, изменения которых ассоциированы с возникновением феномена лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae к 5 классам АМП (пенициллины, тетрациклины, макролиды, фторхинолоны и спектиномицин). Используемая схема анализа включает регистрацию генетических маркеров, обусловленных как приобретением новых генетических элементов, так и мутациями в специфических хромосомных локусах бактерии. С целью уменьшения себестоимости и повышения общей производительности анализа отработаны максимально универсальные условия проведения реакций амплификации, минисеквенирования и секвенирования, в цепочке последовательных технологических этапов существенно минимизировано количество операций по переносу и разведению образцов, все процедуры приведены к формату 96-ти луночного планшета (см. раздел «Материалы и методы»). Проведен комплексный анализ группы из 464 клинических штаммов N. gonorrhoeae, для каждого из которых получен индивидуальный профиль из 15 генетических маркеров резистентности, сгруппированных по ожидаемой ассоциации с конкретными классами АМП (приложение 1). По данным проведённых тестов на чувствительность к пенициллину в исследованной группе штаммов 122 (26,3 %) относились к категории чувствительных и 342 (73,7 %) к категории резистентных. Для регистрации генетических детерминант формирования резистентности гонококка к пенициллину, согласно литературным данным, были выбраны следующие маркерные гены: Ыа (ТЕМ-1 /?-лактамаза), мутации в генах ропА, репА (ПСБ 1, 2), репВ локус рог-гена (Рог белок), mtrR (эффлюксный белок MtrR). Частоты обнаружения маркеров устойчивости составили: Ыа - 3,9 % (18 из 464 штаммов), мутации в генах ропА - 71,3 % (326), репА - 87,7 % (407), репВ - 54,3 % (252), mtrR - 48,3 % (224). Отсутствие выбранных маркеров
Прямое белковое профилирование
Наряду с анализом генетической гетерогенности для типирования N. gonorrhoeae использован новый развивающийся подход, обозначенный нами как прямое белковое профилирование с использованием MALDIOF масс-спектрометрического анализа. Терминология в этой области ещё не устоялась, и в англоязычной литературе этот подход имеет разные названия: "Intact-cell mass-spectrometry", "Whole-cell mass-spectrometry" и др. [152, 156, 166, 167]. Все эти формулировки стараются подчеркнуть стремление к прямому использованию масс-спектрометрии для анализа целой клетки, т.е. без сложных процедур фракционирования, выделения и очистки отдельных клеточных компонентов. Напомним, что суть метода заключается в получении масс-спектра сложной смеси биомолекул (в частности, белков), характеризующего микроорганизм как вид или какое-либо его метаболическое состояние. Применение MALDIOF масс-спектрометрического анализа для характеристики микробной клетки уже анонсировано, например, для идентификации микобактерий [154], представителей семейства Enterobacteriaceae [151], типирования штаммов бетагемолитических стрептококков [155]. В ряде работ предлагается использовать различные матричные растворы и методики подготовки образца бактериальной культуры для масс-спектрометрического анализа [152, 154, 165], в которых демонстрируются результаты разной степени качества и информативности. Поэтому для исследования возможностей прямого белкового профилирования N. gonorrhoeae с помощью MALDIOF масс-спектрометрического анализа на первом этапе была отработана методика пробоподготовки с использованием лабораторного штамма Е. coli DH5a. В ходе тестирования трех матричных растворов показано, что использование в качестве матрицы сс-СНСА позволяет получить максимально гомогенную структуру и форму кристаллов в сравнении с двумя другими матрицами. Эта особенность играет важную роль при сохранении от спектра к спектру необходимой точности измерения масс, а также имеет решающее значение для успешного снятия масс-спектров в автоматическом режиме, с использованием алгоритма AutoExecute (Bruker Daltonics, Германия).
