Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы достигнуты значительные успехи в инженерии антител - области молекулярной биологии, имеющей целью создание неприродных антител с заданными функциями (Lobato M.N., 2004; Adrian Auf der Maur, 2004). Суть направления, называемого intrabody (intracellular antibody), состоит во введении в организм генетических конструкций, кодирующих in vivo антитела с запрограммированными антигенсвязывающими и/или эффекторными функциями. Такие антитела узнают белки патогена или регуляторные клеточные белки; поскольку антитела синтезируются непосредственно в организме, они могут оказаться весьма эффективными при лечении онкологических, инфекционных и других заболеваний. На этапе формирования такого подхода, в первых же практических работах возможность получения терапевтического эффекта была продемонстрирована в случаях СПИДа и других заболеваний (Chen S.Y., 1994).
Быстро развивающимся направлением современной фундаментальной и практической иммунологии является введение генов в клетки и ткани организма как в целях генной терапии, так и в целях ДНК-иммунизации. При этом принципиальное значение приобретает изучение условий и специфичности экспрессии генов в различном микроокружении: синтезируемые и секретируемые в ходе ДНК-иммунизации и генной терапии белки могут оказывать существенное воздействие на физиологические процессы. Важно, с одной стороны, искать оптимальные способы введения генов в клетки, а с другой - изучить закономерности экспрессии введенных генов в зависимости от типа ткани. В случаях рекомбинантных белков весьма важно также оценить иммунный ответ организма на ксепогенпые детерминанты синтезирующихся белков.
Ген барстара интересен как объект для трансфекции:
белок барстар имеет небольшой размер (90 кДа), что минимизирует вероятность неправильного фоддинга белка;
белок барстар связывается с рибонуклеазой барназой с высокой константой связывания, что позволяет использовать результаты даже поисковой работы для совершенствования использования модуля барназа-барстар; модуль
может использоваться как для селективного килинга клеток, то есть в
терапевтических целях, так и для целей диагностики;
белок имеет бациллярную природу и идентифицируется вне зависимости от
окружения, так как константа связывания его с белками человеческой и
мышиной систем мала;
существуют апробированные методы идентификации белка.
Ген иммуноглобулина изотипа Е интересен как объект для трансфекции в силу ряда причин:
моноклональные IgE уже использовались в мышиных моделях для терапии опухоли (Kershaw М.Н., 1998);
сопоставление эффективности применения химерных IgE и IgG для случая иммуноглобулин-обусловленного киллинга клеток карциномы выявило более сильный и долгий эффект именно при применении IgE (Gould H.J., 1999; Sutton B.J., 1999);
изучение роли IgE в антипаразитарньгх механизмах защиты организма (Vernersson М, 2002) позволило разработать подходы к противоопухолевой терапии (Reali Е., 2001);
высокоаффинное связывание IgE с рецепторами Тучных клеток в периферических тканях позволили выдвинуть (Gould H.J., 2003) предположение о возможности применения IgE в терапии опухолей периферических тканей и подтвердить обоснованность этого предположения.
Таким образом, последовательное изучение экспрессии барстара и IgE расширяет представление об экспрессии в гетерологичных эукариотических системах, дает возможность на относительно простом примере белка барстара отработать экспрессионную модель, а на примере химерного IgE - оценить возможности эукариотической модели и, в частности, проведения ДНК-иммунизации (ответ на ксеногенные детерминанты) и создать задел для дальнейших работ с химерным IgE в области терапии опухолей.
Цель и задачи работы
Целью работы явилось установление закономерностей экспрессии гетерологичных генов в различных клетках и тканях организма, а также разработка корректного количественного анализа уровня биосинтеза чужеродных иммуноглобулинов,
В работе были поставлены следующие задачи:
создание генетической конструкции для экспрессии генов в гетерологичной системе;
введение генов в различные клетки и ткани организма;
количественная оценка эффективности баллистической трансфекции генов химерных антител в различных клетках и тканях организма;
определение условий для корректной оценки уровня биосинтеза;
количественная оценка уровня биосинтеза полученных de novo белков;
оценка иммунного ответа организма на синтезированные чужеродные белки.
Научная новизна и практическая ценность работы
Ген баретара трансфицировали для определения возможности экспрессии и оптимизации анализа экспрессии - для случая экспрессии в эукариотах конструкций, способных специфически связывать рибонуклеазу барназу (барназа является составной частью целого ряда конструкций противоопухолевой направленности, и отработка модели экспрессии ее ингибитора позволяет существенно расширить арсенал подходов к противоопухолевой терапии).
Впервые использован метод баллистической трансфекции для введения генов полноразмерных химерных мышь/человек иммуноглобулинов и оценки уровня их биосинтеза. Результаты позволили выяснить закономерности экспрессии генов в гетерологичной системе, что важно для понимания процессов, лежащих в основе генотерапии и ДНК-иммунизации.
Ген иммуноглобулина Е трансфицировали для определения возможности экспрессии и оптимизации анализа экспрессии - для случая экспрессии в эукариотах конструкций, способных к участию в аллергических процессах и потенциально способных к участию в терапии опухолей ряда тканей.
В настоящей работе экспрессия генов иммуноглобулина Е и барстара оценивалась качественно и количественно in vitro и in vivo, причем в эксперименте in vivo анализировалась экспрессия в различных тканях животных. Также проведено исследование способности генов барстара экспрессироваться в клетках взрослого организма после трансфекции в эмбрион на стадии морулы.
Предложенный материал создает основу для дальнейшего исследования механизмов и закономерностей экспрессии генов.
Апробация работы
Основные положения диссертационного исследования были представлены на 39-й конференции МФТИ (Москва, 1996); 1-м Съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996); 4-й конференции РААКИ (Москва, 1997); "Fourth John Humphrey Advanced Summer Program in Immunology" (Пущино, 1998); международной научной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2001); международной научной конференции «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 2004), 7th International Engclhardt Conference on Molecular Biology (Суздаль, 2004).
Публикация
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации
