Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Введение 10
2.1.1. Метаболизм фенилаланина в норме 10
2.1.2. Нарушение метаболизма фенилаланина как причина фенилкетонурии 12
2.1.3. Материнская фенилкетонурии 15
2.1.4. Современная классификация форм фенилкетонурии 15
2.2. Распространенность фенилкетонурии 17
2.3. Структура фенилаланингидроксилазы 20
2.4. Структура гена ФАГ 22
2.5. Мутации гена ФАГ 23
2.6. Влияние мутаций гена фенилаланингидроксилазы на проявления фенилкетонурии 25
2. б. 1. Моделирование влияния мутаций гена ФАГ на структуру фенилаланингидроксилазы 26
2.6.2. Экспрессия in vitro как метод исследования эффекта мутаций на активность ФАГ. 30
2.6.3. Модель общего механизма влияния мутаций гена ФАГ. 34
2.7. Нейтральные полиморфизмы и гаплотипы гена ФАГ, популяционная генетика фенилкетонурии 36
2.7.1. Исследование полиморфизма сайтов рестрикции гена ФАГ 37
2.7.2. Исследование полиморфизма STR и VNTR повторов гена ФАГ 38
2.7.3. Исследование происхождениямутантных аллелей 41
2.8. Перспективные подходы к терапии фенилкетонурии 43
2.8.1. Диетотерапия 43
2.8.2. Генотерапия фенилкетонурии 44
2.8.3. Медикаментозная терапия фенилкетонурии 46
3. Материалы и методы 49
3.1. Материалы 49
3.2. Методы 51
3.2.1. Обследованная группа. 51
3.2.2. Консервирование крови 52
3.2.3. Выделение геномной ДНК из крови по Muller 53
3.2.4. Полимеразная цепная реакция 54
3.2.4.а) ПЦР районов гена ФАГ. 54
3.2.4.6) РеПЦР STR и VNTR гена ФАГ 55
3.2.5. Электрофорез в агарозном геле 55
3.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле 56
3.2.7. Очистка продуктов ПЦР 57
3.2.7.а) Очистка продуктов ПЦР сорбцией на стекловолокне 57
3.2.7.6) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках Centrisep Spin Columns 58
3.2.7.в) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G-5058
3.2.7.г) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G-100 59
3.2.8. Реакция Сэнгера 59
3.2.9. Очистка продуктов реакции Сэнгера 60
3.2.10. Фрагментный анализ продуктов ПЦР на автоматических генных анализаторах 60
3.2.10. а) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных нуклеозидтрифосфатов 60
3.2.10.6) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных праймеров 61
3.2.10.в) Спектральная калибровка генных анализаторов для выполнения фрагментного анализа 62
3.2.10. г) Определение поправки между реальными и наблюдаемыми при фрагментном анализе размерами 63
3.2.11. Компьютерная обработка данных 65
3.2.11.а) Анализ электрофореграмм 65
3.2.11.6) Анализ секвенограмм автоматических генных анализаторов 65
3.2.11.в) Анализ электрофореграмм при фрагментном анализе 65
4. Результаты и обсуждение 66
4.1. Полиморфизм гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией
Западной Сибири Алтайского края и Саратовской области 66
4.1.1. Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае 66
4.1.2. Минигаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с мутациями, обуславливающими ФКУ в Западной Сибири и Саратовской области 77
4.2. Рекуррентное возникновение мутации гена фенилаланингидроксилазы Y168H 85
4.3. Пренатальная диагностика фенилкетонурии в семьях больных фенилкетонурией 94
4.4. Универсальный метода идентификации однонуклеотидных замен 99
Выводы 107
Список цитированной литературы:
- Нарушение метаболизма фенилаланина как причина фенилкетонурии
- Нейтральные полиморфизмы и гаплотипы гена ФАГ, популяционная генетика фенилкетонурии
- Выделение геномной ДНК из крови по Muller
- Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае
Введение к работе
Фенилкетонурия (ФКУ) является одним из распространенных наследственных заболеваний человека. Большое клиническое и биохимическое разнообразие форм этой болезни обусловлено большим разнообразием обуславливающих его мутаций (известно более 500 мутаций гена ФАГ, приводящих к ФКУ). Помимо тяжести заболевания в каждом случае генотип больного ФКУ определяет эффективность традиционной диетотерапии и возможность использования альтернативных способов терапии ФКУ (например, фенилаланинаммиаклиазой).
