Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Методы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК 10
1.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ . 16
1.3. Лигазная цепная реакция - ЛЦР 37
1.4. Амплификация смещением цепи - Strand Displacement Amplification (SDA) 45
1.5. Амплификация по типу катящегося кольца или рамификация 48
1.6. Самоподдерживающая репликация 5.0
1.7. Технология циклирующей пробы 52
1.8. Гибридизационная цепная реакция - ГЦР 54
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований 58
2.2. Выделение и очистка нуклеиновых кислот 58
2.3. Получение кДНК 60
2.4. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени 60
2.5. Полимеразная цепная реакция 61
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 61
2.7. Транскрипционная цепная реакция в реальном времени 62
2.8. Рамификация в реальном времени 62
2.9. Проведение амплификации по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы в реальном времени 63
2.10. Электрофоретический анализ ампликонов и исходных молекул нуклеиновых кислот 64
2.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей . 65
2.12. Использованные в работе обычные и модифицированные олигонуклеотиды 66
2.13. Основные реактивы, использованные в работе 69
2.14. Составы использованных стандартных растворов 70
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени 71
3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 95
3.3. Транскрипционная цепная реакция в реальном времени 107
3.4. Рамификация в реальном времени 111
3.5. Амплификация по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы 115
3.6. Применимость реакций амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени для фундаментальных исследований и диагностических целей 122
Заключение 134
Выводы 137
Литература 139
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ
- Самоподдерживающая репликация
- Гибридизационная цепная реакция в реальном времени
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Введение к работе
Актуальность темы. После своего появления в середине 80-х гг. полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Saiki et al., 1985; 1988] очень быстро стала по существу методом №1 в фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностике. Оставаясь таковым и поныне, она все же сильно изменилась, что в первую очередь связано с переводом этой реакции в режим реального времени, где детекция накопления ампликонов ведется в ходе самого процесса амплификации. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) во многом изменила взгляды как исследователей, использующих метод ПЦР для получения новых знаний о функционировании генов и геномов, так и тех, кто занят исключительно ДНК-диагностикой. Если для первых главным среди других задач является возможность количественного определения с помощью ПЦР-РВ числа копий той или иной мишени в стартовом материале, то вторые, помимо этого, отдают ей предпочтение еще и ввиду практически полного исключения загрязнения ампликонами рабочих помещений, и сведения таким образом, риска получения ложнопозитивных результатов к абсолютному минимуму, что при массовом характере анализов при использовании обычной ПЦР удается добиться далеко не всегда. Однако, несмотря на большое количество предложенных вариантов детекции ампликонов в ПЦР-РВ [Higuchi et al., 1993; Lee et al., 1993; Livak et al., 1995; Tyagi et al., 1996; 2000; Nazarenko et al., 1997; 2002; Wittwer et al., 1997; 2003; Whitcombe et al., 1999; Todd et al., 2000; Rasmussen et al., 2003; Zhang et al., 2003; Costa et al., 2004; Sherrill et al., 2004; Monis et al., 2005; Li et al., 2006; Ahmad, Ghasemi, 2007; Liu, Hong, 2007; Luk et al., 2007 и др.] остается возможность разработки новых способов, по некоторым параметрам превосходящих существующие.
Вслед за ПЦР на рубеже 90-х гг. появился целый ряд других реакций амплификации и способов высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК или РНК, среди которых можно отметить лигазную цепную реакцию (ЛЦР) [Wu, Wallace, 1989; Barany 1991], амплификацию смещением цепи [Walker et al., 1992], ее разновидность в виде амплификации катящимся кольцом [Lizardi et al., 1998; Zhang et al., 1998], технологию циклирующей пробы [Duck et al., 1990], самоподдерживающаюся репликацию [Kwoh et al., 1989; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991], Qp-репликазную амплификацию [Lomeli et al., 1989], разветвленную гибридизационную пробу [Urdea, 1987; Horn et al, 1997]. К настоящему времени большинство из них переведены в передовой и наиболее удобный для диагностики режим реального времени, однако в ряде случаев такой перевод оказался не очень эффективным и не лишенным серьезных недостатков.
