Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом 11
1.2. Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов 12
1.2.1. Соответствие различных серотипов хантавирусов определенным хозяевам-переносчикам 12
1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов 16
1.2.3. Синтез вирусной РНК и созревание вирионов 22
1.3. Диагностика ГЛПС 25
1.3.1. Метод флюоресцентных антител 27
1.3.2. Иммуно-пероксидазное окрашивание 28
1.3.3. Иммуноферментный анализ 29
1.3.4. Иммунохроматографические тесты 30
1.3.5. Полимеразная цепная реакция 31
1.3.5.1. ОТ-ПЦР, «гнездовая» ОТ-ПЦР 32
1.3.5.2. ПЦР в реальном времени 34
1.3.5.3. ЛЦР в реальном времени 46
2. Объект и методы исследований 49
2.1. Краткая характеристика объектов исследований 49
2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК 49
2.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 51
2.4. Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей 52
2.5. Синтез кДНК 52
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 53
2.7. Фосфорилирование 5'-концов олигонуклеотидных праймеров 53
2.8. Получение одинарных и двойного олигонуклеотидных дуплексов и определение их температуры плавления 54
2.9. ЛЦР или ОТ-ЛЦР в режиме реального времени 55
2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 55
2.11. Реактивы и материалы 56
2.12. Составы использованных стандартных растворов 57
3. Результаты исследований и их обсуждение 58
3.1. Реакции с плазмидной ДНК 58
3.1.1. Характеристика объекта исследований 58
3.1.2. Проверка плазмиды pCRII на наличие вставки 59
3.1.3. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времени 60
3.1.4. Проведение ПЦР и ЛЦР с оптимизированными параметрами реакций 65
3.2. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР на синтетической матрице 67
3.2.1.nLlPcSYBRGreenlHFAM/ROX 67
3.2.2.ЛЦРс8УВІІОгеепІиРАМ/ІІОХ 75
3.3. ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК 77
3.3.1. Реакции с построением кДНК 77
3.3.1.1. ОТ-ПЦР с ST-pol 78
3.3.1.2. ОТ-ПЦР с M-MLV-revertase/Tth-pol 83
3.3.2. Реакции на РНК-матрице 84
3.3.2.1. ЛЦР на РНК (четыре праймера) 84
Заключение 88
- Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов
- Диагностика ГЛПС
- Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей
- ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК
Введение к работе
Актуальность темы. На территории Российской Федерации с периодичностью раз в три-четыре года происходят эпидемические вспышки заболеваний, вызываемых хантавирусами, а Республика Башкортостан является одним из самых крупных в мире районов-очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Возбудителями ГЛПС являются вирусы рода Hantavirus (семейство Bunyaviridae), которые подразделяются на несколько различных серотипов.
По данным литературы в настоящее время насчитывается более 25 различных серотипов хантавирусов. Из них патогенными для человека являются хантавирусные серотипы Dobrava (DOB), Hantaan (HTN), Seoul (SEO), Puumala (PUU), из которых первые два вызывают тяжелую форму ГЛПС, остальные, соответственно, среднюю и легкую формы. Также патогенными являются серотипы Sin Nombre (SN), Black Creek Canal (BCC), которые вызывают обнаруженное в США заболевание, получившее название "хантавирусный пульмонарный синдром" (Vapalahti, 1996; Schmaljohn et al., 1995; Xiao et al., 1994; Avsic-Zupanc et al., 1995; Chu et al., 1994; Schmaljohn et al., 1985). Изоляты, выделенные в Башкортостане (Tkachenko et al., 1984), относятся к серотипу Puumala, представители которого вызывают менее тяжелые формы ГЛПС, нежели, например, серотип Hantaan. Однако в последнее время все чаще наблюдается более тяжелое течение заболевания, сопровождаемое «стертыми» симптомами, что значительно затрудняет своевременную постановку точного диагноза. ГЛПС по заболеваемости занимает первое место среди природно-очаговых инфекций в Российской Федерации. Число зарегистрированных случаев в отдельные годы может достигать 20 тысяч и более, нередки летальные исходы (Морозов, 2001; Ткаченко, Дроздов, 2002).
Основными переносчиками ГЛПС являются мышевидные грызуны. Передача вируса от грызуна к человеку происходит, в основном, воздушно-капельным путем.
7 К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и лечения ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в Республике Башкортостан характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3-4 года. Подобные вспышки, вероятно, связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов хантавирусным серотипом PUU, основным возбудителем ГЛПС в Башкортостане. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе и антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории Республики Башкортостан штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Самый высокий подъем заболеваемости ГЛПС за 40 лет с начала регистрации инфекции в Башкортостане пришелся на эпидемический сезон 1997-1998 гг., когда было зарегистрировано 10 057 случаев заболевания ГЛПС, из них 34 случая (0,4%) со смертельным исходом (Нургалеева и др., 1999). Серологическими методами была установлена принадлежность возбудителя данной вспышки к серотипу PUU, однако большой интерес представляла генетическая характеристика данного вируса.