Спектры мутаций и нейтральных полиморфизмов гена ФАГ значительно различаются в разных популяциях и географических регионах мира. Это, по всей видимости, является отражением особенностей формирования этих популяций и различного влияния факторов естественного отбора на больных ФКУ, имеющих разный жизненный уклад, традиции питания и т.п. Для того чтобы более точно определить происхождение и клинические последствия той или иной мутации, необходимо как можно более полно охарактеризовать носителей этой мутации в каждой популяции. Дополнение таких исследований идентификацией гаплотипов гена ФАГ позволяет делать выводы о генетической структуре популяции, выявлять потоки генов, её формирующих, а также оценивать степень вероятности возникновения той или иной мутации de novo.
Успешность всех подходов к лечению фенилкетонурии полностью определяется своевременностью её диагностики и возможностью получить сведения о типе мутаций, обуславливающих каждый конкретный случай заболевания. Чем раньше происходит диагностика болезни, тем лучше прогноз её терапии. Оптимальной является пренатальная диагностика фенилкетонурии, поскольку она делает возможной не только максимально эффективную терапию, но и принятие решения о целесообразности сохранения беременности.
В. то же время многообразие обуславливающих фенилкетонурию мутаций делает её своевременную диагностику трудновыполнимой и дорогостоящей, поскольку требует привлечения, методов1 массового типирования точковых мутаций, либо секвенирования гена фенил ал анингидроксилазы у каждого пациента. Таким образом, существует насущная- потребность, в недорогих, быстрых и достоверных методах идентификации обуславливающих фенилкетонурию мутаций, применимых в условиях клинических лабораторий, в. том числе для пренатальной диагностики.
Целью настоящей настоящей работы являлось исследование спектра мутаций, гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае, а также исследование ассоциации этих мутаций с гаплотипами гена ФАГ, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и- возможности возникновения- идентифицированных мутаций в исследованных регионах России de novo. В цели настоящей-работы также входила разработка простых и достоверных методов1 идентификации обуславливающих ФКУ мутаций, в т.ч. пренатально.
Задачами работы являлись:
- Идентификация мутаций гена ФАГ у больных ФКУ и их родственников из указанных регионов России
гипотезонезависимыми методами, позволяющими детектировать все, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.
• Разработка на основе фрагментного анализа продуктов ПЦР автоматизированного массового метода идентификации аллельных вариантов STR HATNTR повторов гена ФАГ.
• Исследование сцепления идентифицированных мутаций с гаплотипами гена ФАГ, что при сравнении с аналогичными данными для других стран и регионов позволило судить о механизмах формирования наблюдаемого спектра мутаций.
• Разработка простого и достоверного метода пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем контаминации плодного биоматериала.
• Разработка простого универсального метода детекции точечных мутаций на основе аллель-специфичной ПНР.
Научная новизна работы:
Исследован спектр мутаций гена фенилаланингидроксилазы (ФАГ) обуславливающих ФКУ в, Саратовской области, Алтайском крае и ряде регионов Западной Сибири (Новосибирская, Кемеровская области). Впервые для регионов России идентификация обуславливающих ФКУ мутаций производилась гипотезонезависимым методом - определением нуклеотидных последовательностей районов гена ФАГ, позволило1 детектировать любые, в т.ч. ранее неизвестные, мутации.
Впервые проведено систематическое исследование сцепления всего спектра мутаций гена ФАГ в указанных регионах России с гаплотипами этого гена, что позволило судить о популяционных событиях, формирующих этот спектр и возможности возникновения идентифицированных мутаций в исследованных регионах России de novo.
Доказано независимое повторное возникновение обуславливающей ФКУ редкой мутации Y168H гена ФАГ, что было неизвестно ранее.
Впервые показана возможность использования конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПНР для обеспечения дискриминации аллельных вариантов по наблюдаемой задержке при гель-электрофорезе продуктов ПЦР.
