Содержание к диссертации
Введение 5
Обзор литературы ; 10
»
Вид Ganoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) P. Karst. 10
Систематическое положение 10
Медицинское применение 11
Методы культивирования G. lucidum 12
Морфологическое описание 14
Таксономия и номенклатура 14
Особенности вегетативной (мицелиальной) стадии штаммов G. lucidum 18
Генетический анализ внутривидовой структуры высших базидиомицетов_20
Вегетативная несовместимость 21
Половая несовместимость 24
Анализ ДНК-полиморфизма 28
Анализ изозимных спектров 31
Материалы и методы 36
Объкты исследования 36
Хранение культур 36
Исследование морфологии мицелиальной стадии штаммов G lucidum 38
Макро- и микроморфология
Сканирующая электронная микроскопия 38
Окраска ядерного аппарата 38
Исследование атипичных плодовых тел G. lucidum in vitro 38
Определение скорости роста 40
Культивирование 40
Получение споровых отпечатков 41
Анализ вегетативной несовместимости 42
Анализ половой несовместимости 42
Выделение монобазидиоспоровых тестерных штаммов и проведение
скрещиваний 42
RAPD-PCR анализ 44
Выделение ДНК 44
Условия амплификации 45
Изоферментный анализ 46
Кластерный анализ 48
Результаты и обсуждение 49
Исследование морфологии, условий роста вегетативной стадии
дикариотических природных изолятов G. lucidum и особенностей, связанных
с плодообразованием 49
Получение моноспоровых изолятов из хламидоспор 52
Анализ скорости роста и установление температурных оптимумов и
максимумов 53
Исследование атипичных плодовых тел 56
Культивирование 63
Вегетативная несовместимость изолятов G. lucidum 67
Репродуктивная изоляция 70
Молекулярный и биохимический анализ штаммов G. lucidum 75
Заключение 80
Выводы 82
Список литературы 83
Приложение 103
Введение к работе
Актуальность темы
Комплексный вид Ganoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) P. Karst. объединяет внутривидовые группы, филогенетическая концепция которых до сих пор не разработана (Moncalvo, 2000; Wasser et al., 2006).
Значительные трудности при описании штаммов данного вида гриба по морфологии и культуральным свойствам вызваны их высокой степенью вариабельности в зависимости от условий культивирования (Seo, Kirk, 2000). Представители данной группы грибов являются объектом пристального внимания многих исследователей. Прежде всего, это связано с поиском биологически активных веществ, нашедших широкое применение в медицине и фармакологии. Ganoderma lucidum — безусловный лидер среди целебных грибов Востока. В Китае тысячи лет его эффективно используют для лечения различных заболеваний (Stamets, 1993; Chang, Miles, 2004; Wasser et al., 2006). В нашей стране также предпринимаются попытки создания биологически активных добавок на основе базидиом и мицелия, полученного методом погруженного культивирования (Краснопольская с соавт., 2003; Автономова, 2006).
Использование агарикоидных базидиомицетов в масштабах промышленного культивирования подразумевает строгий биологический контроль материала. Однако многие авторы отмечают, что большой процент штаммов, применяемых в народной медицине стран Азии и Востока и описанных как G. lucidum, ошибочно относят к данному виду, а характеристика изолятов, ограниченная лишь описанием морфологии базидиом и вегетативной стадии, недостаточна и зачастую не может быть удовлетворительной (Hseu et al., 1996; Buchanan, 2001).
Высокая гетерогенность комплексного вида G. lucidum была подтверждена и современными молекулярными методами (Moncalvo et al, 1995; Hseu et al.,
1996; Buchanan, 2001). Молекулярно-филогенетический анализ американских, азиатских и европейских коллекций G. lucidum с использованием маркеров рДНК позволил выделить несколько внутривидовых групп (G. lucidum sensu stricto, G. resinaceum complex sensu lato, G. curtisii complex, G. tropicum complex sensu lato) (Moncalvo, 2000). Однако отсутствие корреляции между филогенией по рДНК и разделением комплекса G. lucidum по морфологическим признакам вынуждает продолжать поиск, молекулярных маркеров, способных стать исчерпывающим критерием при описании штаммов.
Цель работы
Исследовать штаммы комплексного вида Ganoderma lucidum с использованием различных подходов и выявить признаки, значимые для характеристики внутривидовых групп.
Задачи:
Изучить морфологию вегетативной стадии штаммов G. lucidum (макро-и микроморфологию мицелия).
Исследовать способность штаммов G. lucidum к плодоношению в искусственных условиях.
Провести анализ вегетативной несовместимости и репродуктивной изоляции штаммов G. lucidum.
Изучить изоферментный и RAPD-полиморфизм штаммов G. lucidum.
Оценить значимость использованных методов для характеристики внутривидовых групп G. lucidum.
Научная новизна
Впервые проведен детальный сравнительный анализ внутривидового
разнообразия штаммов G. lucidum различного географического
происхождения на основе морфологических, генетических, биохимических и
молекулярных признаков.
Показано, что культурально-морфологические признаки штаммов G.
lucidum, относящихся к различным интерстерильным группам, несмотря на
репродуктивный барьер, четко не дифференцированы.
Использованный в RAPD-анализе набор праймеров подтвердил
правомочность выделения интерстерильных групп внутри вида G. lucidum. С
помощью RAPD-маркеров впервые был выявлен ДНК-фрагмент,
специфичный для вида G. lucidum.