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов изотермических и управляемых сменой температур реакций амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот в режиме реального времени и демонстрации возможности их применения на практике.
В задачи исследования входило:
1) преобразовать гибридизационную цепную реакцию нуклеиновых кислот в режим реального времени (ГЦР-РВ) и исследовать ее особенности;
2) разработать способы детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация), основанные на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET-эффекте) и эффекте гашения;
3) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов РНК с помощью транскрипционной цепной реакции (самоподдерживающейся репликации) на платформе "УФА" в реальном времени (ТЦР-РВ);
4) разработать новый способ детекции ампликонов на платформе "УФА" в ходе двухпраймерной амплификации катящимся кольцом (рамификации) в реальном времени;
5) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов ДНК путем объединения технологии циклирующей пробы с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием множественных дезоксирибозимов 10-23;
6) показать возможность использования разработанных методов амплификации и высокочувствительной детекции для фундаментальных и прикладных исследований. Научная новизна и практическая значимость. Разработаны варианты ГЦР-РВ, основанные на временном гашении свечения флуорохрома темновым гасителем и использовании FRET-эффекта. Продемонстрирована высокая специфичность данной реакции, позволяющая дискриминировать инициаторные молекулы с единичными заменами нуклеотидов, что может быть использовано при анализе однонуклеотидного полиморфизма ДНК высших организмов. Показана возможность использования в ГЦР молекул РНК в качестве инициатора самосборки без их перевода в кДНК. Разработаны улучшенные способы детекции накопления ампликонов в ПЦР-РВ на платформе "УФА", по большинству параметров превосходящие аналогичные методы. Разработан вариант проведения ТЦР-РВ, основанный на FRET-эффекте на платформе "УФА". Показано, что протекание двухпраймерной рамификации в реальном времени может контролироваться с помощью регистрации FRET-эффекта на платформе "УФА". Произведено объединение технологии амплификации ДНК катящимся кольцом с регистрацией этого процесса с помощью циклирующих проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибозимов.
Практическая значимость работы заключается в расширении спектра методов амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей ДНК или РНК в реальном времени. Показана возможность их использования как для фундаментальных, так и прикладных целей, в том числе для определения уровня экспрессии генов, содержащих интроны, а также безынтронных генов без ДНКазной обработки, для детекции коронавируса, хантавируса, вируса птичьего гриппа субтипа H5N1, бледной трепонемы, хламидии, а также для выявления генетически модифицированных растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Ш съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 2005), 3-ей международной конференции "Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность" (Пущино, 2006), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006" (Москва, 2006), международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" (Уфа, 2006), ГХ съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007). Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ-НШ-2217.2003.4, НШ-1003.2006.4, НШ-649.2008.4 и Государственных контрактов ФЦНТП №№02.445.11.7018, 02.445.11.7381, 02.512.11.2051, 02.512.11.2107, 02.512.12.0002; Фонда СР МФП НТС № 5490р/7971. Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 207 работ. Диссертация изложена на 160 страницах, содержит 46 рисунков и 3 таблицы.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ
Из воспоминаний R.Higuchi [Gingeras et al., 2005] следует, что в конце 80-х годов перед ним и его коллегами руководством компании Cetus была поставлена задача преобразовать полимеразную цепную реакцию так, чтобы продукты амплификации можно было контролировать прямо в ходе самой реакции, не прибегая к помощи гель-электрофореза. Однако ими в течение ряда лет разрабатывался совершенно бесперспективный вариант такой детекции, основанный на использовании биотин-стрептавидиновой системы. Неизвестно сколько бы времени еще понадобилось для прогресса в данной области, если бы не помогла счастливая случайность, когда один из сотрудников R.Higuchi по ошибке провел ПНР в присутствии бромистого этидия, считающегося ингибитором ДНК полимеразы. Каково же было удивление экспериментаторов, когда после проведения электрофоретического разделения ампликонов они увидели, что на наработку целевых продуктов присутствие бромида этидия не повлияло. Результатом этого ошибочного эксперимента стала разработка ПЦР в режиме реального времени, названной ими тогда кинетической [Higuchi et al., 1992; 1993] и повлекшей за собой создание нового типа ДНК амплификаторов, оснащенных оптическим модулем и способными детектировать изменение флуоресценции реакционной смеси. К настоящему времени разработано немало различных способов детекции продуктов ПЦР-РВ, большинство из которых сведено нами в табл. 1.2.1, а часть из них рассмотрена ниже более детально.