Практическая значимость работы. Идентифицированы генотипы больных ФКУ по локусу ФАГ в 73 семьях Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областей и Алтайского края. Полученные результаты предоставлены врачам местных медико-генетических консультаций и перинатальных центров для контроля правильности выбранной стратегии терапии этих случаев ФКУ.
Разработаны методические рекомендации для выполнения фрагментного анализа на автоматических генных анализаторах с использованием реактивов отечественного производства, что сделало возможным внедрение этого метода на базе Центра коллективного пользования СО РАН «Секвенирование ДНК».
Разработан скрининговый метод идентификации точковых мутаций, основанный на использовании конъюгатов олигонуклеотидов с монометиловым эфиром полиэтиленгликоля в аллель-специфичной ПЦР.
Разработан и апробирован экспресс-метод пренатальной диагностики фенилкетонурии с контролем отсутствия контаминации плодного биоматериала тканями матери на основе гено- и гаплотипирования родителей и биоптата плодной части плаценты с помощью секвенирования и фрагментного анализа.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «3-я Международная конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007 г.), «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006 г.), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005 г.), International Conference "New information technology in medicine, biology, pharmacology and ecology" (Ялта-Гурзуф, 2003 г.),
Нарушение метаболизма фенилаланина как причина фенилкетонурии
Феллинг описал фенилкетонурию с точки зрения врача, высказав только самые общие предположения об этиологии заболевания. Он же впервые констатировал, что фенилкетонурия наследуется как аутосомно-рецессивный признак.
Роль: нарушения метаболизма фенилаланина в развитии фенилкетонурии была доказана в ходе экспериментов Джервиса (Jervis, 1947), который продемонстрировал, что введение избытка фенилаланина больным ФКУ не приводит к повышению уровня тирозина в крови, как это происходит у здоровых людей. Он же продемонстрировал, что ткани печени больных ФКУ, в отличие от тканей здоровых людей, не обладают способностью переводить фенилаланин в тирозин (Jervis, 1953). Эта серия экспериментов впервые доказала, что фенилкетонурия является следствием недостатка активности соответствующего фермента печени. Сам термин «фенилкетонурия» был предложен ранее (Penrose, Quastel, 1937). Таким образом, было показано, причиной болезни является нарушение нормального метаболизма фенилаланина вследствие снижения или полного отсутствия активности фермента фенилаланингидроксилазы (ФАГ).
Нарушение нормального метаболизма фенилаланина приводит к активации альтернативных путей его метаболизма (см. рисунок 2). Ключевую роль в этом процессе играет окислительное дезаминирование фенилаланина. В результате в крови больного ФКУ повышается концентрация фенилаланина (более 1200 мкМ/л при норме 100 мкМ/л) (Scriver and Kaufman, 2001; Donlon et al, 2004) и происходит накопление продуктов, токсичных для ЦНС (фенилпировиноградная, фенилмолочная, фенилуксусная кислоты, фенилэтиламин, фенилацетилглютамин и др.) (Kayaalp et al, 1997; Guldberg et al, 1998).
Высокая концентрация фенилпировиноградной кислоты приводит к нарушению формирования миелиновой оболочки вокруг аксонов в ЦНС. Прямое токсическое действие на центральную нервную систему фенилаланина и его производных, а также вызванные повышенной концентрацией фенилаланина нарушения обмена нейромедиаторов (катехоламинов и серотонина) приводят к повышению возбудимости и повышенному тонусу мышц, развиваются гиперрефлексия, тремор, судорожные эпилептиморфные припадки, а также параплегия или гемиплегия (Villasana et al, 1989). С возрастом проявляются нарушения высшей нервной деятельности, умственная отсталость, микроцефалия. У \ больных также наблюдается слабая пигментация из-за нарушения синтеза меланина (Pietz et al 1998;Williams, 1998). Следует отметить, что в отличие от катализируемого фенилаланингидроксилазой гидроксилирования фенилаланина, происходящего преимущественно в печени и почках, дезаминирование фенилаланина по приведённой схеме не демонстрирует явной тканеспецифичности.