Показано, что модификация субстрата для культивирования G. lucidum
путем добавления дрожжевого экстракта оказывает стимулирующее влияние
на плодообразование.
Практическая значимость
Полученные в настоящем исследовании результаты важны для понимания внутривидовой структуры комплексного вида G. lucidum. Поскольку использованные в данной работе штаммы G. lucidum обладают противоопухолевой и антибактериальной активностью (Краснопольская с соавт., 2003; Автономова, 2006), выяснение внутривидового статуса данных штаммов G. lucidum не только обеспечит возможность сравнения с другими известными штаммами, но и позволит описать новые источники биологически активных веществ.
Обнаружена и исследована способность некоторых штаммов к образованию атипичных плодовых тел, формирующих жизнеспособные базидиоспоры. Поскольку культивирование базидиом данного ксилотрофного базидиомицета - длительный и трудоемкий процесс, получение
генетического материала непосредственно на чашках Петри имеет немаловажное прикладное значение.
Предложен состав субстрата, позволяющий сократить сроки плодообразования, что имеет большое значение для разработки методов культивирования базидиом штаммов G. lucidum.
Апробация работы
Результаты исследований были доложены на конференциях: конференция, посвященная 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В.Ломоносова (Москва, 2004); Юбилейная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения М.В. Горленко (Москва, 2008); «Современная микология в России» Второй съезд микологов России (Москва, 2008); на заседаниях кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В.Ломоносова.
Публикация результатов работы
По теме диссертации опубликовано семь работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК.
Место проведения работы
Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Благодарности автора
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю к. б. н. Инсаровой И. Д. за внимание и общее руководство работой. Сотрудникам кафедры микологии и альгологии к. б. н. Сколотневой Е. С. за помощь, оказанную при проведении RAPD-анализа, н. с. Завьяловой Л. А. и д.б.н. Камзолкиной О. В. за помощь и советы в работе, Гололобовой М. А, Ворониной Е. Ю. Глубокая признательность всему коллективу кафедры микологии и альгологии за постоянную поддержку и внимание.
Обзор литературы
Вид Ganoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) P. Karst
Трутовик лакированный Ganoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) P. Karst. -ксилосапротроф, широко распространен по Земному шару и обитает на лиственных, и реже, на хвойных породах и однодольных растениях. Гриб привлекает внимание исследователей и практиков, работающих в разных областях. Это связано с рядом факторов. 1) G. lucidum вызывает белую, медленно развивающуюся гниль и поражает кокосовые, масличные и арековые пальмы, чай, кофе, какао, ценные породы хвойных, лиственных и декоративных деревьев, что в свою очередь, приводит к большим потерям урожаев (Miller et al., 1999). 2) В то же время грибы, способные к делигнификации древесины, имеют важное промышленное значение и используются при биообработке древесины (биологической отбелке) в бумажной индустрии и при утилизации промышленных отходов (полициклических ароматических углеводородов) (D'Souza et al., 1999). 3) Но основное значение данный гриб имеет в медицине и фармакологии. В странах Востока G. lucidum также известна как Рейши или Маннетаки (Япония), Линг Ши (Китай) - гриб долголетия, гриб десяти тысяч лет, трава духовной силы (Stamets, 1993; Бабаянц, Маслий, 2008). История применения трутовика лакированного насчитывает более 2000 лет, и в настоящее время его выращивают в промышленных масштабах во многих странах мира.
Систематическое положение
класс Basidiomycetes род Ganoderma
п/класс Homobasidiomycetidae вид Ganoderma lucidum (W.
Curtis:Fr.) P. Karst. порядок Polyporales
(Dictionary of the Fungi, 2001). семейство Ganodermataceae
Медицинское применение
Полисахариды, тритерпеноиды, стеролы, лектины и протеины - наиболее важные биологически активные вещества, получаемые из грибов. Плодовые тела G. lucidum пользуются наибольшей популярностью из всего семейства Ganodermataceae, т. к. считается, что лишь они обладают терапевтическим эффектом (Willard, 1990). Среди целебных грибов Востока данный гриб является безусловным лидером.
Более 90% работ, связанных с изучением грибов рода Ganoderma, посвящено исследованию биологически активных веществ базидиом, мицелия и спор штаммов G. lucidum. Описано около 400 различных химических веществ, принадлежащих к таким классам как: тритерпеноиды, полисахариды, стеролы, стероиды, жирные кислоты, протеины, пептиды и т. д., и т. п. (Mizuno et al., 1995; Kim, 1999; Roberts, 2004; Wasser et al., 2006).
Противоопухолевая активность обнаружена у многих видов базидиомицетов и в настоящее время большое количество работ по изучению G. lucidum посвящено поиску метаболитов, обладающих противоопухолевой и иммуностимулирующей активностями. Более 140 различных тритерпеноидов, обладающих такими активностями, описаны для G. lucidum (Min et al., 1998, 2001; Mizuno et al., 1995; Kim, 1999, Gao et al., 2002; Chang, Miles, 2004; Zhu et al., 1999, 2000; Hobbs, 1995; Mao et al.,1999; Zhang et al., 2000; Habijanic et al., 2001; Bao et al.,2001, 2002; Wang et al., 2002; Краснопольская, 1998).