Принцип первоначально предложенного метода заключался в том, что бромид этидия гораздо эффективнее окрашивает двуцепочечную ДНК, которая в ходе ПЦР многократно увеличивалась в количестве, приводя к росту флуоресценции. Ввиду дешевизны и простоты подходов для проведения ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующих красителей, которые подобно бромистому этидию способны связываться с ДНК и светится в комплексе с ней заметно сильнее, для этой цели позже были предложены и другие красители. Предложенный вторым краситель оксазоловый желтый YO-PRO оказался для этой цели практически невостребованным [Ishiguro et al., 1995].
Наиболее широко применяемым интеркалятором является краситель SYBR Green I, связывающийся только с двуцепочечной ДНК и по сравнению с его собственной флуоресценцией светящийся в комплексе с ней в 100 раз сильнее [Wittwer et al., 1997]. Единичная работа [Bengtsson et al., 2003] посвящена красителю ВЕВО, который превосходит SYBR Green I тем, что светится с двуцепочечной ДНК в 200 раз сильнее, чем сам по себе, но при этом не нашедшему широкого применения, причем авторы в качестве положительного момента подчеркнули, что они привели его структурную формулу, тогда как таковая для SYBR Green I остается нераскрытой.
Другой предложенный для проведения ПЦР в реальном времени краситель LCGreen имеет серьезное преимущество перед SYBR Green I, поскольку, в отличие от последнего, он даже в высоких концентрациях не ингибирует протекание ПЦР, что оказывается весьма важным для постамплификационного анализа ампликонов путем их плавления в том же ДНК амплификаторе с оптическим модулем, где и шла реакция [Wittwer et al., 2003; Zhou et al., 2004]. Некоторым недостатком красителя LCGreen можно считать то, что максимум его возбуждения лежит в области 440 нм, что не позволяет использовать его с целым рядом ДНК амплификаторов. Предложенный недавно для детекции наработки ампликонов в ПЦР в реальном времени краситель SYTO 9 [Monis et al., 2005] лишен последнего недостатка красителя LCGreen, поскольку имеет спектры возбуждения и испускания, близкие к таковым у SYBR Green I, фильтрами для которого оснащены буквально все современные ДНК амплификаторы, работающие в режиме реального времени. При этом SYTO 9, как и LCGreen не ингибирует ПЦР, может использоваться в высокой концентрации и обеспечивать тем самым высокоэффективное плавление ампликонов [Monis et al., 2005]. Относительно недавно для детекции ПЦР в реальном времени предложены новые ассиметричные красители цианинового ряда, один из которых ВОХТО-МЕЕ показывает значительное снижение детекции неспецифической амплификации в виде практического исключения образования праймерных димеров [Ahmad, Ghasemi, 2007].
Однако ввиду того, что интеркалирующие красители все-таки способны связываться с любой двуцепочечной ДНК, появляющейся в реакционной смеси, которая может быть как целевым продуктом ПЦР, так и артефактом, применение для детекции ампликонов в ходе ПЦР в реальном времени, несмотря на дешевизну такого подхода используется в ДНК-диагностике не настолько широко и при том достаточно осторожно. Исходя из этого, можно считать, что ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующих красителей является низкоспецифичной.