Транспорт фенилаланина через трансплацентарный барьер осуществляется посредством общего для нескольких аминокислот переносчика и является активным. Поэтому в случае беременности больной ФКУ матери даже здоровый плод может подвергаться воздействию повышенных концентраций фенилаланина, причем даже больших, чем в крови матери, и побочных продуктов его метаболизма. При этом из-за конкуренции за общий переносчик может происходить недостаточный транспорт ряда других аминокислот (тирозина, триптофана и др.) через трансплацентарный барьер. Этот феномен получил название «материнская фенилкетонурия».
Понятие «фенилкетонурия» охватывает широкий спектр клинических и биохимических характеристик. Это понятие включает все состояния, развивающиеся в результате отсутствия или снижения активности фенил аланингидроксилазы.
Традиционно тяжесть заболевания принято оценивать в зависимости от содержания фенилаланина в крови больного. В норме оно составляет до 100 мкМ. Так классическая или тяжёлая форма фенилкетонурии характеризуется содержанием более 1200 мкМ фенилаланина в крови, мягкая - 800-1200 мкМ. При содержании фенилаланина менее 800 мкМ заболевание, как правило, обозначается термином «гиперфенилаланинемия».
Следует, однако, отметить несовершенство и некоторую архаичность подобной классификации форм болезни. Прежде всего, приведённые концентрации относятся к состоянию больного ФКУ до начала любых терапевтических воздействий. После начала терапии концентрация фенилаланина в крови больного является уже отражением эффективности лечения, а не изначальной степени нарушения нормального метаболизма фенилаланина. Кроме того, в последнее время, с развитием генодиагностики фенилкетонурии, термин «гиперфенилаланинемия» начал утрачивать своё первоначальное значение и стал использоваться для описания ситуаций, когда при наблюдаемом повышенном содержании фенилаланина не удаётся выявить мутаций в генах ферментов, участвующих в метаболизме фенилаланина. Тяжесть же клинических проявлений, в частности слабоумия, в первую очередь зависит от адекватности и своевременности начала лечения, а не концентрации фенилаланина как таковой. Для достижения наилучших результатов лечение должно начинаться в максимально раннем возрасте. В этом случае, постановка диагноза на основании содержания фенилаланина в крови больного носит исключительно верификационный характер "postfactum".
Большое значение имеет этиологическая, т.е. основанная на непосредственной причине заболевания, классификация форм фенилкетонурии. Так, фенилкетонурия I типа - это фенилкетонурия, обусловленная значительным снижением активности фенилаланингидроксилазы в результате мутаций гена фенилаланингидроксилазы. Фенилкетонурия II типа (ФКУ II) - это фенилкетонурия, обусловленная отсутствием или снижения активности ферментов, участвующих в регенерации кофермента ФАГ тетрагидробиоптерина (ВН4). В частности, ФКУ II может быть вызвана снижением активности дигидробиоптеринредуктазы или 6 пирувоилтетрагидроптеринсинтазы в результате мутаций соответствующих генов (Krause et ah, 1985; Krause et al, 1986; Scriver and Kaufman, 2001).
Нейтральные полиморфизмы и гаплотипы гена ФАГ, популяционная генетика фенилкетонурии
Помимо мутаций, ассоциированных с фенилкетонурией, в гене фенилаланингидроксилазы было идентифицировано значительное количество нейтральных полиморфизмов: замены, приводящие к появлению или исчезновению сайта специфичной эндонуклеазы рестрикции (Woo е/ al, 1983, Lidsky et al, 1985); биаллельные однонуклеотидные молчащие замены, не приводящие к появлению или исчезновению сайта специфичной-эндонуклеазы рестрикции Q232Q (Forrest et al, 1991), V245V (Dworniczak et al, 1990) и др.; полиаллельные полиморфизмы, обусловленные наличием в нуклеотидной последовательности гена коротких (STR) (Goltsov et al, 1993) и длинных (VNTR) (Goltsov et al, 1992) тандемных повторов.
Поскольку в пределах гена не было обнаружено горячих точек рекомбинации, стало возможным использовать различные комбинации полиморфных сайтов для- идентификации гаплотипов локуса фенилаланингидроксилазы.