Эффективность лечения любого заболевания определяется его правильной и ранней диагностикой. Для диагностики ГЛПС в лабораторной практике используются методы, основанные на детекции специфических антител. В то же время достоверные результаты можно получить только при использовании техники амплификации нуклеиновых кислот. Уже ставший рутинным при проведении научных исследований метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) трудоемок и требует наличия высококвалифицированного лабораторного персонала. Альтернативой традиционным методам может стать разработанная нами модификация метода ОТ-ПЦР, контролируемой в режиме реального
8 времени и использующей эффект резонансного переноса энергии флуоресценции для детекции продуктов амплификации.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени имеет несколько преимуществ перед обычной ПЦР (Klein, 2002; Tse, Capeau, 2003, Mackay, 2004): возможность наблюдения за накоплением целевого продукта в данный момент на любой из стадий реакции амплификации отсутствие постреакционных манипуляций для детекции образования целевого продукта (электрофоретический анализ и пр.), и, вследствие этого сокращение времени от начала проведения ПЦР до получения конечного результата.
При этом, с применением термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus (Tth-полимеразы), появилась возможность проводить построение кДНК и последующую ее амплификацию в одной пробирке (Myers, Gelfand, 1991), опять же, значительно сокращая время проведения реакции.
Цель и задачи исследования: Цель данного исследования заключалась в создании прототипа эффективной тест-системы для быстрого и специфического выявления хантавирусной РНК в биологических материалах на основе полимеразной и лигазной цепных реакций (ПЦР и ЛЦР) с использованием эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции. Были поставлены следующие задачи:
1. Определить физико-химические свойства объекта исследования, провести компьютерный дизайн флуоресцентно меченых и ^модифицированных олигонуклеотидных праймеров, необходимых для экспериментов с использованием ПЦР и ЛЦР.
Провести модельные эксперименты с выбранными праймерами с использованием ПЦР и ЛЦР, с целью подбора оптимальных параметров реакции при максимальном сокращении затрат времени.
Определить эффективность использования синтезированных праймеров в ПЦР и ЛЦР, совмещенных с обратной транскрипцией, при использовании в качестве матрицы вирусной РНК, выделенной из культур клеток Vero Е6, крови больных людей и легочной ткани грызунов-переносчиков ГЛПС.
Определить возможность проведения ЛЦР непосредственно на РНК, исключив из реакции стадию обратной транскрипции.
Научная новизна и практическая значимость. Проведенные эксперименты показали возможность создания прототипа быстрого и высокочувствительного диагностического теста на определение хантавирусной РНК в биологических препаратах с применением методов ПЦР и ЛЦР, контролируемых в режиме реального времени.
Доказана возможность сближенного расположения на матрице олигонуклеотидных праймеров, используемых в процессе ПЦР и ЛЦР, с целью обеспечения высокой эффективности переноса энергии флуоресценции в паре карбоксифлуоресцеин (FAM) - карбокси-Х-родамин (ROX).
В результате проведенных нами модельных экспериментов разработана методика проведения ПЦР и ЛЦР с помощью ферментов Tth-полимеразы и Tth-лигазы за максимально короткое время.
Показана возможность использования в качестве матрицы для ПЦР и ЛЦР со стадией обратной транскрипции вирусной РНК, выделенной как из культур клеток Vero Е6, инфицированных хантавирусом, так и из крови больных ГЛПС и из крови мышей-переносчиков ГЛПС.
Показаны возможность исключения из ПЦР и ЛЦР стадии обратной транскрипции, что существенно сокращает время на проведение анализа, и,
10 соответственно, возможность проведения ПЦР и ЛЦР непосредственно на РНК-матрице.
Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшем для диагностических целей и позволят проводить детекцию хантавирусной РНК в минимальных концентрациях за максимально короткое время на любых стадиях ГЛПС.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005); на 8-ом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005» (Пущино, 2005), на 2-ой Международной конференции «Биотехнология - Биомедицина -Окружающая среда» (Пущино, 2005).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 184 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 112 страницах и содержит 28 рисунков, 8 таблиц.
Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов
Впервые вирус, вызывающий тяжелую форму геморрагической лихорадки был изолирован в 1976 г. Но Wang Lee (Lee et al., 1976) из серых полевых мышей Apodemus agrarius, которые были отловлены близ реки Хантаан. В 1982 г. был обнаружен непатогенный серотип Prospect Hill, изолированный из луговых мышей Microtus pennsylvanicus, пойманных в США (Lee P. et al., 1982). В начале 80-х г.г. в Корее из диких крыс Rattus norvegicus (Lee Н., et al., 1982), а немного позднее из лабораторных мышей в Японии (Katimura et al., 1983) был выявлен этиологический агент, вызывающий ГЛПС и получивший название Seoul. Вирус серотипа Puumala был впервые обнаружен в 1980 г. в Финляндии (Brammer-Korvenkontio et al., 1980), а позднее штаммы Hallnas и Sotkamo серотипа Puumala были изолированы из полевок Clethrionomys glareolus, отловленных, соответственно, в Швеции и Финляндии (Schmaljohn et al., 1985; Yanagihara et al., 1984). Хотя Clethrionomys glareolus считается основным видом хозяина-переносчика вируса серотипа Puumala, этот же этиологический агент был выделен также из Clethrionomys rufocanus (Yanagihara et al., 1984; Lokugamage et al., 2003). Дальнейшие исследования позволили выявить антитела к хантавирусам у грызунов и людей в различных частях мира, что привело к изолированию новых вирусов, таких как Thailand из Bandicota indica в Таиланде, Dobrava из Apodemus flavicollis в Словении, v Thottapalayam из Suncus murinus в Индии. В 1993 г. в США был изолирован возбудитель геморрагической лихорадки с пульмонарным синдромом -вирус, сначала обозначенный как "четырехугольный" (Four Corner virus), по группе юго-западных штатов США, образующих на карте подобие четырехугольника, позднее названный Muerto Canyon virus (МС), а в настоящее время известный под окончательным названием Sin Nombre. Переносчиком этого вируса является олений хомячок Peromyscus maniculatus (Childs et al., 1994; Duchin et al., 1994; Hjelle et al., 1994a; Root et al., 2003). На сегодняшний день описано до 500 различных изолятов хантавирусов (Schmaljohn et al., 1985; Chu et al., 1994; Xiao et al., 1994; Plyusnin et al., 1994b; Schmaljohn et al., 1995; Avsic-Zupanc et al., 1995; Vapalahti, 1996; Morzunov et al., 1998; Vapalahti et al., 1999; Plyusnin, 2001; Klempa et al., 2003, 2004). Каждый хантавирус поддерживается в природе особой хозяйской видовой популяцией грызунов, насекомоядных, птиц или клещей. Внутри рода эти вирусы могут быть дифференцированы в группы на основе серологического родства. В настоящее время установлены следующие серотипы хантавирусов (табл. 1.1):
Помимо научного интереса, изучение рода Hantavirus имеет огромное практическое значение, поскольку, как упоминалось выше, ряд представителей данного рода вызывают эпидемии тяжелых заболеваний с высоким процентом летальных исходов. Из выше перечисленных хантавирусов патогенными для человека являются: Dobrava, Hantaan, Seoul, Puumala, из которых первые два вызывают тяжелую форму ГЛПС, остальные, соответственно, среднюю и легкую формы (Elliot, 1990; Antic et al., 1992a; Parrington et al., 1991). Патогенными также являются хантавирусы серотипов Sin Nombre, Black Creek Canal, Bayuo, New York, Andes, Monongahela и Laguna Negra, которые являются возбудителями заболевания "хантавирусный пульмонарный синдром" (Childs et al., 1994; Morzunov et al., 1998; Kariwa et al., 1999), причем хантавирус серотипа Andes является единственным хантавирусом, способным передаваться от человека к человеку (Rizvanov et al., 2004). Эволюционная взаимосвязь хантавирусов устанавливается на основе сравнительного анализа соответствующих нуклеотидных последовательностей М, S и L сегментов генома вируса (Vapalahti, 1996; Antic et al., 1992; Spiropoulou et al., 1994). Antic и соавт. (Antic et al., 1992b) выделяют два различных эволюционных ответвления на филогенетическом древе хантавирусов: одно включает вирусы, переносимые Apodemus и Rattus, такие как HTN и SEO серотипы, а другое включает серотипы, переносимые Clethrionomys и Microtus, такие как PUU и РН. Vapalahti (Vapalahti et al., 1999) провел филогенетический анализ различных серотипов хатавирусов, который показал, что вирусы, переносимые животными из подсемейств Arvicolinae (PUU, РН, TUL, ILV, KBR, TOP), Sygmodontine (SN, NY, BAY, BCC, ELMC, RIOS, LN) и Murinae (HTN, SEO, Thai, DOB) формируют, соответственно, три различные ветви, причем две первые группы вирусов генетически более близки друг к другу. Исследователи по-разному