Содержание к диссертации
Введение 4
Глава I. Обзор литературы 6
Историческая справка 6
Таксономическое положение G.lucidum 7
Морфологическое описание G.lucidum 8
Биология G.lucidum 9
Методы и условия культивирования 9
Выращивание на плотных средах 10
Получение плодовых тел 11
Погруженное культивирование 15
Химическая природа биологически активных компонентов G.lucidum 21
Методы выделения и химической очистки биологически активных полисахаридов G.lucidum 23
8. Биологическое действие G.lucidum 23
Противоопухолевое и иммуностимулирующее действие 24
Противовирусное действие 27
Антибиотическое действие 28
Противовоспалительное и противоаллергенное действие 28
Гиполипидемическое действие 29
Гипогликемическое действие 30
Действие на сердечно-сосудистую систему 31
Противотромбозное действие 32
Гепатопротекторное действие, стимуляция функции печени 32
Действие на дыхательную систему 33
Регуляция нервной системы 33
Другие эффекты 33
9. Препараты из G.lucidum 34
Глава И. Материалы и методы 36
Объекты исследования 36
Хранение культур G.lucidum 37
Культивирование на плотных средах 37
Морфология штаммов G.lucidum 38
Погруженное культивирование G.lucidum 38
Оптимизация состава среды для погруженного культивирования G.lucidum 40
Получение плодовых тел 40
Изучение антибиотического действия штаммов G.lucidum 41
Получение водных экстрактов и их фракций из мицелия и плодовых тел G.lucidum 41
Определение содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия и плодовых тел 42
Определение моносахаридного состава полисахаридных фракций 43
12. Изучение противоопухолевых свойств G.lucidum 43
Глава III. Результаты и обсуждение 46
1. Изучение роста штаммов G.lucidum на плотных средах 46
Морфология колоний 46
Пищевые потребности штаммов G.lucidum 55
Скорость роста штаммов на различных плотных средах 56
Скорость роста штаммов на плотных средах при разных температурных режимах 58
2. Изучение процесса погруженного культивирования штаммов G.lucidum 60
Пищевые потребности штаммов G.lucidum 60
Накопление биомассы штаммов G.lucidum в процессе погруженного культивирования 63
Изучение микроморфологии штаммов G.lucidum 66
Определение содержания водорастворимых полисахаридов в мицелии и плодовых телах G.lucidum 68
Изучение антибиотического действия штаммов G.lucidum 69
Разработка метода погруженного культивирования 72
Уровень рН среды 72
Температурный режим 73
Аэрация 73
Оптимизация количественного состава питательной среды
методами математического планирования эксперимента 74
7. Получение плодовых тел штамма 5 G.lucidum 84
8. Изучение противоопухолевых свойств G.lucidum 86
Выводы 97
Список литературы 99
ение 11
Введение к работе
В последние десятилетия ведутся активные поиски биологически активных веществ природного происхождения. Внимание исследователей в первую очередь привлекают к себе природные объекты, которые использовались в качестве лекарственных средств в народной медицине. Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst. - трутовик лакированный, один из известных базидиальных грибов, используемый в лечебных целях с давнего времени. Его применяли при разнообразных заболеваниях, в том числе бронхиальной астме, неврастении, гастрите, болезнях печени. Интенсивные исследования G. lucidum в течение последних десятилетий привели к вьщелению биологически активных метаболитов, прежде всего полисахаридов и тритерпенов, оказывающих иммуностимулирующее, противоопухолевое, гиполипидемическое, гипогликемическое, гепатопротекторное, противовирусное, противовоспалительное действие (Sone et al., 1985; Hikino&Mizuno, 1989; Jong&Birmingham, 1992; Mizuno 1993; Hobbs, 1995; Mizuno et al., 1995a,b,c; Stavinoha et al., 1995; Wasser&Weis, 1997; Gao et al., 2002,2004a,b,c; Lin & Zhang, 2004).
Большинство работ по поиску и выделению биологически активных веществ из G. lucidum проведено с использованием плодовых тел, зачастую дикорастущих (Miyazaki&Nishijima, 1981; Hikino et al., 1985,1989; Hirotani et al., 1985; Morigiwa, 1986; Lin&Tome, 1991; Hattori, 1997; Wang et al., 1997; El-Mekkawy et al., 1998; Cao&Lin, 2004; Berger et al., 2004). В результате разработаны многочисленные запатентованные формулы биологически активных добавок, чаев и тонизирующих напитков на основе плодовых тел гриба. Известен один лекарственный препарат китайского происхождения (SunRecome, Green Valley Holding Company, Ltd., Шанхай, Китай), получаемый из выращенных по экстенсивной технологии плодовых тел G. lucidum.
Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященный G. lucidum, чрезвычайно велик, в нем очень мало работ по исследованию биологической активности вегетативного мицелия, по изучению закономерностей роста G. lucidum в погруженной культуре. В то же время, очевидно, что использование погруженного мицелия для получения биологически активных метаболитов может облегчить дальнейшую стандартизацию материала и обеспечить воспроизводимость биологических эффектов. Однако, описанные в литературе способы погруженного культивирования не могут служить основой рентабельных производств из-за своей длительности, составляющей 12 - 16 суток (Fang et al., 2002; Fang&Zhong, 2002a,b,c; Lomberh et al., 2002; Tang&Zhong 2002a,b, 2003). Кроме того, существует огромный разрыв между изучением биологической активности G. lucidum и исследованиями штаммового разнообразия. Практически не изучены морфологические, физиологические и биохимические особенности штаммов G, lucidum, необходимые для
выявления наиболее перспективных для практического использования штаммов. Недостаточно исследованы антибиотические свойства G. lucidum, которые должны быть обязательно проведены для всех продуктов, рекомендуемых для перорального введения.
В связи с этим важное значение имеет комплексное изучение штаммового разнообразия G. lucidum, создание эффективных способов погруженного культивирования и оценка биологической активности получаемого материала штаммов, в том числе противоопухолевых свойств и антибиотического действия.
Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении штаммового разнообразия G. lucidum на вегетативной (мицелиальной) стадии по морфолого-физиологическим признакам и антибиотическим свойствам, в изучении противоопухолевого действия экстрактов мицелия и их фракций.
В работе были поставлены следующие задачи:
Изучение морфолого-культуральных характеристик штаммов G. lucidum при росте на широком наборе плотных питательных сред и при различных температурных режимах.
Изучение пищевых потребностей штаммов G. lucidum при выращивании на плотных средах и в погруженной культуре.
Изучение процессов погруженного культивирования штаммов G. lucidum.
Изучение антибиотических свойств штаммов G. lucidum.
Отбор перспективного для получения биологически активной биомассы штамма G. lucidum.
Разработка способа погруженного культивирования отобранного штамма, включая оптимизацию состава ферментационной среды методами математического планирования.
Получение из мицелия и плодовых тел отобранного штамма G. lucidum экстрактов и их фракций с целью оценки их противоопухолевого действия в системе in vivo при различных способах введения.