Анализом локуса ФАГ по Саузерну были выявлены несколько полиморфных сайтов, которые могут узнаваться и расщепляться ферментами рестрикции (Woo et al, 1983). Полиморфизм наблюдался среди как нормальных, так и мутантных аллелей гена ФАГ. Было предложено использовать 8 сайтов рестрикции (7 ферментов: BgUI; PvuII; EcoRI; Mspl; Xmnl; и EcoRV), из них 7 существуют в двух аллельных вариантах и 1 в трех (Woo et al, 1983). Семь гаплотипов из 384 возможных теоретически и 88 наблюдаемых на практике у жителей ряда европейских стран охватывали более 98% всех хромосом с мутациями в структуре гена ФАГ (Eisensmith et al, 1992b). Гаплотипы 1, 4, 7 более распространены среди хромосом, не имеющих мутаций гена ФАГ, в европейских, азиатских, полинезийских популяциях, что привело к предположению об образовании этих трех гаплотипов до расовой дивергенции (Hertzberg et al, 1989). Гаплотипы 2 и З распространены среди хромосом, несущих мутации ФАГ, в Северной (Chakraborty et al, 1987, Apold et al, 1990, Svensson et al, 1991) и Центральной Европе (Aulehla-Scholz et al, 1988, Zygylska et al, 1991, Herrmann et al, 1988, Lichter-Konecki et al, 1988b, Reiss, et al 1988) и редки среди хромосом здоровых людей.
В популяциях Восточной Европы наиболее распространенным является гаплотип 2 среди хромосом с ФКУ аллелями (Daiger et al, 1989, Zygylska et al, 1991), в популяциях Южной Европы наиболее распространен гаплотип 6 (Kalaydjieva et al, 1990, Dianzani et al, 1990, Lichter-Konecki et al, 1989, Stuhrmann et al, 1989). Гаплотипы 5 и 7 наиболее распространены среди хромосом с ФКУ аллелями в некоторых европейских странах, в частности в Германии. Гаплотипы 1 и 4 распространены как среди хромосом, несущих ФКУ аллели, так и среди хромосом с нормальными аллелями гена (Eisensmith etal, 1992а).
В отличие от гетерогенности, наблюдаемой в европейских популяциях, в азиатских популяциях почти все хромосомы, и с нормальными аллелями (Daiger et al, 1989, Hertzberg et al, 1989) и с ФКУ аллелями (Daiger et al, 1989), являются вариантом гаплотипа 4.
Изучение полиморфизма ПДРФ-гаплотипов среди европейских и азиатских семей-носителей ФКУ показало, что средний уровень гетерозиготности по 1 или более из 8 ПДРФ - гаплотипов составляет около 86% для европейских популяций, но около 36% для азиатских семей (Daiger et al, 1989). Т.о. такой анализ информативен для гаплотипирования мутаций ФАГ в европейских семьях, но для азиатских популяций информативность такого анализа невелика.
В силу описанных ограничений применения ПДРФ-гаплотипов гена ФАГ рдя. исследования многих популяций возникла потребность в разработке альтернативной схемы гаплотипирования этого локуса.
Ранее методом гибридизации по Саузерну клонов гена ФАГ с олигонуклеотидными зондами в интроне 3 гена в 700 п.н. от границы с экзоном 3 был выявлен участок, содержащий ТСТА повторы (приложение 1) (DiLella etal., 1986, Goltsov etf а/, 1992). :
Анализ STR 80 европейских и 15 азиатских семей (Goltsov et al, 1993) показал существование нескольких: вариантов этого района гена, различающихся по длине от 228 до 260 п.н. Было также показана незначительная ассоциация некоторых аллелей STR с преимущественно нормальными (STR244) и мутантными (STR248) аллелями гена ФАГ. Первоначально этот факт пытались использовать для генодиагностики фенилкетонурии. Но с развитием представления о количестве и типе обуславливающих ФКУ мутаций гена ФАГ, их связи с тяжестью и прогнозом заболевания, а также с развитием методов идентификации конкретных мутаций этот подход был вытеснен из практики генодиагностики и сохранил значение лишь как метод популяционной генетики фенилкетонурии.