Экстракты G. lucidum высоко эффективны при лечении гепатита В (Gao et al., 2003; Kim et al., 1999); значительно снижают уровень сахара в крови (Mizuno et al., 1995); нормализуют как артериальную гипертонию, так и гипотонию (Краснопольская, 1998; Lee et al., 1990, 2001; Morigiwa, 1986); подавляют агрегацию тромбоцитов (Sugiyama et al., 1992; Choi et al., 2000); проявляют высокую активность в отношении широкого круга
грамположительных и грамотрицателъных организмов, дрожжей и нитчатых грибов (Suay et al., 2000; Gao et al., 2003).
Тритерпены G. lucidum обладают адаптогенными (Бисько с соавт., 2004) и антиаллергическими свойствами (Khoda et al., 1985).
Метанольные экстракты плодовых тел действуют на вирусы ВИЧ и гепатита С (Mekkawy et al, 1998; Ео et al., 1999). Этанольные экстракты обладают высокой активностью в отношении вируса Herpes simplex (Ео et al., 1999; Kim et al., 2000; Oh et al., 2000).
Экстракты плодовых тел G. lucidum используют также при лечении: воспаления почек, артритов, неврастении, бессонницы, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, головокружений, прогрессирующей мышечной дистрофии и многих других заболеваний (Горовой, 2004). В фармакологии и медицине применяют как экстракты погруженного мицелия и базидиом, так и выделенные из них и из культуральной жидкости вещества.
Методы культивирования Ganoderma lucidum
Наиболее экономичным процессом, позволяющим относительно быстро получать большое количество биомассы и биологически активных веществ, является метод погруженного культивирования, позволяющий значительно интенсифицировать процесс культивирования за счет сокращения его длительности и увеличения выхода биомассы и целевых метаболитов (Краснопольская с соавт., 2003). Погруженное культивирование осуществляют либо в ферментерах (Бабицкая с соавт., 2004), либо в колбах с жидкой средой на ротационных качалках (Краснопольская с соавт., 2001). Но, тем не менее, как отмечалось выше, на сегодняшний день большинство работ по исследованию фармакологических свойств G. lucidum выполнено с использованием плодовых тел.
По литературным данным культивирование с целью получения плодовых тел проводят по экстенсивной или интенсивной технологии. В
лабораторных исследованиях для получения базидиом применяют последнюю.
При интенсивном методе культивирования субстратом служат опилки лиственных пород, наилучший результат обеспечивает использование дубовых опилок. Для повышения урожайности добавляют отруби зерновых культур - 5-15% от общей массы субстрата (Stamets, 1993). Субстратом обычно служит обогащенная опилочно-отрубевая смесь. Субстрат помещают в синтетическую емкость (герметичная упаковка) - это полипропиленовые и полиэтиленовые мешки с микропорами. Мешки запечатывают тепловым импульсом. Полипропиленовые мешки стерилизуют в автоклаве под давлением, полиэтиленовые мешки стерилизуют при более низких температурах. Иногда используют специальные пластиковые бутылки. В емкости допускают формирование 1-2 плодовых тел G. lucidum, удаляя часть образующихся примордиев для получения более крупных базидиом.
Культивационный режим по Стейметсу (Stamets, 1993)
Развитие плодовых тел:
Температура воздуха: 21-27С Относительная влажность: 90-95% Продолжительность: 60 дней Концентрация С02: менее 0,2 % Требуется подача свежего воздуха Освещение: 12 часов по 750-1500 lux
Зарастание субстрата мицелием:
Температура воздуха: 21-27С
Относительная влажность: 95-100%
Продолжительность: 10-20 дней
Концентрация СОг-' 5% и выше
Требуется подача свежего воздуха
Освещение: нет
Морфологическое описание
Ganoderma lucidum (W. Curtis:Fr.) P. Karst. Базидиомы однолетние, изредка 2-3-летние, полукруглые или почковидные, вееровидные, 3-8 х 10-25 х 2-3 см, с боковой, эксцентрической, реже центральной, довольно длинной ножкой, иногда консолевидные, прирастающие к субстрату боком - ножковидно вытянутым основанием шляпки. Поверхность шляпки и ножки покрыта сначала рыжеватой, затем рыжевато-пурпуровой, кроваво-красной до каштаново-бурой, с возрастом почти черной, блестящей, как бы лакированной, коркой. Край беловатый, желтоватый до рыжеватого, обычно острый, иногда волнистый. Гифальная система тримитическая, иногда димитическая. Базидии 10-14х 9-12 мкм. Споры желтоватые, яйцевидные, усеченные у вершины, 7-13 х 6-8 мкм, с гладким гиалиновым эписпорием и бородавчатым буроватым эндоспорием. Споровый порошок бледно-желтый. Встречается почти во всех странах света на пнях и на живых деревьях Acer, Alnus, Betula, Carpinus, Castanea, Fagus, Fraxinus, Juglans, Malus, Populus, Pyrus, Querciis, Picea и др. Широко распространен (Европа, кроме северных регионов, Азия, Северная Африка, Северная Америка, Южная Америка, Австралия). Растет с мая по ноябрь. Возможно, космополит (Ryvarden, Gilbertson, 1993).
Таксономия и номенклатура
История таксономии и номенклатуры грибов рода Ganoderma началась в конце XVIII века, когда британский ботаник Вильям Куртис впервые описал трутовик лакированный как Boletus lucidus (Curtis, 1781) (Adaskaveg, Gilbertson, 1986). E. Фриз в 1821 году описал данный гриб как Polyporus lucidus. В 1881 году финский исследователь Питер Карстен ввел самостоятельный род Ganoderma с единственным видом G. lucidum (переименованным из Polyporus lucidus). К 1889 году Н. Патуяр описал 48 новых видов рода Ganoderma, а Е. Боудер и Е. Фишер в 1894 году сообщили о двух лакированных образцах, растущих на Larix в Швейцарии. Найденные грибы были названы Ganoderma valesiacum (Buchanan, 2001).
