Введение к работе
- З -
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. При разработке биотехнологических процес-. . сов получения различных биологически активных веществ большое внимание уделяется работе со штаммами. Разработаны специальные требования к штаммам-продуцентам, такие как высокая продуктивность и скорость роста, фаго- и вирусоустойчивость, устойчивость к повышенным температурам и кислотности среды, стабильность наследования ценных признаков, способность усваивать дешеЕые и доступные субстраты и продуцировать измененный состав . компонентов биологически активных веществ. Для этих целей используют-различные методы селекции, клеточной и генной инженерии.
Одной из ватлых проблем при работе с микроорганизмами - продуцентами биологически активных веществ является сохранение их биосинтетической активности и жизнеспособности. Эти свойства могут быть обусловлены различными факторами. В частности, в некоторых случаях для грибов это может быть связало с вирусной инфекцией. Роль вирусов при этом может быть' весьма разнообразной: от воздействия на активность и снижения жизнеспособности, вплоть до гибели штаммов. Проблема своевременного обнаружения вирусной инфекции затруднена тем, что миковирусы в большинстве случаев осуществляют латентную инфекцию и не вызывают цитопа-тического действия на своих хозяевах.
Одним из новых высокоэффективных регуляторов роста растений сиро-кого спектра действия является фузикокцин (ФК) - метаболит фитшато--генного гриба Fusicoccum amygdali Del. (Класс Deuteromycetes, порядок Sphaeropsidales). В 1У86 году ФК А был обнаружен в _ высших растениях (Муромцев,1980;Муромцев и др.,1387).Низкая концентрация ФК в растениях хорошо коррелирует'с высоким уровнем его физиологической активности, которая на 1-2 по рядка выше, чем у известных фитогормонов (гибберел-лина, ауксина, цитокинина). Присутствие ФК А непосредственно в расте-
. 4 -ниях, а также гормональный характер физиологической активности позволили отнести ФК А к фитогормонам. Фузикокцин, получаемый путем микробного синтеза, .в настоящее время активно используется в растениеводстве и научно-исследовательсішх целях как препарат мембранного уровня действия. Потребность в этом веществе возрастает, что обусловливает необходимость разработки высоко эффективных биотехнологических процессов его получения. Штамм-продуцент фузикокцина аконидиальныи. В процессе культивирования меняются исходные свойства штамма: морфология, стабильность, активность. Работа с такими продуцентами, в связи с этим, затруднена и требует разработки специальных методов селекции, поддерживающих культуру. В популяции штамма-продуцента отмечены случаи появления лизисных культур. В связи с этим целесообразно проводить проверку штаммов-продуцентов на присутствие лизогенных факторов, однако такие исследования для F.amygdali ранее не проводились.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось выявление
вирусной -инфекции в культуре гриба F.amygdali и установление ее влияния на микробный синтез фузикокцина. В задачи исследования входили:
-
Анализ культурально-мррфологических признаков штамма F4 F.amygdali и выявление признаков вирусной инфекции гриба.
-
Разработка экспресс-метода выявления вирусной инфекции в культуре F.amygdali с использованием УФ-облучения. Изучение влияния УФ-об-лучения на культуру гриба и на проявление вирусной инфекции.
-
Разработка методов выделения и очистки вирусных частиц (ВЧ) из мицелия F.amygdali; анектронномикроскопический анализ мицелия и ВЧ, установление морфологии и типа нуклеиновой кислоты ВЧ F.amygdali.
-
Установление влияния вирусной инфекции .на образование фузикокцина.
5. Разработка способов оздоровления штамма-продуцента, фузикокци
на, пораженного вирусной инфекцией с применением физических, химичес
ких и биотехнологических методов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые для продуцента фузикокцина F.amygdali показано присутствие ВЧ в мицелии гриба. Установлено отрицательное влияние ВЧ на уровень фузикокцин-синтезирующей активности продуцента и его культурально-морфологические свойства.
Разработал способ выделения и очистки ВЧ из . мицелия F.amygdali, показана морфология, установлен тип нуклеиновой кислоты ВЧ. Впервые проведено электронномикроскопическое изучение ВЧ и мицелия штамма-продуцента фузикокцина, содержащего ВЧ и свободного от них.
Изучено влияние УФ-облучения на культуру гриба, показано стимулирующее влияние ультрафиолетового света на развитие вирусной инфекции.
Показаны возможные пути инактивации ВЧ или освобождения культуры гриба от вирусной инфекции: ингибирование ВЧ под действием термической 'обработки мицелия, выращивание гриба на средах, содержащих этидий бро^ мид, использование протопластных культур.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты позволили выявить
характерные особенности продуцента фузикокцина, его изменчивость, подверженность вирусной инфекции.
Разработан метод выделения и очистки ВЧ из культуры гриба-продуцента фузикокцина. Установлен морфологический тип, размер и нуклеиновый состав ВЧ F.amygdali.
Предложены приемы освобождения культуры гриба сг вирусной инфекции, позволяющие сохранить для производства высокоэффективные штаммы продуцента фугикокшша-.В ісачестве экспресс-метода обнаружения вирусной инфекции в культуре F.aTiygdali предложено использовать УФ-облучение. ,
- 6 -
АПРОБАПИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы докладывались: на за
седании лаборатории прикладной микологии ВНИИСБ
(Москва, 1993), на .заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологиче
ского факультета МГУ (Москва, 1990,1995), на конференции "Физиология и
биохимия мицелиальных грибов в связи с проблемами биотехнологии"
(Москва, 1994). ' "\
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 2 печатные работы.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, описания объекта, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 16 таблиц, 25 рисунков. Список цитируемой литературы включает 125 наименований, из которых 67 на иностранных языках.