оценивают роль географического фактора в эволюции хантавирусов. Так полагают, что географический фактор не играет большой роли в эволюции этих вирусов и, как пример, приводят недавнюю изоляцию как PUU- , так и HTN-подобных вирусов из одних и тех же географических регионов Восточной Европы (Heyman et al., 2004, Cvetko et al., 2005), а также SEO- и HTN-подобных вирусов из одного и того же региона Кореи, Тайваня и Китая (Chow et al., 2005; Li et al., 2005). В противоположность этому, другие исследователи считают, что штаммовые различия хантавирусов связаны с их географической удаленностью друг от друга, и, так же, как каждый вид хозяина-переносчика занимает определенную территорию и экологическую нишу, так и хантавирус, имеет основного хозяина, в результате чего филогения хантавирусов и их переносчиков являются «отражениями» друг друга (Plyusnin et al., 1994а; Sironen et al., 2001; Plyusnin, 2001). Взаимосвязь между генетической и географической отдаленностью штаммов была также показана для PUU штаммов из Центральной Европы, для HTN штаммов из Китая и Кореи, для SN и других хантавирусов из США (Bowen et al., 1995; Liang et al, 1994; Xiao et al., 1993; Schmaljohn et al., 1988; Rowe et al., 1995; Song et al., 1996; Hjelleetal., 1995). 1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов Род Hantavirus входит в одну из самых крупных групп животных вирусов, семейство Bunyaviridae. Хантавирусы обладают характерными для данного семейства чертами. Вирусные частицы сферической формы, с диаметром от 90 до 120 нм. Вирионы хантавирусов имеют липидсодержашую внешнюю оболочку с поверхностными выступами, представляющими собой вируспецифичные гликопротеины, которая окружает три кольцевых нуклеокапсида диаметром 2-2,5 нм. Хантавирусы инактивируются растворителями липидов и термообработкой при 50С, они стабильны лишь в нейтральной среде при значениях рН не ниже 5,0 и не выше 8,0 (Schmaljohn et al., 1983). Геном представляет собой сегментированную кольцевую негативную одноцепочечную РНК с суммарной массой (4,5-7) 106 кДа. Термин "негативная" означает, что РНК генома комплементарна матричной РНК, кодирующей вирусные белки. Вирусная частица содержит 4 структурных белка: два внутренних белка - вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), нуклеокапсидный белок (N-белок), и два белка оболочки - гликопротеины G1 и G2.
Диагностика ГЛПС
Антигенные свойства хантавирусов обусловлены наличием антигенов нуклеокапсидного белка и антигенов поверхностных гликопротеинов, вызывающих образование вируснейтрализующих антител. При исследовании свойств различных антител к вирусу Puumala было выявлено, что нуклеокапсидный белок вызывает образование антител, не способных нейтрализовать инфекционную активность, тогда как поверхностные гликопротеины стимулируют образование нейтрализующих антител (Деконенко, Ткаченко, 2004). Использование моноклональных антител в лабораторной диагностике сделало возможным детальное определение антигенных связей между различными хантавирусами (Dzagurova et al., 1995), а выявление вирусных антител в клинических образцах стало важным компонентом вирусной диагностики. Методы выявления антител применимы в следующих случаях: а) вирусный белок уже экспрессировался и присутствует в исследуемом образце, б) имеются в наличии подходящие антитела (обычно, но не обязательно, моноклональные), в) антигенные различия разных штаммов вируса не препятствуют его выявлению с помощью иммунологических реагентов, г) антиген достаточно стабилен и не разрушается при транспортировке образцов в лабораторию и при его последующей обработке. В отношении ГЛПС известно, что антитела появляются в крови больных с 3-7 дня болезни, достигают максимальной концентрации к 17-21 дню и сохраняются на постоянном уровне в течение длительного времени (Фазлыева с соавт., 1995). У некоторых людей, перенесших ГЛПС, высокие титры антител в сыворотке крови определяются и через 10-30 лет (Miyamoto et al., 2003). Концентрация IgM повышается в первые дни вирусной инфекции, как начальный этап гуморальной защиты организма на внедрение вируса (Петров, 1976; Петров с соавт., 1985). В последующие периоды заболевания отмечается снижение концентрации IgM, и одновременно определяется повышение уровня IgA, который участвует в гуморальном иммунном ответе на тканевый антиген. Стабильное нарастание IgA при ГЛПС (с 10 дня болезни), возможно, предохраняет ткани от повреждающего действия чужеродных для организма антигенов, связывая их (Рощупкин, Суздальцев, 1990).