В 1933 г. М. Донк впервые ввел внутри большого семейства Polyporaceae подсемейство Ganodermatoidae и поднял его до ранга семейства Ganodermataceae. Данная классификация была принята большинством исследователей. В 1981 г. было введено порядковое название Ganodermatales, которое было принято Д. Пеглером в восьмом издании Dictionary of the fungi (Seo, Kirk, 2000).
В Северной Америке «лакированными» полипоровыми занимался В. Мюррил. Автор описал виды умеренных климатических зон: G. tsugae. G. sessile, G. zonatum, G. sulcatum, G. oregonse, G. sequoia, G. nevadense и 10 тропических видов, а также включил в группу G. curtisii (Berk.) Murr. и G. polychromum (Copel.) Murr. За таксономические критерии В. Мюррил принял географическое происхождение, приуроченность к растению хозяину и макроморфологию плодовых тел. В дальнейшем виды, описанные В. Мюррилом, подвергались многочисленным ревизиям. В. Хаддоу и Р. Стеярт пытались объединить их по морфологии спор и микроморфологии базидиом. Л. Оверхольц считал важными характеристиками географическое происхождение, приуроченность к растению хозяину, макроморфологию плодовых тел и спор (Buchanan, 2001).
Сходство культуральных признаков G. lucidum, G. tsugae и G. oregonense, описанное в работах М. Нобле, Р. Стеярта, Р. Девидсона и В.Сталперса, Дж. Адаскавега и Р. Гилбертсона и др., привело к пересмотру видовых названий и появлению синонимов (Buchanan, 2001).
Описание многих новых видов основывалось на несущественных микроскопических вариациях и, в итоге, род Ganoderma пребывал в «таксономическом хаосе» (Seo, Kirk, 2000; Buchanan, 2001).
К 1994 году семейство Ganodermataceae включало пять родов: Amauroderma Murr., Haddowia Stey., Hamphreya Stey., Tomophagus Murr., Ganoderma Karst. Род Ganoderma состоял из подродов Ganoderma («лакированная»
поверхность шляпки - G. lucidum complex) и Elfvinga (Karst.) (поверхность шляпки матовая). В семейство Ganodermataceae входило около 386 видов (Buchanan, 2001).
Появление таких альтернативных методов исследования, как анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов rDNA (Miller et al., 1999; Gottlieb et al., 2000; Sun et al., 2006; Su et al., 2008), сиквенс ITS rDNA (Moncalvo et al, 1995; Hong et al., 2004; Utomo et al., 2005), анализ изозимных спектров (Gottlieb et al., 1998, 1999), RAPD - анализ (Dong et al., 1996; Hseu et al., 1996; Zakaria et al., 2005) немного облегчили понимание филогенетических связей видов, входящих в G. lucidum complex и помогли уточнить видовую принадлежность некоторых спорных изолятов.
Л. Риварден и Дж. Монкальво в 1997 проводят ревизию семейства Ganodermataceae, исключив синонимы, сомнительные и незаконные наименования, и оставляют 118 видов, относящихся к подроду Ganoderma и 30 видов к подроду Elfvinga (Buchanan, 2001).
Молекулярно-филогенетический анализ американских, азиатских и европейских коллекций G. lucidum с использованием маркеров рДНК, проведенный Дж. Монкальво с соавт, в 1995 году, позволил выделить G. lucidum complex sensu lato (Moncalvo et al, 1995; Moncalvo, 2000).
G. lucidum complex sensu lato включает 4 филогенетически взаимосвязанных группы:
1. G. lucidum sensu stricto: непосредственно вид G. lucidum и другие «лакированные» виды, ошибочно описанные как G. lucidum. Сюда относятся виды умеренных зон обоих полушарий, не образующие хламидоспоры в чистой культуре: G. lucidum, G. valesiacum, G. carnosum, G. ahmadii, G. tsugae, G. oregonense, G. oerstedii, G. praelongum. Базидиоспры шиповатые.
2. G. resinaceum complex sensu lato — Европейские виды, в культуре
присутствуют хламидоспоры, базидиоспоры гладкие.
3. G. curtisii complex. Хламидоспор нет, приурочены к восточной части
Северной Америки и Коста Рике, а также восточной Азии (Корея, Китай, Тайвань, Япония, Вьетнам). G. curtisii, G. meredithae.
4. G. tropicum complex sensu lato. Изоляты из тропических и
субтропических регионов. Хламидоспоры присутствуют. G. tropicum, G. septatum, G. fornicatum.
Также было установлено, что вид G. lucidum растет непосредственно в Европе. Австралийские виды и особенно виды стран Азии и Востока некорректно названы G. lucidum, и имеют свой индивидуальный «молекулярный статус» (Moncalvo et al., 2008).
Отсутствие корреляции между филогенией по изоферментному анализу, рДНК и разделением комплекса G. lucidum по морфологическим и культуральным признакам стимулирует поиск новых молекулярных маркеров, способных стать исчерпывающим инструментом при описании штаммов. Поскольку штаммы G. lucidum активно культивируются в медицинских целях, путаница в видовой принадлежности используемых изолятов недопустима.