При детекции ампликонов в ПЦР в реальном времени самую высокую степень специфичности обеспечивают способы, в которых помимо двух специфично отжигающихся праймеров дополнительное подтверждение амплификации нужного фрагмента генома исходит из отжига на участке между праймерами с соблюдением принципа комплементарности азотистых оснований еще одного олигонуклеотида, служащего гибридизационной пробой. Впервые такой подход к детекции продуктов ПЦР был разработан американскими авторами [Holland et al., 1991], где ими было предложено за счет 5 — 3 -экзонуклеазной активности Taq полимеразы, разрушать встречающейся ей на пути при построении комплементарной цепи ДНК специальный гибридизационный зонд, меченный в их работе по 5 -концу радиоактивным фосфором. Однако детекция такого высвобожденного радиоактивного фосфора велась ими "по конечной точке" и вообще вся процедура была не из простых. Тем не менее, эта, по сути, пионерная работа послужила еще одной отправной точкой для создания нового способа детекции при проведении ПЦР уже в реальном времени, когда стали регистрировать изменение флуоресценции реакционной смеси.
Несколько позже путем объединения этих идей экзонуклеазного расщепления гибридизационного зонда и изменения флуоресценции реакционной смеси появилась ник-трансляционная ПЦР [Lee et al., 1993] и 5 -нуклеазная ПЦР [Livak et al., 1995], где Taq полимераза, благодаря своей 5 —»3 -экзонуклеазной активности, отщепляла от гибридизационного зонда азотистые основания, несущие уже не радиоактивную метку, а флуорохромы, детектировать которые стало возможным по существу в реальном времени в специально сконструированном приборе. Главная особенность такого гибридизационного зонда заключается в том, что он содержит в своем составе или два флуоресцентных красителя с перекрывающимися спектрами испускания и возбуждения, обеспечивая так называемое темновое гашение со сниженным уровнем флуоресценции, которая резко увеличивается при экзонуклеазном разрушении пробы и как следствие пространственном или точнее физическом разобщении флуорохромов. Другой вариант рассчитан на использование системы - краситель / универсальный гаситель, где последний полученную им световую энергию диссипирует в виде тепла.
Самоподдерживающая репликация
Прообразом самоподдерживающейся репликации был метод, названный TAS (Transcription-based Amplification System), где использовались всего два фермента - обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц и РНК полимераза фага Т7 [Kwoh et al., 1989]. Схема протекания реакции была такова. После отжига на РНК одного из праймеров ревертаза строила по ней цепь ДНК и за счет имеющейся у этого фермента РНКазной Н активности происходило разрушение цепи РНК в гетеродуплексе ДНК/РНК, с высвобождением вновь построенной цепи ДНК для отжига на ней второго праймера. Благодаря тому, что один или оба праймера несли на 5 -конце дополнительный участок промотора фага Т7, после того, как он в ходе амплификации становился двуцепочечным, начинала работать Т7 РНК полимераза и происходила наработка новых множественных антисенс РНК-копий ампликонов, которые в свою очередь становились матрицами для обратной транскрипции. Поскольку реакция протекала при постоянной температуре (обычно около 42С), то денатурации и вовлечения молекул ДІЖ в амплификацию не происходило. С целью повышения эффективности этой реакции теми же авторами год спустя была опубликована статья, в которой они сообщали о добавлении третьего фермента - РНКазы Н, которая ускоряла высвобождение одноцепочечных молекул ДНК из гетеродуплексов ДНК/РНК [Guatelli et al., 1990]. Новый метод был назван ими 3SR (Self-Sustained Sequence Replication). В 1991 г. была опубликована статья, где абсолютно аналогичный метод был назван NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), что стало даже более популярным его названием [Compton, 1991].
Однако при использовании данного метода для количественной оценки транскрипционной активности отдельных генов или для диагностики в условиях повышенной безопасности в виде не открывания пробирок необходим был его перевод в режим реального времени, и если для ПЦР вариантов регистрации изменения флуоресценции в реальном времени существует большое количество (см. раздел 1.2 и таб. 1.2.1), то для 3SR таких способов предложено только два [Leone et al., 1998; Ishiguro et al., 2003]. Причем сами авторы одного из них [Leone et al., 1998] отмечают серьезные ограничения такого подхода, поскольку гибридизационная проба в виде молекулярного сигнального огня конкурирует за транскрипты РНК, выключая их тем самым из дальнейшей амплификации, что особенно чревато в ходе первых циклов. Тем не менее, данный метод все же применяется, и на его основе существуют коммерческие наборы для детекции различных видов патогенных микроорганизмов [Keightley et al., 2005; Patterson et al., 2006; Costa et al., 2008; van der Meide et al., 2008]. В варианте данного метода, предложенного японскими авторами [Ishiguro et al., 2003], рост флуоресценции обеспечивается интеркаляцией красителя оксазолового желтого в двуцепочечную структуру, отчего сам метод получил название INAF - INtercalation Activating Fluorescence.
