Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Общая характеристика Neisseria gonorrhoeae 10
1.2 Гонококковая инфекция . 14
1.2.1 Основные факторы патогенности и патогенез гонореи 14
1.2.2 Эпидемиология 19
1.2.3 Лечение. Проблема лекарственной устойчивости 20
1.3 Внутривидовая вариабельность N. gonorrhoeae и гетерогенность популяции 25
1.3.1 Морфологический полиморфизм гонококков 25
1.3.2 Физиологическая и серологическая гетерогенность гонококков 27
1.3.3 Фенотипическая гетерогенность гонококков. Лекарственная устойчивость 29
1.3.3.1 Формирование устойчивости к различным классам антимикробных препаратов 30
1.3.3.2 Методы оценки лекарственной устойчивости возбудителя. Анализ генетических маркеров 40
1.3.4 Современные подходы к оценке гетерогенности популяции N. gonorrhoeae 45
1.3.4.1 /?ог-типирование 46
1.3.4.2 Типирование мультилокусным секвенированием 48
1.3.4.3 Прямое белковое профилирование с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии 50
2 Материалы и методы 53
2.1 Бактериальные штаммы 53
2.2 Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae 54
2.2.1 Бактериальные клетки 54
2.2.2 Экстракция белков (грубый лизис бактериальных клеток) 54
2.2.3 Сокристализация матрицы и аналита 54
2.2.4 Масс-спектрометрический анализ 55
2.2.5 Интерпретация масс-спектров 56
2.3 Генетический анализ штаммов N. gonorrhoeae 57
2.3.1 Выделение тотальной ДНК N. gonorrhoeae 57
2.3.2 Амплификация фрагментов генома N. gonorrhoeae 57
2.3.3 Подготовка продуктов амплификации для дальнейшего анализа 61
2.3.4 Минисеквенирование и масс-спектрометрический анализ продуктов реакции 61
2.3.5 Секвенирование фрагментов генов рог, рагС, «домашнего хозяйства» 65
2.3.6 Анализ нуклеотидных последовательностей генов рог, рагС, «домашнего хозяйства» 66
2.4 Математический анализ данных 66
3 Результаты 68
3.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae 68
3.2 Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae 68
3.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae 78
3.4 Типировапие штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции 89
3.4.1 /?ог-типирование 89
3.4.2 Типирование мультилокусным секвенированием 94
4 Обсуждение 98
4.1 Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N.gonorrhoeae 98
4.2 Прямое белковое профилирование 98
4.3 Анализ генетических маркеров лекарственной устойчивости N. gonorrhoeae 103
4.4 Типирование штаммов N. gonorrhoeae и оценка гетерогенности популяции. 109
5 Заключение 116
6 Выводы 117
7 Список литературы 119
8 Приложение
- Гонококковая инфекция
- Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae
- Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae
- Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N.gonorrhoeae
Введение к работе
Гонорея - одна из наиболее распространенных на сегодняшний день инфекций, передающихся половым путём, остается актуальной проблемой в области практического здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость гонореей в мире составляет около 60 миллионов случаев в год [1]. В России этот показатель также остается на достаточно высоком уровне - около 100 случаев на 100 тысяч населения в год [2, 3]. По этой причине, как в Российской Федерации (РФ), так и во многих странах мира, гонорея включена в список инфекций, подлежащих обязательной статистической регистрации на национальном уровне (наряду с сифилисом, хламидийной инфекцией и др.) [4, 5].
Возбудитель гонореи - грамотрицательный диплококк Neisseria gonorrhoeae, способный колонизировать эпителий уретры, шейки матки, глотки, прямой кишки, конъюнктивы и некоторые другие эпителии с развитием инфекций нижних отделов мочеполового тракта, воспалительных заболеваний органов малого таза, конъюнктивита, проктита, фарингита, диссеминированной гонококковой инфекции. Особенностью современной гонореи является увеличение вялотекущих и асимптомных форм заболевания, хроническое течение, многоочаговость поражения верхнего и нижнего отделов мочеполового тракта. Отмечен высокий уровень постгонорейных осложнений, приводящих к женскому и мужскому бесплодию, случаев генерализации гонококковой инфекции с поражением суставов, клапанов сердца, аорты, кожи [6].