Особенности вегетативной (мицелиальной) стадии штаммов
Ganoderma lucidum
Работы по подбору оптимальных сред для культивирования штаммов G. lucidum (Автономова, 2006) показали, что характер роста на агаризованном сусле позволяет с большей точностью, чем на других средах, выявить микроскопические особенности мицелия. Изучение микроморфологии выявило ряд стабильных морфологических особенностей исследованных видов.
Пряжки. Одним из наиболее важных признаков, характеризующих культуры высших базидиомицетов, является наличие уникальной структуры - пряжек, которые встречаются на мицелии многих представителей высших базидиомицетов. Пряжки обычно располагаются интеркалярно над клеточными перегородками гиф. Для вегетативной стадии штаммов G. lucidum пряжки являются характерной постоянно присутствующей структурой (Moncalvo, 2000; Seo, Kirk, 2000; Автономова, 2006).
Хламидоспоры. Анализ литературы показал, что многие исследователи называют "хламидоспорами" толстостенные клетки или соответствующие им многоклеточные образования (мелкие комплексы клеток, функционирующие как одно целое), служащие для перенесения неблагоприятных условий. Они переживают отмирание и разложение вегетативного таллома и пассивно высвобождаются в среду — в противоположность "конидиям", которые вскоре после своего формирования отделяются от материнской гифы или несущего их органа и служат для распространения (Мюллер, Леффлер, 1995).
Совокупность структур, описываемых различными авторами термином "хламидоспора", является одной из неопределенных категорий в микологии. Этимологически этот термин связан со спорами, имеющими утолщенные клеточные стенки, но среди главных диагностических признаков
хламидоспор выдвигались и другие критерии. Одним из таких критериев служит отсутствие специализированного механизма отделения хламидоспор, которые являются терминальными или интеркалярными покоящимися клетками и освобождаются в результате механического разрушения недифференцированных клеточных стенок (Решетников, 1991). Согласно другому определению, это - жизнеспособные бесполые дополнительные споры, образующиеся в результате структурной модификации вегетативного сегмента гифы, имеющие вторичную внутреннюю стенку, обычно импрегнированную гидрофобным материалом, и чья функция связана с переживанием, а не с расселением (Griffiths, 1974: цитир. по Решетникову, 1991).
В качестве диагностических признаков для определения хламидоспор предлагают использовать функциональные черты (покоящаяся, жизнеспособная), морфологические (толстостенная), онтогенетические, а также способ отделения (неопадающая). Использование такого широкого набора признаков обусловлено тем, что в разных группах грибов те или иные из перечисленных характеристик не соблюдаются (Решетников, 1991). Хламидоспоры известны практически во всех семействах афиллофороидных грибов. По способу образования они подразделяются на бластические и таллические. Таллические хламидоспоры численно преобладают по отношению не только к бластическим, но и ко всем остальным типам конидиальных структур. У некоторых видов грибов, наряду с таллическими хламидоспорами, образуются одиночные терминальные хламидоспоры. Цепочки чередующихся или не разъединенных таллических хламидоспор являются типичным видом спороношений у афиллофороидных грибов (Гарибова, 2000).
По данным различных работ хламидоспоры, хотя и являются типичными структурами для G. hicidwn, но не всегда точно соответствуют описанию и иногда могут отсутствовать. Так, у штаммов G. lucidum Венгерской коллекции хламидоспоры не образуются (Szedlay, 1999).
Изучение морфологических признаков штаммов G. lucidum зачастую показывает их чрезвычайную вариабельность (Seo, Kirk, 2000; Автономова, 2006), и так как морфологическое разделение видов иногда оказывается сомнительным, для разделения таксонов низшего ранга применяют генетические и молекулярно-биохимические методы.
Генетический анализ внутривидовой структуры высших
базидиомицетов
Многие грибные популяции в природе представлены генетически сходными клонами, возникающими в результате бесполого размножения, причем клональную природу имеют и многие высшие базидиальные грибы, регулярно формирующие половые структуры (Шнырёва с соавт., 2003). На популяционную структуру грибов оказывает влияние целый ряд факторов, и, в первую очередь, это способ размножения (соотношение долей бесполого и полового размножения) и распространение гриба в природе (Vilgalis, Sun, 1994).
Высшие базидиальные грибы обладают сложной системой рекомбинации, которая находится под генетическим контролем (Taylor et al., 2000). Выделяют два типа генетической совместимости:
Вегетативная (гетерогенная) несовместимость. Препятствует обмену ядрами и цитоплазмой между дикариотическими особями в пределах популяции.
Половая (гомогенная) совместимость. Контролирует слияние двух монокариотических мицелиев и образование дикариона. Обеспечивает формирование фертильных индивидуумов с последующим образованием плодовых тел. Препятствует половому процессу (слиянию монокариотических гиф) между представителями репродуктивно изолированных популяций, т. е. препятствует
генетическому обмену между разными видами или внутривидовыми группами (интерстерильность).
В настоящее время частоты аллелей генов половой и вегетативной совместимости с успехом используются в генетическом анализе грибов в качестве маркеров индивидуумов, клонов, популяций и видов-двойников, что позволяет достоверно оценить генетическое разнообразие в природных популяциях базидиомицетов, а также провести их сравнительный анализ (Штаер, 2006).
Вегетативная несовместимость
При изучении структуры популяции древоразрушающих грибов одной из наиболее сложных проблем является определение границ отдельных генетически обособленных индивидуумов.