Предложенная в самом начале 90-х гг. прошлого столетия [Duck et al., 1990] технология циклирующей пробы (ТЦП), основанная на уникальном свойстве РНКазы Н разрушать гетеродуплексы РНК/ДНК, не затрагивая при этом ни одноцепочечные нуклеиновые кислоты, ни двуцепочечные структуры РНК/РНК или ДНК/ДНК, к сожалению, пока не получила должного развития. И это тем более удивительно, поскольку ТЦП позволяет заметно повышать чувствительность экспериментов по молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, так как исходное количество ДНК-мишени, оставаясь неизменным, обеспечивает практически неограниченную возможность отжигаться на ней все новым химерным ДНК-РНК-ДНК олигонуклеотидным зондам, представленным в реакционной смеси в большом избытке. При этом формируется гетеродуплекс РНК/ДНК, РНК цепь которого разрушается РНКазой Н, освобождая место на ДНК-мишени для таких же новых зондов и обеспечивая тем самым желаемую цикличность процесса. Причиной ограниченного применения ТЦП послужило то, что изначально предложенный метод и его дальнейшие модификации были рассчитаны на довольно трудоемкую детекцию по размеру радиоактивных фрагментов такой разрушенной под действием РНКазы Н пробы, имеющих меньшую длину, чем исходная химерная молекула [Duck et al., 1990; Bekkaoui et al., 1996].
Предложенные позже варианты с колориметрической детекцией продуктов реакции [Fong et al., 1999] позволили отойти от использования радиоактивности, но при этом заметно усложнили сам метод, увеличив количество этапов и ингредиентов. Применение флуоресценции для мечения химерной ДНК-РНК-ДНК пробы дало возможность использовать для детекции высокочувствительный капиллярный гель-электрофорез [Laing et al., 2004], однако ввиду того, что РНКазаН производит разрушение РНК/ДНК гетеродуплекса не в строго определенном месте, то разделению подвергаются гетерогенные молекулы, что сразу заметно ухудшает чувствительность метода, поскольку флуоресцентные сигналы при их детекции оказываются распределенными между разными по размеру фрагментами.
Мечение химерной ДЬЖ-РНК-ДНК пробы уже двумя флуоресцентными красителями, расположенными на небольшом расстоянии друг от друга, позволяющем одному из них выступать гасителем, позволило перевести ТЦП в наиболее передовой для целей диагностики формат реального времени и осуществлять детекцию протекания реакции в ДНК амплификаторе с оптическим модулем [Harvey et al., 2004]. Здесь необходимо отметить, что все упомянутые выше варианты метода ТЦП были рассчитаны на применение линейных гибридных проб и лишь в одной работе были сконструированы шпилечные структуры, в которых петля полностью или частично представляла собой рибоолигонуклеотид, а стержневые участки были представлены в виде ДНК и несли на своих 5 - и З -концах краситель и гаситель соответственно [Efimov et al., 2002], однако авторы ограничились лишь детекцией накопления сигнала с помощью фотодокументационной системы.