По разработанному протоколу накоплены масс-спектры лабораторного штамма Е. coli DH5a, причём в анализ включены образцы, полученные в разное время в процессе трёх независимых культивирований. Анализ показал хорошую воспроизводимость 22 пиков в спектре, из которых 16 удалось соотнести с бактериальными белками. Таким образом, качественный состав полученных нами белковых масс-спектров соотносился с аналогичными данными, полученными ранее для штамма Е. coli К-12 (также с использованием а-СНСА в качестве матрицы). В исследовании Ryzhov и Fenselau было показано преобладание рибосомальных белков в составе регистрируемого масс-спектра, что, вероятно, связано с их локализацией в цитозоле (в отличие, от мембранных белков), присутствием в клетке в достаточно большом количестве, относительно небольшой массой, а также основностью большей части из них, ионизации и десорбции которых способствуют условия кислой экстракции и масс-спектрометрического анализа в режиме положительных ионов [166]. Аналогичные результаты получены при прямом масс-спектрометрическом анализе белковых экстрактов лабораторного штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226, для которого также накоплена серия масс-спектров, проведен их качественный и количественный анализ. При рассмотрении набора регистрируемых значений m/z, проводили поиск в базе данных близких по значению масс известных белков гонококка, оценивали дисперсию значений m/z, относительных интенсивностей соответствующих пиков в спектре, и анализировали частоту регистрации каждого из пиков (табл. 4). Пороговое значение частоты регистрации пика (f 0,7) введено с целью ограничения области анализа некоторым набором стабильно регистрируемых пиков, который в данном случае составил 20 значений m/z, 12 из которых удалось соотнести с массами рибосомальных белков бактерии. С использованием разработанного протокола проведено белковое профилирование 278 клинических штаммов N. gonorrhoeae. Эта группа, входящая в состав общей выборки (464 штамма), включала штаммы, выделенные от пациентов из следующих региональных центров РФ: Архангельск, Екатеринбург, Иркутск, Калуга, Москва, Мурманск, Нижний Новгород, Псков, Рязань, С.-Петербург, Самара, Ставрополь, Чебоксары.
Сравнительный анализ полученных масс-спектров, позволил выделить три пика (со значениями m/z 4473, 5051 и 8165 для штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226), предположительно соответствующие рибосомальным белкам RL36, RL34 и RL31, для которых у ряда штаммов наблюдалось изменение положения в спектре в соответствие с изменением значений m/z (4487, 5081, 8146, соответственно). В общем случае, отклонение регистрируемого значения m/z белковой молекулы от теоретически рассчитанного значения массы или изменение m/z от образца к образцу может быть обусловлено во-первых, посттрансляционными модификациями [167], во-вторых, изменениями в самой аминокислотной последовательности первичной структуры белка. В результате определения полной нуклеотидной последовательности соответствующих генов N. gonorrhoeae (rpmJ, rpmH, гртЕ) в каждом из них был обнаружен единственный значимый нуклеотидный полиморфизм, приводящий к соответствующей аминокислотной замене. Теоретически рассчитанное изменение массы белка при данной замене совпало с изменением, регистрируемым в масс-спектрометрическом анализе. При анализе масс-спектров 278 клинических штаммов гонококка, выявлены четыре варианта комбинаций значений m/z, или четыре типа профилей белковых масс (протеотипа), один их которых доминирует по распространенности в исследованной группе (85%). Этот вариант белкового масс-профиля, которому условно присвоен номер "1", соответствует массам белков штамма N. gonorrhoeae FA 1090 с известной геномной последовательностью, этот профиль характеризует также лабораторный штамм N. gonorrhoeae АТСС 49226. Наблюдаемые незначительные отличия качественного состава масс-спектров в группе клинических штаммов гонококка согласуются с нашим представлением о ключевой роли рибосомальных белков в жизнедеятельности клетки, консервативности их аминокислотных последовательностей и соответствующих кодирующих участков генома. Напомним, что 12 из 20 устойчиво регистрируемых пиков были соотнесены с рибосомальными белками, другие 8 пиков также характеризовались постоянством значений m/z.
![Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4436/199888.png "Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс] Кобенко Эльвира Георгиевна")