Объяснением указанных свойств гонококковой инфекции, очевидно, служит высокая изменчивость и пластичность возбудителя, способность к быстрому адаптивному изменению фенотипических и генетических характеристик. Так, предпосылки для хронизации и генерализации патологического процесса создает способность гонококка к L-трансформации и внутриклеточной инвазии. Генетические механизмы,
способствующие формированию гетерогенности популяции N. gonorrhoeae, включают внутри- и межвидовую ДНК-трансформацию, что примечательно, в любом периоде жизненного цикла, активную передачу информации с помощью плазмид, рекомбинацию. Гонококк характеризует высокое содержание в геноме супермутабельных и мозаичных генов, значительная вариабельность структуры пилей, белков наружной мембраны (Рог, Ора), и как следствие, культуральных и антигенных свойств гонококка (в частности, антигенная мимикрия), его вирулентных и персистентных характеристик. Благодаря высокой пластичности генома, под давлением воздействия антибактериальных средств N. gonorrhoeae реализует практически все известные механизмы лекарственной устойчивости.
Поэтому, с точки зрения современной клинической микробиологии, особенно актуальным становится разработка не только максимально точных, но и быстрых, сравнительно недорогих методик идентификации и характеристики N. gonorrhoeae по основным, клинико-эпидемиологическим параметрам (так называемых, методов «быстрой микробиологии»). Между тем, использование традиционных подходов к диагностике гонококковой инфекции сопряжено на практике с известными трудностями. Гонококки относятся к достаточно прихотливым бактериям, требуют сложных питательных сред для культивирования и высокой квалификации персонала лаборатории. Поэтому процедуры микробиологической идентификации гонококка, включающие высев на питательной среде отделяемого уретры или цервикального канала, выделение чистой культуры гонококка, поддержание жизнеспособности микроба для определения профиля чувствительности к антибиотикам, характеризуются сложностью стандартизации, трудоемкостью и длительностью анализа.
Тогда как современные достижения молекулярной биологии открывают возможности альтернативных подходов к идентификации и характеристике отдельных штаммов N. gonorrhoeae и популяции в целом. Вслед за
различными диагностическими тестами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (nucleic acid amplification tests, NAATs), для оценки лекарственной устойчивости возбудителя был предложен новый подход, представляющий собой определение генетических детерминант устойчивости. В его основе лежит амплификация мобильных детерминант устойчивости наравне с амплификацией генов, белковые продукты которых являются мишенями для действия антибиотиков, и определение в структуре детерминант точечных нуклеотидных полиморфизмов, являющихся маркерами формирования устойчивости, с помощью реакции минисеквенирования и анализом продуктов с использованием MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.
Этот же высокоточный и быстрый метод анализа молекулярных масс биополимеров (нуклеиновых кислот, белков, липидов) лежит в основе предложенного недавно подхода, предназначенного для быстрой идентификации и внутривидовой классификации микроорганизмов путём регистрации и сравнительного анализа белковых масс-спектров, специфичных для разных видов. Интересным представляется оценка возможности использования этого подхода для идентификации и, возможно, типирования гонококка, проявляющего, как указывалось выше, высокую пластичность и гетерогенность в популяции.
Действительно, давно описанный морфофизиологический полиморфизм, а затем и генетическая пластичность N. gonorrhoeae, являются центральными проблемами молекулярной эпидемиологии гонококка. Разрабатываются и совершенствуются различные методы штаммовой идентификации и типирования N. gonorrhoeae с целью прояснить некоторые общие аспекты структуры популяции гонококка, а также выявить локальные эпидемиологические особенности возбудителя, определить тенденции в динамике и распространении клинически значимых признаков в популяции.
Одним из перспективных признан подход, заключающийся в определении изменений последовательности рог гена гонококка (рог-типирование). Стоит отметить, что Рог белок, играющий важную роль в процессах адгезии к эпителиоцитам и инвазии внутрь клеток, характеризуется высокой изменчивостью, поэтому отдельные структурные вариации в соответствующих генетических локусах рог гена, могут иметь эволюционные преимущества, из чего следует подверженность их селекции. Эти свойства "объекта" типирования позволяют использовать данный подход для оценки быстрых адаптационных изменений гонококка, краткосрочных эволюционных тенденций развития популяции, а также для оценки её гетерогенности в небольших, относительно замкнутых группах пациентов.