Гибридизационная цепная реакция в реальном времени
Гибридизационная цепная реакция в реальном времени ГЦР-РВ проводили изотермически в 30 мкл раствора lxSSC (0.015 М цитрата натрия + 0.15 М хлористого натрия) при температурах от 25 до 45С в ДНК амплификаторе модели iCycler iQ. Олигонуклеотиды, представляющие собой первую и вторую шпильки, предварительно смешивались в lxSSC. Затем к ним добавлялась соответствующая инициаторная молекула ДНК или РНК, запускающая процесс самосборки, или прочие нуклеиновые кислоты, влияние которых предстояло исследовать. После этого пробирки быстро переносились в реакционный блок ДНК амплификатора, который для экспериментов с временным гашением свечения флуорохрома в ряде случаев специально предварительно охлаждался до 4С. При этом все операции по смешиванию также проводили при 0С. При проведении ГЦР-РВ, основанной на FRET-эффекте, смешивание проводилось при комнатной температуре, а пробирки помещались в предварительно нагретый до температуры денатурации цепей ДНК реакционный блок. Регистрация увеличения флуоресценции в обоих случаях велась в течение 30-60 мин через равные (в отдельно взятом эксперименте) интервалы времени, составляющие от 8 до 30 сек. ПЦР "по конечной точке" проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер (40 мМ Трис-HCl рН 8.0, 2.5 мМ MgCl2, 25 мМ КС1), 20 фмоль ДНК, 1 ед. акт. Taq ДНК полимеразы, по 5 пмоль каждого из 2-х праймеров и по 0,25 мМ каждого из дНТФ. ПЦР проводили в ДНК амплификаторе модели Терцик (ДНК-Технология, Россия) при следующих условиях: денатурация двуцепочечной ДНК в первом цикле велась при 94С в течение 2 мин, затем следовал отжиг праймеров и их удлинение при температурах от 45 до 60С (15-30 сек), денатурация - от 75 до 94С (30 сек). Количество циклов варьировало от 25 до 40. Температура отжига праймеров менялась в разных экспериментах в зависимости от нуклеотидных последовательностей используемых праймеров. ПЦР в реальном времени на платформе "УФА" проводили в 25 мкл реакционной смеси содержащей: буфер (40 мМ Трис-HCl рН8.0, 2.5 мМ MgCb, 25 мМ КС1); 20 фмоль ДНК; 1 ед. акт. Taq ДНК полимеразы; по 0.5 пмоль прямого и обратного праймеров, меченных разными флуорохромами (донором и акцептором), по 0,25 мМ каждого из дНТФ и соответствующее количество дистиллированной воды. ПЦР-РВ проводили в ДНК амплификаторах моделей iCycler iQ (Bio-Rad, США) и АНК-32 (ИАП РАН / ЗАО Синтол, Россия) при следующих условиях: денатурация двуцепочечной ДНК в первом цикле велась при 94С в течение 30 сек, затем следовал отжиг праймеров и их удлинение -40 - 50С, 10 сек с регистрацией флуоресценции в конце этой стадии, денатурация целевого продукта - 70 - 80С, 10 сек, Количество циклов варьировало от 25 до 40. Температура отжига праймеров, а также температура плавления целевых продуктов варьировала в разных экспериментах в зависимости от GC-состава используемых олигонуклеотидов. Для регистрации FRET-эффекта при использовании модели ДНК-амплификатора iCycler iQ требовалась ручная перестановка фильтров эмиссии (вместо фильтра эмиссии для красителя FAM ставился аналогичный фильтр для красителя ROX, на место которого в свою очередь ставилась специальная заглушка. В модели АНК-32 регистрация FRET-эффекта выставлялась программно. Проведение ПЦР-РВ с применением рестрикционной эндонуклеазы ТпЛ отличалось от такового на платформе "УФА" лишь использованием по-другому меченных праймеров и присутствием в реакционной смеси самого этого фермента в количестве 5 ед.акт. на образец (на 25 мкл). транскрипционной цепной реакции в реальном времени (ТЦР-РВ) осуществляли в ДНК-амплификаторе iCycler iQ. Образцы объемом 30 мкл каждый содержали буфер для Т7 РНК полимеразы (40тМ Трис-НС1 (рН 8.0), 8mM MgCl2, ЮтМ ДТТ, 2тМ спермидин), РНК матрицу, 1 ед. акт. Т7 РНК полимеразы, 0.5 ед. акт. обратной транскриптазы M-MuLV, 0.01 ед.акт. РНКазы Н, по 4 пмоля праймеров, 4мМ dNTP и 4мМ rNTP. Реакционная смесь готовилась при 4 С, а затем помещалась в амплификатор и выдерживалась при температуре 37С в течение 30 - 120 мин, в которые укладывались от 40 до 360 условных циклов, в каждом из которых снимались показатели интенсивности свечения флуоресцентного красителя-акцептора после переноса на него резонансной флуоресцентной энергии красителя-донора после возбуждения последнего.
