Термофильные железовосстанавливающие прокариоты Слободкин Александр Игоревич

Введение к работе

Актуальность проблемы

Железо - четвёртый по распространённости элемент земной коры и первый на Земле в целом. Биогенный цикл железа, включающий в себя энзиматические и биотически опосредованные реакции, осуществляется прокариотами разных филогенетических и физиологических групп (Кузнецов и др. 1962, Ehrlich 2002). Процессы микробного восстановления Fe(III) сопряжены с биогеохимическими циклами углерода, кислорода и серы и могут оказывать значительное экологическое воздействие на современную окружающую среду (Lovley 1991, Lovley et al. 2004). В некоторых морских, пресноводных и почвенных экосистемах диссимиляционное восстановление железа(Ш) микроорганизмами - основной процесс, обеспечивающий окисление органического вещества (Nealson & Saffarini 1994, Thamdrap 2000). Микробная железоредукция способна ингибировать процессы сульфатредукции и метаногенеза и вызывать образование ряда минералов, в частности магнетита и сидерита. Ещё большую роль микробное восстановление трёхвалентного железа могло играть в древнейшей биосфере, где Fe(III), вероятно, являлось первым и некоторое время основным окислителем органического углерода (Walker 1987). Предполагается, что диссимиляционные железоредукторы участвовали в формировании такого глобального геологического феномена как месторождения докембрийских железистых кварцитов. Выдвинута гипотеза о том, что диссимиляционное восстановление Fe(III) могло быть первым возникшим типом метаболизма (Lovley 2005). Способность микроорганизмов использовать соединения металлов в метаболических процессах привлекает внимание астробиологов (Nealson et al. 2002). Микробная железоредукция оказывает влияние на хозяйственную деятельность человека. Биокоррозия, оглеение почв, удаление органических загрязнителей и иммобилизация токсичных металлов в грунтовых водах, микробные топливные элементы -далеко не полный список прикладных аспектов железоредукции (Lovley 2004).

Большой интерес представляет восстановление Fe(III) термофильными прокариотами. Современные гидротермальные экосистемы рассматриваются как реликты древнейшей биосферы Земли; процессы, протекающие в них, могут служить моделью для реконструкции древних биоценозов (Заварзин 2001). Гипотеза о существовании горячей подземной биосферы, с суммарным количеством биомассы, превосходящим наземную, предполагает активное участие термофильных микроорганизмов в современных глобальных биогеохимических процессах (Gold 1992). Термофильные прокариоты могут

использовать различные неорганические акцепторы электронов в катаболических реакциях, однако, способность термофилов к диссимиляционному восстановлению Fe(III) к началу наших исследований не была известна.

Железовосстанавливающие микроорганизмы способны восстанавливать и ряд других элементов переменных валентностей, включая токсичные металлы и радионуклиды. При восстановлении хрома, технеция, урана образуются слаборастворимые соединения, что может быть использовано для их иммобилизации в биотехнологических процессах или при биоремедиации. Минералы, формирующиеся при микробном восстановлении металлов, имеют потенциал для применения в современных нанотехнологиях (Lloyd 2003).

Таким образом, изучение термофильных железовосстанавливающих
микроорганизмов является актуальным для решения фундаментальных
проблем, связанных с возникновением и эволюцией метаболических путей
прокариот, вероятно, имевших термофильного предшественника. Исследования
термофильных железоредукторов важны для понимания функционирования
биосфер Архея и Протерозоя, характеризовавшихся повышенными
температурами и наличием значительных количеств Fe(III), а также
биогеохимических процессов, происходящих в современных термальных
экосистемах. Процессы, осуществляемые железоредуцирующими

термофилами, могут быть использованы при разработке новых природоохранных технологий, а также для получения биогенных минералов с новыми свойствами.