Отличную идеологию содержит в себе, предложенный относительно недавно для типирования популяции N. gonorrhoeae, метод мультилокусного секвенирования (Multi Locus Sequence Typing, MLST, в основе которого лежит секвенирование строго определенного набора фрагментов «генов домашнего хозяйства», имеющих достаточное число аллельных вариантов, характеризующихся медленным накоплением мутаций и селективно нейтральных. Предполагаемая область его использования - это оценка макроэволюции популяции в целом и тенденций в динамике больших популяций, затрагивающих обширные территории.
Отдельно следует заметить, что в РФ отсутствует какая-либо развитая система типирования N. gonorrhoeae, информация о региональных особенностях лекарственной устойчивости крайне скудна, разрознена и зачастую неактуальна (ретроспективные исследования).
Таким образом, дальнейшая разработка и адаптация методов молекулярного типирования гонококка, а также комплексная характеристика популяции N.gonorrhoeae, распространенной на территории РФ, представляются актуальными задачами, решение которых подразумевает фундаментальные и медицинские аспекты исследования.
Целью настоящей работы являлалсь разработка и сравнение различных методов молекулярного типирования N. gonorrhoeae и использование их для характеристики популяции возбудителя, распространённой на территории Российской Федерации.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Формирование коллекции образцов ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от больных из различных регионов Российской Федерации.
Разработка системы комплексной оценки антибиотикоустойчивости N. gonorrhoeae на основе знаний о генетических механизмах формирования устойчивости возбудителя, включающей определение известных нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом.
Оптимизация методики прямого масс-спектрометрического белкового профилирования и оценка возможности типирования клинических штаммов N. gonorrhoeae с использованием данного подхода.
Реализация схемы por-типирования для характеристика коллекции российских клинических штаммов N. gonorrhoeae.
Анализ гетерогенности «генов домашнего хозяйства» N. gonorrhoeae и разработка схемы типирования мультилокусным секвенированием клинических штаммов гонококка.
Молекулярно-эпидемиологическая характеристика группы клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных на территории РФ, включающая 1) анализ распространенности и вклада различных механизмов в формирование лекарственной устойчивости N.gonorrhoea, 2) анализ структуры и оценка гетерогенности исследуемой популяции N.gonorrhoea.
Гонококковая инфекция
N. gonorrhoeae имеют множество факторов патогешюсти, хотя и не продуцируют каких-либо экзотоксинов. К основным факторам патогенности относят капсулу, пили, ЛОС, белки внешней мембраны, железо-связывающий белок, IgA-протеазу.
Как уже говорилось выше, бактерии свежевыделенных культур имеют капсулу, которая проявляет антифагоцитарные свойства (препятствует прямому контакту микробицидных субстанций с клеточной стенкой, маскирует ее антигенные детерминанты).
Важнейшим фактором адгезии служат многочисленные пили [9], обнаруживаемые только в колониях 1 и 2 типа по Келлогу. Показано, что гонококки, несущие пили более вирулентны, чем микроорганизмы лишенные пилей [19, 20]. В механизме прикрепления важное значение имеет гидрофобность поверхности: пили содержат до 25% гидрофобных аминокислот, благодаря которым осуществляется погружение гидрофобной части ворсинок в липиды клеточной мембраны хозяина. Генетически опосредованная вариабельность строения пилей обеспечивает антигенное разнообразие, прикрепление и выживаемость гонококков на клетках эпителия при смене хозяина или воздействии антител [21].
Липоолигосахарид - один из важнейших факторов вирулентности N. gonorrhoeae. Этот гликолипид внешней мембраны участвует в процессах уклонения от реакций иммунной системы (связывание сиаловой кислоты и формирование микрокапсулы), прикрепления к эпителиальным тканям [22], инвазии, обуславливает токсическое повреждение эпителия фаллопиевых труб [23], стимулирует выработку антител, проявляющих бактерицидные свойства [24, 25]. Типично высвобождение во время роста фрагментов внешней мембраны, которые содержат, в том числе, и ЛОС, являющийся эндотоксином, который стимулирует развитие интенсивного воспалительного процесса, обуславливает лихорадку и другие симптомы.
Белки наружной мембраны (или поверхностные белки) также проявляют сильные иммуногенные свойства. В присутствии комплемента антитела к белкам наружной мембраны проявляют бактерицидные свойства. Выделяют белки наружной мембраны I, II, и III классов [26].