В природных популяциях базидиомицетов in situ практически невозможно установить физические и генетические границы мицелия одной особи, а индивидуальный мицелий может формировать более одного плодового тела. Отчасти решению этой проблемы служит оценка реакций вегетативной, или гетерогенной несовместимости, биологическая функция которой состоит в поддержании существования независимого индивидуума в природной популяции, не допуская слияния гиф двух генетически различных дикариотических мицелиев.
До открытия феномена вегетативной несовместимости в микологии долгое время существовала концепция непрерывного мицелия - феномен Буллера. Согласно этой концепции мицелий одного вида, благодаря свободному анастомозированию, может образовывать континуум, способный занимать огромные пространства. Но несмотря на то, что сам феномен антагонизма или реакции несовместимости был отмечен многими авторами (Радзиевская, 1987; Kay, Vilgalys, 1992; Worral, 1997), сведения о роли вегетативной несовместимости в меж- и внутрипопуляционных процессах все еще очень
немногочисленны. Как было показано рядом исследователей, образование линии антагонизма на границе двух взаимодействующих дикарионов — общее свойство многих древоразрушающих базидиомицетов (Симонян, Мамиконян, 1982; Радзиевская, Бобко, 1985; Мелик-Хачатрян, 1985). В работе Д. Адамса и Л. Роса 1967 года (Adams, Roth, 1967) было впервые постулировано положение о том, что образование пигментированных линий в зоне контакта дикариотических мицелиев Fomitopsis cajanderi служит надежной основой для разграничения генетически различных мицелиев. На основании изучения локальных сообществ Coriolus versicolor на пнях березы авторами была выдвинута идея использования внутривидового антагонизма в качестве критерия разделения индивидуумов в природной популяции (Мелик-Хачатрян, 1985). Исследования фенотипического проявления антагонистических реакций между видами ксилотрофных базидиальных грибов проводятся и в настоящее время (Babalyan, Innocenti, 2002; Штаер, Шнырева, 2005 и т.д.). При сращивании двух штаммов либо происходит встречный рост гиф без анастомозов, либо гибель слившихся клеток (барраж) (Kay, Vilgalys, 1992). При этом отмечали, что степень проявления подобных реакций может сильно варьировать. Тем не менее тест на вегетативную совместимость активно используется для определения границ генетически обособленных индивидуумов в природных популяциях многих мицелиальных грибов, например, Heterobasidion annosum, Ceratobasidiam bicorne, Suillus granulatas, видов рода Plenrotus и т. д. (Jacobson et al., 1993; Hansen et al.,1993; Hietala et al., 2003; Шнырева с соавт., 1998), и в том числе видов рода Ganoderma. Дж. Адаскавег и Р. Гилбертсон подтверждают тестами на половую несовместимость, что американские штаммы G. hicidum и G. tsugae различимы не только по морфологическим и экологическим характеристикам, но и репродуктивно изолированы. Кроме того, североамериканские штаммы G. lucidum и европейские штаммы G. resinaceum при проведении мон-мон скрещиваний оказались совместимы, и скорее всего, относятся к одному виду (Adaskaveg, Gilbertson, 1986).
У высших грибов за образование дикариотического мицелия, а также за процессы, связанные с вегетативной несовместимостью отдельных индивидуумов, отвечает группа генов, так называемые /zef-локусы (от англ. heterocaryon incampatibility), которые в течение всего вегетативного роста контролируют систему опознавания гиф «свой - чужой» и препятствуют слиянию гиф генетически различных мицелиев. Вегетативное слияние гиф находится под контролем сразу нескольких /геґ-локусов, причем гетероаллельность по любому локусу препятствует слиянию гиф двух штаммов. Образование дикариона также возможно только между монокариотическими мицелиями, обладающими идентичными аллельными наборами по /геґ-локусам (Дьяков, 1998). Отсюда и второе название вегетативной несовместимости — гетерогенная несовместимость, которая исключает возможность образования дикариотической формы мицелия при разных аллельных наборах по /геґ-локусам и в дальнейшем обеспечивает физическую целостность грибных индивидуумов в популяции. Особое значение приобретает система вегетативной несовместимости в популяциях мицелиальных грибов, представленных сообществом свободно скрещивающихся между собой особей. В настоящее время вегетативная несовместимость все чаще используется для разделения фенотипов (групп вегетативной несовместимости - VC-групп) в популяциях грибов (Bissegger et al., 1997). Как один из важнейших факторов, характеризующий внутрипопуляционные отношения индивидуумов, анализ вегетативной (соматической) несовместимости, безусловно, представляет собой незаменимый критерий при исследовании генетического разнообразия природных популяций грибов. Однако высшие грибы обладают сложной и малоизученной системой het-яокусоъ. Наиболее подробно система het-локусов охарактеризована у ряда аскомицетов (Neurospora crassa, Podospora anserina, Aspergillus nidulans и др.). Вегетативная система несовместимости этих грибов представлена в основном неаллельными доменами генов, что
позволило обнаружить, клонировать и отсеквенировать ряд het-локусов: het-с, het-d, het-e и др. (Wu et al., 1998; Saupe, 2000).
Представители класса Basidiomycetes обладают значительно более сложной мультиаллельной и мультилокусной системой вегетативной несовместимости, и на данный момент механизм работы их /ге?-локусов мало изучен. Вегетативное слияние гиф находится под контролем сразу нескольких het-локусов, причем гетероаллельность по любому локусу препятствует слиянию гиф двух штаммов. Феномен вегетативной несовместимости не только до сих пор активно используется в популяционно-генетических исследованиях, но и интерес к процессам, поддерживающим целостность грибного индивидуума в природных условиях, постоянно растет.