Состояние вопроса

Участие микроорганизмов в процессах восстановления соединений железа известно с конца XIX начала XX веков (Рунов 1926). Долгое время считалось, что основной причиной понижения степени окисления Fe(III) является изменение физико-химических параметров среды за счёт жизнедеятельности микроорганизмов. Существование энзиматических механизмов восстановления Fe(III) было продемонстрировано в 40-70 годы XX века. Объектом этих исследований, в основном, были бактерии с бродильным типом метаболизма, для которых наличие трёхвалентного железа не являлось необходимым условием роста (Roberts 1947, Bromfield 1954, Ottow 1968). Способность микроорганизмов к облигатной железоредукции («железному дыханию») была впервые показана Балашовой и Заварзиным в 1979 г. В этих экспериментах бактерия, идентифицированная как Pseudomonas sp., восстанавливала гидроксид железа и ферригидрит молекулярным водородом. В

конце 80-х годов появились работы Лавли и др. (Lovley et al. 1987, Lovley & Phillips 1988) и Майерса и Нильсона (Myers & Nealson 1988), демонстрировавшие использование Fe(III) и Mn(IV) в качестве конечного акцептора электронов при росте микроорганизмов на несбраживаемых органических соединениях. Бактерии, выделенные в результате этих исследований и отнесённые к родам Geobacter и Shewanella, стали в дальнейшем модельными объектами для изучения биохимических и физиологических аспектов микробной металл оредукции. В случае с Geobacter интерес к исследованиям подогревался ещё и тем, что этот организм преобразовывал слабокристаллический оксид железа во внеклеточный магнетит. До этого считалось, что формировать магнитные минералы, в виде относительно небольших по массе внутриклеточных включений, способны лишь магнетотактические бактерии (Blakemore 1975). Открытие способности микроорганизмов к образованию значительных количеств магнетита в результате диссимиляционного процесса в анаэробных условиях заставило по-новому взглянуть на проблемы, связанные с генезисом древних железистых кварцитов и магнетизацией современных почв. Перед исследователями сразу встал вопрос, насколько широко может быть распространено диссимиляционное восстановление Fe(III) в различных физико-химических условиях. Верхняя температурная граница микробной железоредукции была особенно интересна в связи с выдвинутой гипотезой о том, что в микробных сообществах Архея и Протерозоя, вероятно, состоявших в значительной степени из термофильных микрорганизмов и формировавших основу древнейшей биосферы; восстановление трёхвалентного железа могло быть первым глобально значимым механизмом окисления органического вещества (Walker 1987).

К началу наших исследований в 1993 г. о существовании микробных процессов диссимиляционного восстановления Fe(III), идущих при повышенных температурах известно не было. О восстановлении трёхвалентного железа термофильным археоном Sulfolobus acidocaldarius в микроаэрофильных условиях сообщалось Броком и Густафсоном в 1976 году (Brock & Gustafson 1976). Полученные данные демонстрировали биотический характер восстановления железа, однако, не позволяли однозначно судить об использовании Fe(III) в качестве акцептора электронов при росте данного микроорганизма. В 1995 г. нами были опубликованы данные, доказывающие существование диссимиляционного процесса восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами, идущего с образованием магнетита (Слободкин и др. 1995). В том же году появилось сообщение о выделении

облигатно анаэробной бактерии Bacillus infernus, способной восстанавливать растворимые формы Fe(III) (Boone et al 1995). В последующие годы круг организмов, осуществляющих диссимиляционную железоредукцию, был расширен термофилами, выделенными из различных мест обитания (Greene et al. 1997, Slobodkin et al 1997, Slobodkin et al. 1999). Способность к восстановлению Fe(III) была выявлена у некоторых коллекционных культур гипертермофильных микроорганизмов, относящихся к различным физиологическим и филогенетическим группам бактерий и архей (Vagras et al. 1998). На основании этого была выдвинута гипотеза о том, что такое широкое распространение способности к железоредукции среди гипертермофильных прокариот, которых принято считать филогенетически близкими к последнему общему предку всех живых организмов, указывает на то, что восстановление Fe(III) является древнейшим типом метаболизма.

К настоящему времени известно около 30 видов железовосстанавливающих термофилов, относящихся к 19 родам. Важными открытиями последних лет явились обнаружение способности гипертермофильных архей к использованию ацетата, ароматических соединений и длинноцепочечных жирных кислот за счёт восстановления Fe(III) (Tor et al. 2001, Tor & Lovley 2001, Kashefi et al. 2002) и выделение железоредуктора, способного развиваться при температуре 121С (Kashefi & Lovley 2003). Быстрыми темпами увеличиваются знания о филогенетическом разнообразии термофильных железоредукторов (Reysenbach et al. 2006, Johnson et al. 2006, Zavarzina et al. 2007, Sokolova et al. 2007).