Менделевское расщепление STR свидетельствует об их стабильности в масштабах времени формирования человеческих популяций. Однако дополнительной мерой стабильности может служить уровень сцепления STR и семи диаллельных ПДРФ маркеров и 1 мультиаллельного VNTR (тандемные повторы средней длины), которые расположены в этом регионе (приложение 1). Анализ ассоциации STR с ПДРФ гаплотипами и VNTR европейских семей больных ФКУ по частотно-независимому методу показал сцепление STR с системами ПДРФ и VNTR в нормальных хромосомах, в мутантных же хромосомах было выявлено сцепление с частью ПДРФ-систем. Аналогичные результаты были получены для VNTR.
Выделение геномной ДНК из крови по Muller
Для проведения полимеразной цепной реакции (ГЩР) использовали амплификатор GeneAmp PCR System 9700 {Applied BioSystems, USA). Реакцию проводили в тонкостенных пробирках объёмом 0,2 мл. 3.2А.а) ПЦР районов гена ФАГ
Размер ПЦР-фрагментов, включающих экзоны и прилегающие участки интронов гена ФАГ, составлял 200-700 п.н. ПЦР проводили в реакционной смеси (40 мкл), содержащей следующие компоненты: 0,1 мМ дезоксинуклеотидтрифосфаты, 0,1 мкМ праймеры (см. таб.6), буфер (65 мМ Трис-HCl, рН=8,9; 16 мМ (NH4)2S04, 1,5 мМ MgCl2; 0,05% Tween-20; ЮмМ 2-меркаптоэтанол) и 50 ед.ак./мл Taq I ДНК-полимеразы (ИХБФМ СО РАН). Геномную ДНК добавляли в количестве 50-100 нг на одну реакцию.
В некоторых случаях ПНР производили с использованием набора AmpliTaq Gold {Applied BioSystems, USA) на 40 мкл реакционной смеси брали 4 мкл буфера для ПНР (lot no. D11551, Applied Biosystems), 0,1 мМ дНТФ, по 0.1 мкМ праймеров, 1,5 мМ MgCl2 (lot no. D12098, Applied Biosystems) и 30 u.e./мл полимеразы AmpliTaq Gold (lot no. D12108, Applied Biosystems). Геномную ДНК добавляли в количестве 50-100 нг.
Использовали следующие условия ПЦР: 94С 2 мин; 94С 30 сек., 59С 12 сек., 72С 1мин. 40 циклов, 72С 4 мин, 4С. При использовании набора AmpliTaq Gold, так как эта полимераза активируется при повышении температуры, по графику активации было рассчитано время активации для этого фермента, и использовался температурный профиль: 92С 2 мин; 92С 20 сек., 59С 12 сек., 72С 1мин. 40 циклов, 72С 4 мин, 4С.
Для определения нуклеотидной последовательности индивидуальных аллельных вариантов STR и VNTR повторов гена ФАГ производили РеПЦР этих фрагментов. В качестве матрицы для РеПЦР использовали ампликоны, выделенные из индивидуальных полос при электрофорезе в полиакриламидном геле. Выделенные фрагменты геля помещали в 1,5 мл пробирку с 1 мл бидистиллированной воды, замораживали при -20С и оттаиванию. Для РеПЦР использовали 2 мкл полученного раствора.
ПЦР проводили в реакционной смеси (40 мкл), содержащей следующие компоненты: 0,1 мМ дезоксинуклеотидтрифосфаты, 0,1 мкМ праймеры, однократный ПЦР буфер (65 мМ Трис-HCl, рН=8,9; 16 мМ (NH SO 1,5 мкМ MgC12; 0,05% Tween-20; ЮмМ 2-меркаптоэтанол) и 50 ед.ак./мл Taq I ДНК-полимеразы (ИХБФМ СО РАН). Используемые праймеры: для амплификации STR - 5 -GCCAGAACAACTACTGGTTCTGTG-3 и 5 CACAGTAATCATAAGTGTTCCCAGAC-3 , для амплификации VNTR - 5 GAGTAGATTTTAATGTTCTCACCCGCC-3 и 5 GAATCCCATCTCTCAGAGAAGCACATC-3 (оба производства ИХБФМ). Профиль ПЦР: 94С 2 мин; 94С 30 сек., 59С 12 сек., 72С 1мин. 30 циклов, 72С 4 мин, 4С.