Нарастание уровня IgG с максимальным его содержанием прослеживается в периоде реконвалесценции, то есть к 20-22 дню заболевания. Сравнительный анализ спектра иммуноглобулинов сыворотки крови показал, что уровень IgG достоверно выше (РО.001) при среднетяжелом и тяжелом течении ГЛПС по сравнению с легким (Фазлыева с соавт., 1995). Исследования, проводившиеся на оленьих хомячках (Botten et al., 2002), показали, что, в отличие от людей, достаточный для детекции уровень антител у хомячков достигается к 14 дню после заражения хантавирусом, детекция вирусной РНК с помощью ОТ-ПЦР так же возможна с 14 дня, а вирусный N-белок распространяется практически по всему организму, больше всего накапливаясь в сердце, печени, легких, почках, белом и буром жире. К настоящему времени рутинными в диагностике ГЛПС являются несколько иммунологических методов с различной степенью чувствительности, но четко коррелирующих между собой. Это: МФА (метод флуоресцирующих антител), ИП-окрашивание, различные варианты ИФА (иммуноферментного анализа) и иммунохроматографические тесты. 1.3.1. Метод флуоресцирующих антител Метод флуоресцирующих антител (или иммунофлуоресцентный анализ (Кирней, 1989)) - это метод иммунофлуоресценции, который проводится для изучения антигенных и генетических взаимоотношений хантавирусов либо на криостатных срезах легочной ткани диких грызунов, либо на монослое клеток Vero Е6, инфицированных вирусом. В прямом МФА флуоресцентным красителем (обычно флуоресцеин изотиоцианатом) метятся антитела, узнающие вирусный антиген. В непрямом МФА, который используется для детекции антивирусных антител в физиологических жидкостях больных ГЛПС (Верета с сотр., 1993; Веселов с сотр., 2003; Lledo et al., 2003), антивирусные антитела находятся в исследуемом образце и немечены, после связывания с антигеном добавляются антитела против иммуноглобулинов человека, несущие флуоресцентную метку. По окончании реакции образцы микроскопируются в ультрафиолетовом свете с соответствующей длиной волны. Прямой МФА прост в использовании, за исключением того, что все антитела обязательно должны нести флуоресцентную метку. Однако результаты обследования различных хантавирусных штаммов с помощью данного метода могут быть весьма разноречивы, и предпочтение при выяснении антигенных взаимоотношений остается за реакцией нейтрализации (Деконенко, Ткаченко, 2004). Непрямой МФА несколько более чувствителен, т. к. флуоресцентную метку содержат только антивидовые антитела. Недостатками данного метода являются трудоемкость, невысокая точность и значительный элемент субъективизма, связанный с тем, что, как правило, нелегко отличить с достаточной надежностью слабую положительную реакцию от отрицательной. 1.3.2. Иммуно-пероксидазное окрашивание Этот метод отличается от МФА только тем, что вместо флуоресцентной метки используется пероксидаза хрена. После инкубирования антител с пероксидазой с исследуемым образцом, добавляется субстрат для пероксидазы, который изменяет цвет при воздействии на него фермента. Достоинство метода состоит в том, что просматривать образцы можно в обычный микроскоп. Еще больше данный метод подходит для проведения иммуноанализа на срезах тканей параллельно с гистологическим анализом, что позволяет выявить взаимодействия между вирусными антигенами и клеточными структурами (Fields, 2001). Недостаток данного метода в том, что он еще более громоздкий, чем МФА, а также в том, что эндогенные пероксидазы могут вызывать довольно сильное фоновое окрашивание. 1.3.3. Иммуноферментный анализ Обнаружение специфических антител в физиологических жидкостях организма играет важную роль в клинической диагностике широкого круга заболеваний как инфекционного, так и аутоиммунного характера. Методы ИФА - это разнообразные и широко использующиеся методы, которые могут применяться для детекции антигенов независимо от того, находится ли антиген в растворе, или связан с клеточной поверхностью.
Непрямой иммуноферментный анализ используется для обнаружения и количественного определения антител против бактериальных и вирусных антигенов, таких, как плазмодий, трипаносома, кишечная палочка, холерный вибрион, тифозные риккетсии, вирус свиной чумы, вирус простого герпеса, вирус краснухи (Халберт, Лин, 1988). В этом методе лиганд или антиген, иммобилизованный на твердом носителе, инкубируют с анализируемым образцом, затем твердую фазу промывают и инкубируют с антивидовыми антителами к иммуноглобулинам, содержащими ферментную метку. После отделения твердой фазы измеряют активность связанного с ней фермента, которая прямо пропорциональна концентрации антител в исследуемом образце (Нго, 1988). Этот метод используется для выявления в сыворотках больных ГЛПС иммуноглобулина М к нуклеокапсидному (НК) антигену хантавируса (Веселое, с соавт., 2003) и для серотипирования вновь выявленных хантавирусных генотипов (Miyamoto et al., 2003). При другом варианте ИФА на подложке иммобилизуются антитела, А специфичные к вирусным антигенам и инкубируются с исследуемым образцом для образования комплекса антиген-антитело. Образовавшийся комплекс детектируется с помощью гипериммунной сыворотки, конъюгированной с подходящим ферментом и субстратом. Данный вариант ИФА используется в клинической диагностике ГЛПС при невозможности установления точного диагноза другим способом (Wichmann et al., 2001). Недостатками этого метода применительно к хантавирусам также являются трудоемкость получения антигена (выделение из инфицированных клеток Vera Е6) и фиксации его на твердой поверхности, и, соответственно, продолжительность проведения анализа.
Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей
Тотальную РНК выделяли из тканей одного из погибших вследствие заболевания ГЛПС в 2004 г. экстракцией смесью гуанидинтиоционат-фенол-хлороформ (Chomczynski et al., 1987). Кровь лизировали добавлением буфера, содержащего 4 М гуанидинтиоционат, 25 мМ цитрат натрия (рН=7,0), 0,5 % саркозил, 0,1 М 2-меркаптоэтанол. Затем к лизату добавляли 0,1 объема 2 М ацетата натрия, рН=4,0; 1 объем водонасыщенного фенола и 0,2 объема смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). Образовавшуюся смесь энергично встряхивали 5 мин, выдерживали 15 мин на холоде и центрифугировали в течение 10 мин при 10000 g на центрифуге MPW-50 (Польша). Водную фазу, содержащую РІЖ, отбирали и смешивали с равным объемом изопропанола. Препарат выдерживали при -20С до формирования видимого осадка и центрифугировали 10 мин при 10000 g. Осадок РНК подсушивали, растворяли в лизирующем буфере и повторно осаждали добавлением двух объемов 96%-ого спирта. Конечный осадок РНК промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в минимальном объеме бидистилированной воды. .2.5. Синтез кДНК ДНК, комплементарную вирусной геномной РНК (кДНК) получали при помощи фермента AMV-ревертазы (обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц) (Frohman, 1988). Реакцию проводили при 42С в течение 1 час. Реакционная смесь содержала 1-2 мкг РНК, 10 пмоль праймера (HV1, HV11, HVl-long, HV71, HV72 или их флуоресцентно меченые аналоги), 1-кратный буфер (50 мМ трис-HCl (рН=8,3), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 0,5 мМ спермидина), по 500 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов и 5 единиц фермента (AMV-ревертаза и dNTP от фирмы "Promega", США). 2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени Амплификацию вирусной кДНК проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). К 29 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН=8,8), 2,5 мМ MgCb, 0,01% твин-20, 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 2 единицы Tth-полимеразы, по 5-6 пмоль каждого из праймеров, добавляли 1 мкл кДНК хантавируса.
Амплификацию проводили на амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ фирмы BioRad (США) в 0,2 мл реакционных пробирках по программе: 20-25 циклов; 80С - 4 с, 37-42С -Юс. 2.7. Фосфорилирование 5 -концов олигонуклеотидных праймеров Фосфорилирование олигонуклеотидов (по 1 о.е. каждого) проводили с помощью фермента Т4 полинуклеотидкиназа (2 ед. акт.) и 1 мМ АТФ в 100 мкл реакционной смеси, содержащей также 20 мМ трис-HCl (рН=7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ спермидина. Реакцию проводили в течение 30 мин при 37С, фермент удаляли однократной депротеинизацией смесью фенол-хлороформ (1:1) и после центрифугирования верхний водно-солевой слой осаждали 3 объемами этанола. После выдерживания при температуре -70С в течение 30 мин осадок собирали в микроцентрифуге и после промывки 70%-ным этанолом растворяли в 400 мкл дистиллированной воды. » Для получения контрольных молекул в виде двойных дуплексов олигонуклеотиды HV1, HV3 и фосфорилированные олигонуклеотиды НУ2ф и НУ4ф в количестве по 0,01 о.е. (по 4 мкл) каждого смешивали в микроцентрифужной пробирке и нагревали до 85С, затем медленно охлаждали до комнатной температуры. Образовавшиеся одинарные дуплексы типа 1/4 и 2/3 лигировали в конечном объеме 20 мкл в буфере следующего состава: 400 мМ трис-НС1, 100 мМ MgCl2,100 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ с помощью Т4 ДНК лигазы в течение 2 час при температуре 20С. Определение температур плавления одинарных и двойного дуплексов проводили в ДНК амплификаторе модели iCycler iQ фирмы Bio-Rad (США) в 0,2 мл реакционных пробирках в объеме 25 мкл как предусмотрено соответствующим протоколом прилагаемой к прибору программы. Одна пробирка содержала смесь олигонуклеотидов 1, 2, 3, и 4, формирующих одинарные дуплексы 1/4 и 2/3, а другая - полученные с помощью Т4 ДНК лигазы двойные дуплексы. Переход из двуцепочечного состояния в одноцепочечное контролировали по свечению интеркалирующего красителя SYBR Green І. Для обнаружения температур перехода из двуцепочечного состояния в одноцепочечное строили зависимость отрицательного значения первой производной флуоресценции от температуры, получая тем самым кривые плавления, на которых выделялись два пика. Один пик, имеющий более низкую температуру плавления, принадлежит одинарным дуплексам, а второй, с более высокой температурой плавления, - двойному дуплексу. ЛЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 фмоль ДНК (или кДНК) в 1 мкл раствора, 2,5 мкл 10-кратного буфера (40 мМ трис-HCl (рН=8,0), 5 мМ MgCl2, 25 мМ КС1, 2 мМ спермидина, 5 мМ ДТТ, 0,1 мМ НАД); 1 мкл (70 ед. акт.) Tth ДНК лигазы; 20 мкл смеси четырех олигонуклеотидов, два из которых (2 и 4) были фосфорилированы, и соответствующее количество дистиллированной воды.