Половая несовместимость
Типичным для высших базидиомицетов продуктом мейоза являются четыре гаплоидные базидиоспоры, созревающие на базидиях в гимениальном слое плодовых тел (базидиом). У гетероталлических видов каждая базидиоспора развивается в самостоятельный гомокариотический (монокариотический) первичный мицелий, способный образовывать дикарион только при объединении с другим гомокариотическим мицелием, несущим ядро противоположного типа спаривания (рис. 1).
СП<пГ &t>
АуВх
АуВх АхВу
»4. -**
АхВх
АуВу
АхВх
Слияние
гаплоидных
мицелиев
I ^ Базидия (2п)
АхВхАуВу
Формиролвание плодового тела
Фертильный дикариотический мицелий с пряжками (п+п)
Рисунок 1. Жизненный цикл Ganoderma lucidunu Показано чередование монокариотической и дикариотической фазы в жизненном цикле
Вид G. lucidum обладает тетраполярной, или двухфакторной, системой гомогенной несовместимости, при которой совместимость скрещиваний определяют два фактора половой совместимости, обозначаемые как А- и В-факторы (та/-локусы) с множественными аллелями (АхВхАуВу) (Chang, Miles, 2004; Шнырёва с соавт., 1998).
Впервые исследования факторов спаривания были проведены на грибе Schizophyllum commune, у которого оба фактора состоят из двух субъединиц, причем, внутри каждой субъединицы может происходить рекомбинация. Изменения хотя бы в одной субъединице вызывают изменение всего фактора, и к настоящему моменту для S. commune уже известно более 20 000 различных комбинаций {mating type) (Esser, 1977). Подобная двулокусная структура была позже обнаружена и у других тетраполярных грибов: Coprinus lagopus, Hypholoma fasciculare, Caholus versicolor, Pleurotus ostreatus и др. (Радзиевская, Бобко, 1985; Larraya et al.,1999, 2001).
Для возникновения фертильных (совместимых) скрещиваний необходимы
различия по обоим факторам совместимости, т.е. гибридизация возможна
только между монокарионами, гетероаллельными по каждому фактору:
или Ax By x Ay Bx. В результате процессов рекомбинации на базидиях образуются по четыре гаплоидных базидиоспоры (рис. 1), различающиеся аллельными состояниями факторов спаривания: Ах Вх; Ау Ву; Ах Ву; Ау Вх,. Таким образом, теоретически вероятность инбридинга в популяции при двухфакторной системе гомогенной несовместимости не будет превышать 25% (только 4 из 16 возможных скрещиваний будут совместимыми). Аллели А- и В- факторов распределены в природных популяциях более или менее случайно. А так как в природе имеется большое число (несколько десятков) случайно распределенных состояний аллелей факторов спаривания, то вероятность совместимых половых скрещиваний между монобазидиоспоровыми штаммами, полученными из разных плодовых тел близка к 100% (Дьяков, 2003).
Тетраполярный тип половой несовместимости позволяет выделить для каждой интерстерильной группы четыре типа монокариотических штаммов, которые представляют собой все четыре возможные комбинации факторов типов спаривания:
"х "х> **у Лу, Ах -t*y> Ау Ї5Х
Такой набор штаммов-тестеров необходим для идентификации видовой принадлежности природных изолятов, поэтому их еще называют тестерными штаммами, или тестерами. Наличие регулярных, хорошо заметных пряжек в районе клеточных септ является надежным критерием, подтверждающим миграцию ядер между монокариотическими мицелиями и формирование фертильного дикариона (генетического диплоида). Показано, что фактор А-контролирует слияние ядер, формирование пряжек, координированные клеточные деления и образование септ в местах формирования пряжек; фактор В- контролирует миграцию ядер, исчезновение клеточных перегородок и слияние клеток при формировании пряжек (Anderson et al., 1998). Полная несовместимость между всеми монокариотичными тестерами двух штаммов и отсутствие формирования пряжек на мицелии при их
скрещивании будет свидетельствовать о взаимной стерильности штаммов, т. е. о принадлежности этих природных штаммов к разным интерстерильным группам (Шнырева с соавт., 1998; Дьяков, 1993).
В лабораторных условиях помимо скрещивания гиф двух монокариотических мицелиев (л/он-жон-скрещивание) существует возможность образования нового дикариона путем слияния гиф первичного монокариотического мицелия с гифами дикариотического мицелия (ди-мон-скрещивание), т.е. возможна дикариотизация монокариотического партнера за счет миграции ядер дикариона, которая определяется по образованию пряжек на растущих кончиках гиф монокариотического тестера. Подобная дикариотизация возможна только при условии, что одно или оба ядра дикариона обладают совместимыми с монокариотическим тестером аллелями типов спаривания. Дм-л/он-скрещивания могут протекать и в природных условиях, что было показано на примере Pleurotus pulmonarius (Шнырева, 2005). Это позволяет предположить, что dw-лшн-скрещивания, как еще один путь рекомбинации высших базидиомицетов, также участвуют в формировании генетической структуры природных популяций грибов. Кроме того, в лабораторных условиях с помощью ди-л*он-скрещиваний можно относительно легко и быстро определить видовую принадлежность выделенного природного изолята гриба (Шнырева с соавт., 2003).