Белки наружной мембраны I класса (ОМР I, P.I, porins) или Рог белки. Основной структурный белок наружной мембраны, он составляет 60% всех поверхностных белков [6]. Обеспечивает транспорт гидрофильных веществ (в том числе антибиотиков), может предотвращать формирование фаголизосом в нейтрофилах и/или снижать окислительный взрыв. Белки I и II класса усиливают адгезию патогена, его внутриклеточную инвазию, антифагоцитарную активность, устойчивость к бактерицидным факторам сыворотки. Белок I класса (Рог), являясь мишенью для бактерицидных антител, может избегать их действия благодаря выраженной эпитопной изменчивости. Различают два подкласса Рог белка (А и В), различающихся поверхностными концевыми структурами. Гонококки, экспрессирующие разные варианты этого белка, проявляют различные вирулентные свойства (см. раздел 1.3.2).
Белки наружной мембраны II класса (ОМР II, Р.П, Ора proteins) участвуют в процессах прикрепления к эпителию, инвазии [27], эндоцитоза в слизистые оболочки, взаимодействия с фагоцитами. Характерна вариабельность в экспрессии: различие в количестве белков у разных штаммов, вплоть до полного отсутствия. Отсутствие экспрессии Ора белков ассоциировано с устойчивостью к фагоцитозу полиморфноядерными лейкоцитами, а также характерно для штаммов, выделенных из фаллопиевых труб, крови, синовиальной жидкости. Такие штаммы считаются наиболее вирулентными и устойчивыми к бактерицидному действию сыворотки.
Кроме того, Ора белки характеризуются также высокой вариабельностью [28]. Показана антигенная вариабельность Ора белков внутри штамма in vivo, детерминированная кодированием их в нескольких генах (11 копий), размером около 800 п.н., а также интер- и интрагеномной рекомбинацией. Гипервариабельные районы белков Ора используют в типировании N. gonorrhoeae.
Прямое белковое профилирование штаммов N. gonorrhoeae
В качестве матричного соединения использовали а-циано-4-гидроксициннамовую (a-CHCA, a-cyano-4-hydroxy cinnamic acid), синапиновую (SA, sinapinic acid, 3,5-dimethoxi-4-hydroxy cinnamic acid) и феруловую (FA, ferulic acid) кислоты в виде насыщенных в AT растворов. Все использованные реактивы, включая воду, были аналитической чистоты или специальные для масс-спектрометрии. Оптимальными были выбраны следующие процедуры сокристализации матрицы и образца, имеющие отличия для разных матриц: а) для а-СНСА: 1 мкл белкового экстракта наносили на ячейки стального планшета для масс-спектрометрии (MSP 96 target ground steel, Bruker Daltonics, Германия), сушили на воздухе в течение 1 минуты и сверху наслаивали 2 мкл насыщенного раствора а-СНСА матрицы; б) для SA: 0,3 мкл насыщенного в этаноле раствора SA наносили на ячейки стального планшета для масс-спектрометрии, затем сверху наносили 1 мкл белкового экстракта, давали высохнуть и наслаивали 2 мкл насыщенного в AT раствора SA матрицы; в) для FA: 1 мкл белкового экстракта наносили на ячейки стального планшета, сушили на воздухе и сверху наслаивали 2 мкл насыщенного раствора FA матрицы. Оставляли кристаллы в течение 5 мин на воздухе до полного высыхания.
Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием MALDI времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного азотным лазером ( =337 нм), использованная частота импульсов которого составляла 10 Гц. Все измерения проводили в линейной режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением - 20.0 кВ. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z от 2000 до 20000, используя напряжение на накапливающем электроде - 18.6 кВ, и время задержки экстракции - 350 нсек. Для получения каждого масс-спектра использовали 50 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Внешнюю калибровку в каждом эксперименте проводили с использованием точных значений масс известных белков Escherichia coli. Образец наносили на три ячейки планшета, для каждой из которых записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 одиночных спектров (500 импульсов лазера). Снятие спектров проводили как в ручном, так и в автоматическом режиме (AutoExecute, Bruker Daltonics). Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия): flexControl 2.4 (Build 38), flexAnalysis 2.4 (Build 11) согласно инструкциям фирмы-производителя. В частности, формирование пик-листа для всех масс-спектров проводили в автоматическом режиме с помощью программы flexAnalysis 2.4 (Build 11), используя единые стандартные условия отбора пиков. Были выбраны следующие значения соответствующих параметров: 1) центроидный алгоритм поиска пиков (80% высоты пика), 2) отношение сигнал/шум - 15, 3) пороговое значение относительной интенсивности - 10%, 4) максимальное число пиков - 100, 5) максимальная ширина пика - 2 m/z.