Условия протекания реакции: денатурация двуцепочечной ДНК (или кДНК) при 94С, 30 с, отжиг олигонуклеотидов и их лигирование - 37-42С, 15-20 с, денатурация одинарных дуплексов - 75-80С, 8 с с регистрацией свечения интеркалирующего красителя SYBR Green І в конце этой стадии. Количество циклов - 22-25. Температуры отжига и лигирования олигонуклеотидов, а также температура плавления одинарных дуплексов варьировала в разных экспериментах в зависимости от длины и GC-состава используемых олигонуклеотидов. Отдельно для каждого комплекта олигонуклеотидов подбиралась температура, при которой обеспечивалась денатурация одинарных дуплексов и производилась регистрация свечения интеркалирующего красителя в комплексе с целевым продуктом ЛЦР, как это описано в п. 2.8. В качестве контроля проводили ЛЦР без добавления исследуемой ДНК (или кДНК), а также с добавлением ДНК, не содержащей участка, комплементарного используемым олигонуклеотидам. 2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы " DNASTAR, Inc." (США). Нуклеотидные последовательности S-сегментов хантавирусов были взяты из опубликованных статей и посредством Интернета в обновляемых версиях "GenBank". Рестриктазы: НраІІ ("MBI Fermentas", Литва) ДНК-лигаза фага Т4 (Pharmacia, Швеция) АТФ (Serva, ФРГ) Трис (гидроксиэтиламинометан) "Trizma" или "Sigma 7-9" (Sigma, США) ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль) (Serva, ФРГ) Дрожжевой экстракт, Бакто-пептон, Бакто-агар, Бакто-триптон (Difco, США) Ампициллин, тетрациклин (Serva, ФРГ) Полиэтиленгликоль 6000 (Fluka, Швейцария или Merck, ФРГ) Агароза для электрофореза ДНК (Bio-Rad, США) Агароза для электрофореза ДНК (Serva, ФРГ) Агароза легкоплавкая (Bio-Rad, США) Бромфеноловый синий (C.A.F. Kahlbaum Chem. Fabrik., Германия) Этидиум бромид (Fluka, Швейцария) Дезокси АТФ, дезокси ЦТФ, дезокси ГТФ, дезокси ТТФ (Promega, США) DTT (дитиотрийтол) (Serva, ФРГ) SDS (додецилсульфат натрия) (Serva, ФРГ) X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактопиранозид (Boehringer Manheim, ФРГ) IPTG (изопропил-(3-Б-тиогалактопиранозид) (Boehringer Manheim, ФРГ) Мочевина, формамид (BDH, Англия) / персульфат аммония, ксиленцианол (Whatmann, Англия) \ Акриламид, метиленбисакриламид (Serva, ФРГ) TEMED (тетраэтилметилендиамин) (Fluka, Швейцария) BSA (бычий сывороточный альбумин) (Sigma, США)
ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК
Для подтверждения результатов, полученных при использовании плазмидной и синтетической матриц, были взяты образцы РНК, выделенные из культур клеток Vero Е6, зараженных вирусом ГЛПС, крови больных ГЛПС и легочной ткани грызунов-переносчиков ГЛПС. РНК выделяли с помощью TRIZOL и хранили при -20С под изопропанолом (табл. 3.5). Все выделенные образцы РНК (табл. 3.5) были использованы для проведения ПНР с построением кДНК. Образцы РНК, выделенные из грызунов, были разведены в 70 раз, чтобы приблизительно уравнять концентрацию всех образцов. Для построения кДНК и проведения ПЦР использовалась ST-polymerase (Single Tube polymerase) фирмы «Силекс», которая представляет собой смесь, состоящую из M-MLV обратной транскриптазы и Taq-полимеразы. После стадии построения кДНК с немеченым праймером HV1 или HV11 в реакционную смесь добавляли пару меченых праимеров HV11-FAM/HV31-ROX. Режим реакции оставался тем же, за исключением температуры отжига праимеров: отжиг на РНК праймера-затравки при 37С - 5 мин, построение кДНК при 50С - 5 мин, 25-30 циклов цепной реакции с отжигом при 42С - 8 с и денатурацией при 75-80С - 4 с. Результат реакции оказался неоднозначным. С одной стороны, кривые накопления ПНР-продукта указывают на наличие нужного продукта (рис. 3.17А, Б, В), с другой стороны - в некоторых образцах по результатам электрофореза в 10% ПААГе можно увидеть не один, а несколько ПЦР-продуктов (рис. 3.17Г). Чтобы проконтролировать правильность результатов, полученных в экспериментах, описанных в разделе 3.3.1.1., мы провели опыт с отдельным построением кДНК с помощью M-MLV-ревертазы фирмы «Силекс». Для наглядности в реакцию взяли праймеры разной длины: HV1-FAM/HV3-ROX и HV11-FAM/HV31-ROX. В качестве матриц для построения кДНК были взяты образцы РНК №№1, 4, 9, 12. Отжиг праймеров проходил при 32С, видимо, этим можно объяснить появление неспецифических полос, в 9 из 12 образцов (рис. 3.20, 3.21), хотя при температуре отжига 42С таких артефактов в реакциях с пробами РНК, выделенными из грызунов, не отмечалось. Из-за отсутствия 5 -концевого нуклеотида на стадии отжига между соседними праймерами образуется просвет в один нуклеотид.