Для проведения рамификации также необходимо получение кольцевой одноцепочечной матрицы. Превращение в "О-кольцо" линейной "С-пробы" осуществляли аналогично путем лигирования концов последней (олигонуклеотида HN84) на синтетическом олигонуклеотиде wHhmgtn, имитирующем природную последовательность ДНК вируса птичьего гриппа. Для этого фосфорилированный олигонуклеотид HN84, несущий в своем составе места для отжига праймера 1 и копию праймера 2, отжигали с олигонуклеотидом wHhmgtn, служащим для сближения концов "С-пробы" и после добавления Т4 ДНК лигазы (5 ед. акт.) вьщерживали при 12С в течение 1 час. В другом варианте рамификации при изучении мРНК гена CBF капусты использовали олигонуклеотид CBFTpp, который лигировали на природной мРНК капусты.
Рамификацию вели в режиме реального времени в ДНК-амплификаторе iCycler iQ. Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала буфер для ДНК полимеразы Bst ехо" (20 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgS04, 10 мМ КС1, 10 мМ (NH4)2S04, 0.1% Triton Х-100), 1 ед. акт. ДНК полимеразы, по 5 пмоль праймеров HVllcFAM и HV31cROX, меченных соответственно донорным и акцепторным красителями, и отжигающимися встык по принципу "УФА"; по 0,25 мМ каждого дНТФ, 1 мкл раствора приготовленной кольцевой ДНК-матрицы. Регистрация изменения флуоресценции раствора, возникающей благодаря FRET-эффекту, велась через равные промежутки времени, варьирующие в разных экспериментах от 10 до 30 сек.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Несмотря на огромное количество всевозможных вариантов ПЦР-РВ, рассмотренных нами в соответствующем разделе литературного обзора, все они принципиально отличаются от разработанного нами как расположением праймеров, так и их мечением. Считается, что в ПЦР праймеры должны отстоять друг от друга на некотором расстоянии и, пожалуй, главной причиной этого служит некий стереотип мышления. Действительно, одно из главных предназначений ПЦР - это давать новую информацию, заключенную между праймерами, да и для ДНК-диагностики по конечной точке детектировать электрофорезом продукты ПЦР размером около 300 - 500 пн в агарозном геле (а не более мелкие в полиакриламидном) было гораздо удобнее. Но ПЦР в реальном времени является по существу самостоятельным методом, предназначенным лишь для выявления или количественной оценки тех или иных последовательностей ДНК или РНК, и размер ампликонов в нем может и даже, более того, должен быть небольшим. И такими они, надо признать, уже стали. Так, во многих высокоспецифичных вариантах размер амплифицируемого фрагмента ДНК укорочен до 70 - 80 пн, 40 - 50 пн из которых приходятся на места отжига праймеров, а остальная последовательность с двух-трех нуклеотидными брешами между праймерами и гибридизационным зондом приходится на эту самую срединную часть в вариантах TaqMan или Molecular Beacon, например. Однако и в менее специфичных вариантах без применения гибридизационных зондов их авторам не удалось уйти от этого стереотипа, и размеры ампликонов остаются по-прежнему довольно большими. Наиболее короткие продукты ПЦР-РВ размером от 46 до 70 пн упоминаются в работах по низкоспецифичной амплификации ДНК в присутствии нового красителя LCGreen с последующим плавлением ампликонов, поскольку длина фрагментов ДНК в этом методе весьма критична [Liew et al., 2004].