При интерпретации масс-спектров исходили из предположения, что большая часть регистрируемых пиков соответствует белковым молекулам, а определяемые массы - массам целых (не фрагментированных) белков. Идентификацию белков проводили путем поиска совпадения значений экспериментальных масс с массами белков, аннотированных в соответствующих базах данных (SwissProt/TrEMBL) с использованием ресурсов ExPASy-сервера (http://ca.expasy.org/srs5/). При вводе значения для параметра «MolWeight» использовали усреднённое экспериментальное значение m/z с учётом инструментальной погрешности измерения, которая составляла 3 Да. Кроме того, проводили повторный поиск, используя значение массы, соответствующие утрате N-концевого метионина, учитывая, таким образом, возможность посттрансляционной модификации белка. В случае с N. gonorrhoeae, для которой круг описанных белков относительно мал, проводили аналогичный поиск среди представленных в базе данных белков более охарактеризованного близкородственного вида - Neisseria meningitidis.
Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N. gonorrhoeae
В исследование включена группа из 464 клинических штаммов N.gonorrhoeae, выделенных от пациентов из 14 региональных центров РФ. Для всех исследованных штаммов в бактериологической лаборатории ФГУ ЦНИКВИ Росздрава были определены МПК к 5 антибиотикам, относящимся к разным классам (пенициллин, тетрациклин, ципрофлоксацин, спектиномицин, цефотаксим).
Нами проведено выделение ДНК клинических штаммов, сформирован лабораторный банк ДНК.
Количество штаммов, проанализированных несколькими использованными в данной работе молекулярными методами было неодинаковым: анализ генетических маркеров резистентности проведен для всех 464 клинических штаммов; в исследовании возможностей прямого белкового профилирования с помощью MALDIOF масс-спектрометрии было использовано 278 штаммов; сравнение методов /w-типирования и MLST было проведено с использованием группы, состоящей из 84 штаммов.
Цельные бактериальные клетки культуры N. gonorrhoeae подвергали прямому белковому анализу с использованием MALDIOF масс-спектрометрии. Для этого на первом этапе с использованием лабораторного штамма Е. coli DH5a отработали методики получения белкового экстракта и масс-спектрометрического анализа, с целью получения воспроизводимых и максимально насыщенных масс-спектров. При выборе оптимального протокола лизат клеток Е. coli DH5a в растворе AT анализировали с помощью MALDIOF MS с использованием 3-х вариантов матричных растворов, основы которых составляли а-СНСА, SA, FA (см. в разделе «Методы исследования»). Для дальнейшей работы в качестве матрицы была выбрана а-СНСА, показавшая наилучшие результаты по таким критериям, как отношение сигнал/шум, разрешение получаемых спектров и гомогенность кристаллов (рис.3).
Согласно разработанному протоколу для лабораторного штамма Е. coli DH5a была получена серия масс-спектров, записанных в диапазоне m/z 2000 - 20000. Первичный анализ полученных спектров показал, что значимые сигналы регистрируются в диапазоне m/z 2000 - 12000, однако большинство пиков, лежащих в интервале m/z 2000 - 4000, соответствуют двухзарядным ионам (рис.4, а). Поэтому область анализа была ограничена диапазоном m/z 4000 - 12000, в рамках которого для каждого масс-спектра был получен пик-лист (набор значений m/z и относительных интенсивностей пиков), в соответствии с критериями, описанными в разделе «Материалы и методы» (рис.4, б).
В таблице 6 представлены результаты анализа пик-листов 10 масс-спектров белкового экстракта клеток лабораторного штамма Е. coli DH5a, полученных в результате трёх различных культивирований. Указаны усреднённые значения всех зарегистрированных для 10 масс-спектров значений m/z и относительных интенсивностей пиков, стандартные отклонения этих величин, частоты регистрации для каждого пика. Максимальное среднеквадратичное отклонение составило для m/z - 2,6 Да, для относительной интенсивности - 0,29. Из общего набора регистрируемых пиков выделены 22, для которых частота регистрации f была равной или больше 0,7. Поиск в базе данных SwissProt/TrEMBL позволил соотнести 16 из 22 соответствующих значений m/z с молекулярными массами бактериальных белков, причём в некоторых случаях было найдено несколько близких по значению масс. Большинство кандидатов, с которыми предположительно соотнесены сигналы спектра, представляли собой белки рибосом бактерии. Это позволило установить точные значения m/z для этих пиков в спектре штамма Е. coli DH5a, который дополнительно анализировали в каждом из последующих экспериментов с N. gonorrhoeae и использовали при внешней калибровке.