Электрофорез проводили в ТАЕ-буфере (40 шМ Трис-HCl, рН 8.0; 1мМ ЭДТА; 20мМ СН3СООН), использовали 0.7% агарозный гель для анализа количества геномной ДНК и 1.5% агарозный гель для анализа ампликонов (0.63 г и 0.75 г агарозы на 50 мл буфера, соответственно), с добавлением бромистого этидия. из расчета 5 мкг/мл геля. Пробы, взятые в количестве 1 мкл для геномной ДНК и 4 мкл для продуктов ПЦР, смешивали с равным количеством буфера 2х Agarose Loading Buffer (Applied Biosystems, USA) и наносили в карманы геля. В качестве маркера использовали гидролизат плазмиды pUC эндонуклеазой Mspl для продуктов ПЦР и ДНК фага X для геномной ДНК. Использовали камера для электрофореза длиной 20 см, напряжение из расчета 5 В/см подавали в течение 40 мин, после чего гель помещали на трансиллюминатор для визуализации исследуемых фрагментов. Для дальнейшего анализа электрофорез фотографировали с помощью фотоаппарата Sony CyberShot DSC 707 с использованием фильтра Ж3-1.4х.
Электрофорез производили в 5% полиакриламидном геле размером 250x150x0,5 мм в вертикальной термостатируемой камере. Оба стекла предварительно выдерживали в 5% КОН, затем тщательно промывали водой и дистиллированной водой. Одно из стекол обрабатывали смесью 1 мл 70% этанола, 8 мкл BindSilane (LKB-Pharmacia), 25 мкл ледяной уксусной кислоты для обеспечения связывания геля со стеклом. Затем стекло трижды протирали 70% этанолом и мыли с детергентом (жидкость для мытья посуды) в теплой воде, сушили вдалеке от второго стекла. Стеклопакет собирали в горизонтальном положении (по уровню).
Для приготовления 30 мл 5 % геля в фалькон (50 мл) брали навеску 1,5 г смеси акриламид/бисакриламид в соотношении 19:1 (1.425 г и 0.075 г, соответственно) с помощью аналитических весов Sartorius BP121S. Приливали 30 мл ТАЕ (40 тМ Трис-HCl, рН 8.0; 1мМ ЭДТА; 20мМ СНзСООН), перемешивали и дегазировали раствор в колбе Бунзена под водоструйным насосом до прекращения появления пузырей. Добавляли 120 мкл 20% раствора -персульфата аммония (PSA) и 12 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED). Аккуратно, не допуская образования пузырей, заливали гель в пакет. Залитый гель застывал 40 мин, после чего стекла устанавливали вертикально в камере и заливали в верхний и нижний отсек буфер ТАЕ. Проводили предфорез в течение 15 мин при напряжении 100 В.
К 4 мкл пробы добавляли 2 мкл бромфенолового синего и наносили в карманы геля. Электрофорез шел при 20 В в течение 16 часов в холодной комнате. Затем стеклопакет разнимался при помощи шпателя, стекло с гелем помещалось в водный раствор бромистого этидия (5 мкг/мл) и в течение часа выдерживалось на качалке. При просмотре на трансиллюминаторе на стекле-основе отмечали участки геля с нужными полосами, которые впоследствии вырезали.
Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае
В разное время исследователями изучался спектр мутаций гена ФАГ у больных ФКУ из ряда регионов Европы: Ирландии (Zschocke et al, 1995; Tyfield, 1997; Zschocke et al, 1997; O Donnell et al, 2002), Дании (Guldberg et al, 1993), Германии (Guldberg et al, 1996; Zschocke and Hoffmann, 1999; Hennermann et al, 2000; Aulehla-Scholz and Heilbronner, 2003), Франции (Abadie et al, 1993), Испании (Perez et al, 1997, Desviat et al, 1999, Mallolas et al, 1999), Польши (Jaruzelska et al, 1993; Zekanowski et al, 1994; Zygulska et al, 1994; Zekanowski et al, 2001), Украины (Nechyporenko and Livshits, 2002), Литвы (Kasnauskiene et al, 2003), Латвии (Pronina et al, 2003), Эстонии (Lillevalie/a/., 1996).