При недостатке морфологических характеристик для оценки микроэволюционных процессов, происходящих внутри вида, многие исследователи базидиальных грибов обращаются к белковым и молекулярным маркерам, способным обеспечить большим количеством значимых для оценки изменчивости признаков. В современной микологии анализы изоферментных спектров и ДНК-полиморфизма, в частности, RAPD-анализ, являются одними из наиболее информативных, взаимно дополняющих друг друга и широко применяемых методов.
Анализ ДНК-полиморфизма
К настоящему времени в молекулярной биологии разработано множество
подходов к изучению ДНК-полиморфизма. Один из наиболее широко
используемых методов - RAPD- анализ (Random Amplified Polymorfic
DNA). Метод полимеразной цепной реакции (PCR) был изобретен Кери
Мюллисом в 1983 г. и имел поистине революционное значение.
Полимеразная цепная реакция основана на способности фермента ДНК-
полимеразы in vitro продуцировать копию определенного участка исходной
ДНК-матрицы, репликация которого инициируется затравкой, или
праймером-цепочкой из 5-30 нуклеотидов. ДНК-полимераза
взаимодействует с сайтом присоединения праймера к ДНК-матрице, и использует в качестве строительных блоков новой цепи свободные мононуклеотиды (дезоксинуклеотидтрифосфаты) и ионы Mg2+. В условиях циклического повторения строгих температурных условий - термоциклинга, образуется большое количество копий данного участка ДНК, ограниченного в концевых областях двумя праймерами. PCR позволяет избирательно размножить определенные фрагменты или последовательности ДНК в 10б-108 раз (Юрченко, Синявская, 2007).
Последовательность цепи-матрицы, т.е. цепи ДНК изучаемого организма, имеет один или несколько участков, комплементарных (гомологичных) нулеотидной последовательности праймера — сайтов правильной гибридизации праймера. Комплементарное взаимодействие через образование водородных связей происходит по схеме А (аденин)-Т (тимин) и Г (гуанин)-Ц (цитозин). В ходе процесса, который называется праймированием, или праймингом, два праймера присоединяются к «сайтам узнавания» на обе нити цепи, с ориентацией 3'-концами навстречу друг другу. Понижение температуры до оптимального уровня (температуры отжига) в циклах позволяет праймеру в ходе броуновского движения
«сканировать» ДНК и отжигаться (гибридизировать) с подходящими сайтами. Праймеры гибридизуются с цепями ДНК противоположной полярности, и синтез идет в противоположных направлениях. В случае RAPD- PCR один и тот же праймер является и прямым и обратным.
Возможна «неправильная» гибридизация, при которой одна или несколько пар нуклеотидов некомплементарны (гетерологичны), но при этом всё равно происходит наработка множества копий фрагмента ДНК, хотя и в меньшем количестве, чем при термодинамически более выгодной комплементарности. При определенных условиях амплификации вероятность «неправильной» гибридизации может повышаться, либо понижаться.
Последующее повышение температуры дает возможность термостабильной ДНК-полимеразе присоединяться к дуплексу «праймер-матрица» в сайте 3'-конца праймера. ДНК-полимераза достраивает новые цепи, начиная с праймеров. Первоночальные продукты одноцепочечные, с полиндромными концами, часть которых способна взаимодействовать по типу матрица-матрица с образованием петель. Затем праймеры встраиваются в цепь вновь синтезированных молекул ДНК. Фактически заданный для амплификации фрагмент появляется только в конце третьего цикла PCR. Каждая из новосинтезированной с помощью одного праймера молекул ДНК в дальнейшем служит матрицей для синтеза комплементарной ей молекулы с помощью второго из пары праймеров. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества заданного фрагмента, приблизительно равное 2П, где n-количество циклов амплификации. Однако на практике вырабатывается только 85% продукта от теоретически возможного.
Кроме того, с исходной матричной ДНК синтезируются копии неопределенной длины, но их количество незначительно по сравнению с основным продуктом. Длинные фрагменты накапливаются в арифметической прогрессии, а короткие, целевые PCR-продукты - в геометрической
прогрессии. Длина основного продукта может быть от десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Эффективность PCR при уменьшении длины амплифицируемых фрагментов возрастает, так как термодинамически матричные фрагменты меньшей длины амплифицируются предпочтительнее фрагментов большей длины.
Молекулярное маркирование ДНК имеет важное значение в микологии и применяется для:
Оценки полиморфизма вида на уровне генотипа (Шнырева с соавт., 2003, 2006; Zervakis et al., 2001)
Доказательства идентичности или различия ДНК двух образцов (с помошью техники фингерпринта) (Hseu et al., 1996; Шнырева с соавт., 2003)
Идентификации видов при отсутствии необходимых морфологических признаков (на стадии мицелия, склероциев) или плохо выраженном гиатусе между видами (Юрченко, Синявская, 2007)
Идентификации хозяйственно значимых штаммов (Moore et al., 2001)
Поиска генетических маркеров, связанных с экономически важными признаками, например, болезнетворностью
Наблюдения над мутационным процессом в естественных популяциях грибов
Молекулярные маркеры в настоящее время активно используются при исследовании филогении рода Ganoderma и для решения вопросов таксономии и структуры сложного вида G. lucidum, обеспечивая информацией об индивидуальных особенностях генома. Чувствительность метода отвечает требованиям исследований, касающихся внутривидовой изменчивости G. lucidum (Hseu et al., 1996).
RAPD-PCR-анализ является дополнительным методом исследования внутри-и межпопуляционной дифференциации вида и часто дополняется исследованием изозимных спектров.
Анализ изозимных спектров