Для того, чтобы прошло лигирование, в реакционную среду добавляется соответствующий недостающий дезоксинуклеозидтрифосфат, полимераза, «вставляющая» этот дНТФ, и лигаза. Реакция проводилась в том же режиме, с праймерами НУ1-БАМ/НУ2ф/НУЗ-1ЮХ/НУ4ф и HV1-FAM/ НУ2(іСф/ HV3-ROX/ НУ4(Юф, соответствующими дезоксинуклеозидтрифосфатами (dCTP, dGTP), Taq-полимеразой и разными лигазами: Tth-лигазой, Taq-лигазой и Т4 ДНК-лигазой. Результаты проведенных исследований (рис. 3.23, 3.24, 3.25) подтвердили предполагаемую возможность осуществления реакции лигирования непосредственно на РНК-матрице и, соответственно, исключения стадии обратной транскрипции во время проведения лигазной цепной реакции. Можно также отметить, что ЛЦР с укорочеными праймерами проходит более специфично, чем с обычными праймерами, а Tth-лигаза активнее Taq-лигазы почти вдвое и ее использование в ЛЦР предпочтительнее. Актуальность проблемы ГЛПС обусловлена постоянным ростом заболеваемости, увеличением числа тяжелых клинических форм и регистрирующимися случаями смертности. Отдельную проблему составляет отсутствие в России вакцин, разработанных на основе региональных штаммов-возбудителей. Поэтому актуальной является разработка и внедрение в медицинскую практику новых эффективных методов ранней диагностики ГЛПС. Нами были проведены модельные эксперименты ПНР и ЛЦР с отработкой температурных условий проведения реакций, в результате чего созданы методики проведения ПЦР и ЛЦР для диагностики хантавирусов серотипа Пуумала с помощью ферментов Tth-полимеразы и Tth-лигазы. С помощью тщательного подбора температур денатурации и элонгации время проведения ПЦР и ЛЦР существенно сокращено (до 35-40 минут). Этот показатель является немаловажным для клинической диагностики ГЛПС. Нами была подтверждена возможность использования в качестве матрицы для ПЦР и ЛЦР со стадией обратной транскрипции вирусной РНК, выделенной как из культур клеток Vero Е6, инфицированных хантавирусом, так и из крови больных ГЛПС и из легочной ткани мышей-переносчиков ГЛПС вне зависимости от давности взятых образцов. Важным обстоятельством является то, что разработанная система диагностикумов рассчитана на присутствие в исследуемых образцах даже обломков молекул РНК. Показаны возможность исключения из ПЦР и ЛЦР стадии обратной транскрипции, что существенно сокращает время на проведение анализа, и, соответственно, возможность проведения ПЦР и ЛЦР непосредственно на РНК-матрице. Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшем для диагностических целей и позволят проводить высокочувствительную детекцию хантавирусной РНК за максимально короткое время на ранних стадиях ГЛПС. 1. Разработаны высокочувствительные методы детекции продуктов полимеразной и лигазной цепных реакций в режиме реального времени, использующие эффект резонансного переноса энергии флуоресценции, обеспечиваемый оригинальной схемой максимально сближенного размещения олигонуклеотидных праймеров. 2. Предложены прототипы эффективных диагностических систем, использующих методы ПНР и ЛЦР для быстрой и высокочувствительной диагностики хантавирусной РНК в биологических препаратах различного происхождения, в том числе и выделенных из крови больных ГЛПС. 3. Проведена оптимизация параметров реакций ГЩР и ЛЦР за счет подбора температурного режима и концентраций олигонуклеотидньк праймеров, обеспечивающая высокую чувствительность при сокращении общей продолжительности процессов. 4. Показана возможность исключения при проведении лигазной цепной реакции стадии конверсии РНК в ДНК, за счет лигирования на них олигонуклеотидов при использовании в качестве матрицы непосредственно молекул РНК.