Аналогичные исследования для регионов России до настоящего времени носили менее системный характер и включали значительно меньшее число больных и членов их семей из отдельных регионов: Москвы (Charikova et al, 1993), Санкт-Петербурга (Барановская и др. 1995), Татарии (Kuzmin et al, 1995), Башкирии (Викторова и др., 1997), Дальнего Востока (Sueoka et al, 1999).
По ряду причин сравнение данных, полученных различными исследователями в разное время, является лишь частично возможным и, по всей видимости, не полностью отражает популяционные события, затрагивающие обуславливающие ФКУ аллели гена ФАГ. В числе таких причин следует назвать то, что: 1. Исследованные пациенты не обязательно представляют исследованную популяцию. В некоторых случаях количество пациентов было мало, и возможна значительная погрешность при определении спектра мутаций. 2. Различные исследователи либо включали, либо не включали пациентов с диагнозом «гиперфенилаланинемия». 3. Не во всех исследованиях бралась в расчёт этническая принадлежность пациентов. 4 . В некоторых работах исследование спектра мутаций ограничивалось скринингом на ограниченное число предположительно «наиболее распространённых» мутаций. В значительной части исследований.идентификация мутаций производилась методом DGGE, дающим не более 95% достоверности. И лишь в части исследований идентификация мутаций производилась методом секвенирования.
Последний пункт требует пояснения. Многообразие типов обуславливающих ФКУ мутаций и значительная протяжённость гена ФАГ определяют сложность достоверной идентификации этих мутаций у значительных групп людей. Традиционные косвенные подходы, широко использовавшиеся еще не так давно для идентификации мутаций, основаны либо на изменении физико-химических свойств фрагмента ДНК (например, DGGE, SSCP) и позволяют лишь констатировать факт наличия в исследуемом фрагменте ДНК мутаций; либо на применении эндонуклеаз рестрикции (ПДРФ, ACRS PCR) для идентификации известной мутации. Первые недостаточно информативны, т.к. не дают сведений о типе и локализации мутации; вторые позволяют идентифицировать только один тип мутаций, на который разработан диагностический набор.
В настоящее время наиболее достоверным методом идентификации мутаций является прямое определение нуклеотидной последовательности соответствующего фрагмента ДНК. Это единственный метод, позволяющий абсолютно достоверно идентифицировать любые, в т.ч. ранее неизвестные мутации. Использование техники флуоресцентного мечения продуктов реакции Сэнгера и автоматического генного анализатора обеспечивает высоко достоверную детекцию мутаций в гетерозиготном состоянии, а также упрощает и удешевляет процедуру в целом.
В ходе настоящей работы нами исследовался спектр и частота мутаций гена ФАГ обуславливающих фенилкетонурию и гиперфенилаланинемию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае.
Методом ПЦР амплифицировали фрагменты гена ФАГ, включающие экзоны и прилегающие участки интронов гена. Позиции олигонуклеотидов -праймеров выбирали таким образом, чтобы продукты ПЦР включали экзоны и протяжённые участки интронов гена, полностью перекрывая все возможные сайты сплайсинга. Идентификация обуславливающих ФКУ мутаций гена ФАГ производилось методом определения нуклеотидной последовательности соответствующих продуктов ПЦР с использованием автоматических генных анализаторов ABI Prism 310, ABI 3100 - Avant {Applied Biosystems, USA). Во всех случаях, когда это было возможно, идентификация мутаций производилась у всех родственников больного ФКУ. Таким образом осуществлялось дополнительное подтверждение наличия обуславливающих ФКУ мутаций и их семейный анализ. Исключением из этой процедуры являлись воспитанники детских домов, домов ребёнка и другие больные ФКУ, образцы ДНК родственников которых были недоступными.
Было исследовано 142 аллеля гена ФАГ у 71 больного с диагнозами «фенилкетонурия» или «гиперфенилаланинемия». В 111 аллелях были идентифицированы обуславливающие ФКУ мутации. Всего было идентифицировано 20 типов мутаций, обуславливающих ФКУ. Полученные результаты сведены в таблице 5 и приложении 1.