В плане укорочения продуктов ПЦР-РВ мы, можно сказать, пошли дальше всех и в нашем варианте праймеры встык (или иногда почти встык с небольшим "зазором", что зависит от особенностей нуклеотидных последовательностей в конкретном выбранном месте) прилегают друг к другу, приводя к наработке ампликонов размером всего 40 - 50 пн (рис.3.2.1).
Подбор олигонуклеотидных праймеров велся нами с таким расчетом, чтобы они обеспечивали специфичность реакции и ограничивали собой фрагмент нуклеотидной последовательности РНК (или ДНК) размером 35 -50, соответственно, нуклеотидов или пар нуклеотидов. При подборе праймеров во внимание принимались следующие обстоятельства - чтобы в процессе синтеза олигонуклеотидных праймеров (или постсинтетически) последние могли быть помечены так называемыми внутренними метками, представляющими собой соответствующие флуоресцентные красители и гасители, характеризующиеся подходящими длинами волн возбуждения и испускания и, таким образом, представляющими собой или пару донор/акцептор, или пару краситель/гаситель. Причем в результате амплификации расположение красителей друг от друга в целевом двуцепочечном продукте должно оказываться на таком расстоянии, где перенос флуоресцентной резонансной энергии или гашение одного из флуорохромов эффективно происходят.
Праймеры на отрицательно-положительный контроль подбирались нами с таким расчетом, чтобы расстояние между красителем-донором и красителем-акцептором не позволяло бы осуществиться переносу флуоресцентной резонансной энергии, но при этом соответствующий ПЦР-продукт в обоих случаях нарабатывался бы. Из схемы протекания ПЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии между донорным и акцепторным красителями, входящими в состав прямого и обратного праймеров (или наоборот, что не имеет никакого значения), представленной на рис. 3.2.2 видно, что относительно далеко расположенный праймер с донорным красителем не способен передать флуоресцентную резонансную энергию на краситель-акцептор, входящий в состав второго праимера, тогда как праймеры, отжигающиеся встык, образуют между данными красителями расстояние, достаточное для проявления FRET-эффекта. Подход к проведению ПЦР-РВ с таким расположением внутренне меченных соответствующими флуорохромами прямого и обратного праймеров был назван нами сокращенно "УФА", что означает "Универсальная Флуоресцентная Амплификация". Причем и в англоязычном варианте название метода остается таким же - "UFA" - "Universal Fluorescent Amplification". И здесь помимо игры слов, заключающейся в том, что название города, где этот метод был разработан - Уфа - полностью ему созвучно, абсолютно справедливым выглядит утверждение, что такой способ детекции флуоресценции, возникающей благодаря FRET-эффекту между праймерами, универсален. Подтверждение тому будет исходить из сделанного ниже описания других разработанных нами в рамках данной работы методов.
Электрофоретический контроль продуктов ПЦР-РВ проводился с целью визуального обнаружения целевых продуктов, коими являлись ампликоны, ограниченные праймерами 1 и 2, а также 3 и 2. Как можно видеть из рис. 3.2.5, основной целевой продукт, регистрируемый в ходе ПЦР-РВ, имеет ожидаемый размер в 42 пн, тогда как отрицательно-положительный контроль в виде полосы размером ПО пн не показывал изменения сигнала флуоресценции во время ПЦР-РВ, но при окрашивании бромистым этидием хорошо заметен. Ввиду присутствия двух флуорохромов в составе ампликонов, их электрофоретическая подвижность несколько меньше, чем для немодифицированных фрагментов ДНК, что видно из сопоставления фрагментов близкого размера в виде маркерной ДНК.
Ввиду того, что не все ДНК амплификаторы с оптическим модулем рассчитаны на детекцию FRET-эффекта нами был разработан вариант с гашением флуоресценции красителя, входящего в состав одного из праймеров, соответствующим гасителем, находящимся в составе другого праймера. Этот второй вариант ПЦР-РВ с праймерами, меченными в одном случае красителем, а в другом - гасителем, проводился аналогично. В качестве контроля проводили ПЦР без добавления исследуемой ДНК (или кДНК), а также с добавлением ДНК, не содержащей участка, комплементарного используемым олигонуклеотидам.