Коллекция образцов ДНК клинических штаммов N.gonorrhoeae
Наряду с анализом генетической гетерогенности для типирования N. gonorrhoeae использован новый развивающийся подход, обозначенный нами как прямое белковое профилирование с использованием MALDIOF масс-спектрометрического анализа. Терминология в этой области ещё не устоялась, и в англоязычной литературе этот подход имеет разные названия: "Intact-cell mass-spectrometry", "Whole-cell mass-spectrometry" и др. [152, 156, 166, 167]. Все эти формулировки стараются подчеркнуть стремление к прямому использованию масс-спектрометрии для анализа целой клетки, т.е. без сложных процедур фракционирования, выделения и очистки отдельных клеточных компонентов. Напомним, что суть метода заключается в получении масс-спектра сложной смеси биомолекул (в частности, белков), характеризующего микроорганизм как вид или какое-либо его метаболическое состояние. Применение MALDIOF масс-спектрометрического анализа для характеристики микробной клетки уже анонсировано, например, для идентификации микобактерий [154], представителей семейства Enterobacteriaceae [151], типирования штаммов бетагемолитических стрептококков [155]. В ряде работ предлагается использовать различные матричные растворы и методики подготовки образца бактериальной культуры для масс-спектрометрического анализа [152, 154, 165], в которых демонстрируются результаты разной степени качества и информативности. Поэтому для исследования возможностей прямого белкового профилирования N. gonorrhoeae с помощью MALDIOF масс-спектрометрического анализа на первом этапе была отработана методика пробоподготовки с использованием лабораторного штамма Е. coli DH5a. В ходе тестирования трех матричных растворов показано, что использование в качестве матрицы сс-СНСА позволяет получить максимально гомогенную структуру и форму кристаллов в сравнении с двумя другими матрицами. Эта особенность играет важную роль при сохранении от спектра к спектру необходимой точности измерения масс, а также имеет решающее значение для успешного снятия масс-спектров в автоматическом режиме, с использованием алгоритма AutoExecute (Bruker Daltonics, Германия). По разработанному протоколу накоплены масс-спектры лабораторного штамма Е. coli DH5a, причём в анализ включены образцы, полученные в разное время в процессе трёх независимых культивирований. Анализ показал хорошую воспроизводимость 22 пиков в спектре, из которых 16 удалось соотнести с бактериальными белками. Таким образом, качественный состав полученных нами белковых масс-спектров соотносился с аналогичными данными, полученными ранее для штамма Е. coli К-12 (также с использованием а-СНСА в качестве матрицы). В исследовании Ryzhov и Fenselau было показано преобладание рибосомальных белков в составе регистрируемого масс-спектра, что, вероятно, связано с их локализацией в цитозоле (в отличие, от мембранных белков), присутствием в клетке в достаточно большом количестве, относительно небольшой массой, а также основностью большей части из них, ионизации и десорбции которых способствуют условия кислой экстракции и масс-спектрометрического анализа в режиме положительных ионов [166].
Аналогичные результаты получены при прямом масс-спектрометрическом анализе белковых экстрактов лабораторного штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226, для которого также накоплена серия масс-спектров, проведен их качественный и количественный анализ. При рассмотрении набора регистрируемых значений m/z, проводили поиск в базе данных близких по значению масс известных белков гонококка, оценивали дисперсию значений m/z, относительных интенсивностей соответствующих пиков в спектре, и анализировали частоту регистрации каждого из пиков (табл. 4).
Пороговое значение частоты регистрации пика (f 0,7) введено с целью ограничения области анализа некоторым набором стабильно регистрируемых пиков, который в данном случае составил 20 значений m/z, 12 из которых удалось соотнести с массами рибосомальных белков бактерии.
![Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4436/199888.png "Оптимизация лабораторной диагностики гонореи и антибиотикочувствительность Neisseria gonorrhoeae по материалам г. Екатеринбурга и Свердловской обл. [Электронный ресурс] Кобенко Эльвира Георгиевна")