Кроме Fe(III) термофильные микроорганизмы восстанавливают и ряд других переменно-валентных металлов - Mn(IV), Cr(VI), U(VI), Tc(VII), Co(III), Mo(VI), Au(I, III), Hg(II). Марганец(ІУ) и молибден(УІ), используются в качестве акцептора электронов при росте (Greene et al. 1997, Brierley & Brierley 1982). Использование шестивалентного урана в качестве терминального акцептора электронов при росте показано нами в 2005 г. (Khijniak et al., 2005). Физиологическая роль восстановления остальных металлов остаётся в основном невыясненной (Kashefi & Lovley 2000, Roh et al. 2002).

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось выявление и изучение термофильных микроорганизмов, способных к восстановлению трёхвалентного железа.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Показать принципиальную возможность диссимиляционного восстановления Fe(III) термофильными микроорганизмами.

2. Исследовать распространение микроорганизмов, способных к восстановлению нерастворимых соединений трёхвалентного железа, в различных типах термальных экосистем.

3. Выделить чистые культуры термофильных Ре(Ш)-восстанавливающих микроорганизмов, исследовать их фенотипические и генотипические свойства и установить таксономический статус.

4. Изучить физиологические и биохимические механизмы восстановления железа(Ш) термофилами и определить функции железоредукции в процессах микробного метаболизма.

5. Исследовать способность термофильных железоредукторов к восстановлению токсичных и радиоактивных металлов переменных валентностей.

Научная новизна и значимость работы

Впервые показано, что термофильные микроорганизмы могут осуществлять процесс диссимиляционного восстановления трёхвалентного железа. Данный факт расширяет круг возможных биогеохимических процессов, идущих с участием термофильных прокариот в наземных и глубинных системах современной биосферы, и может служить основой для моделирования микробных процессов, протекавших в древнейшие эпохи существования Земли или во внеземных условиях. Открытие термофильного микробного окисления молекулярного водорода и ацетата, сопряжённого с использованием Fe(III) в качестве акцептора электронов, позволяет предположить значительную роль железоредукторов в трофических взаимодействиях в термальных биотопах, содержащих соединения трёхвалентного железа.

Продемонстрировано, что продуктом микробного восстановления слабокристаллических форм Fe(III) в термофильных условиях является внеклеточный магнетит. Полученные данные могут служить обоснованием участия термофильных железоредукторов в образовании месторождений докембрийских железистых кварцитов.

Установлено, что термофильные прокариоты, способные к восстановлению нерастворимых соединений Fe(III), широко распространены в термальных экосистемах. Сообщения об обнаружении железоредуцирующих микроорганизмов в континентальных и глубоководных морских гидротермах являются приоритетными.

Выделены в чистую культуру, охарактеризованы и валидированы новые
таксоны железовосстанавливающих термофильных бактерий:

Thermoterrabacterium/Carboxydothermus ferrireducens sp. nov.,

Thermoanaerobacter siderophilus sp. nov., Thermovenabulum ferriorganovorum gen. nov., sp. nov., Deferribacter abyssi sp. nov., Tepidimicrobium ferriphilum gen. nov., sp. nov.

Впервые охарактеризованы физиологические стратегии восстановления нерастворимых форм Fe(III) и мембраносвязанные железоредуктазные активности у диссимиляционного железоредуктора с грамположительным типом клеточной стенки (Carboxydothermus ferrireducens). Обнаружено, что экзогенный сидерофор может стимулировать диссимиляционное восстановление Fe(III) в отсутствие свободного доступа клеток к нерастворимому акцептору по челночному механизму. Впервые показана возможность трансформации слабокристаллического оксида Fe(III) в магнетит в результате образования низких концентраций сульфида гипертермофильными сульфатвосстанавливающими микроорганизмами.

Впервые продемонстрировано восстановление технеция(УП) термофильными бактериями. Впервые обнаружена возможность микробного использования минерала урана в качестве акцептора электронов и продемонстрирована способность термофильных микроорганизмов получать энергию для роста при восстановлении U(VI).

Практическая ценность

Создана коллекция термофильных микроорганизмов, способных к восстановлению Fe(III), Cr(VI), Tc(VII), U(VI). Полученные штаммы могут служить основой для разработки биотехнологий иммобилизации растворимых соединений хрома, технеция и урана путём их энзиматического восстановления в менее токсичные и слаборастворимые формы.

Обнаруженная способность Carboxydothermus ferrireducens

восстанавливать минералы U(VI) показывает принципиальную возможность взаимодействия микроорганизмов с твердофазными соединениями урана, которая может происходить в уран-содержащих рудах или местах, загрязнённых радионуклидами. Эта возможность ранее была неизвестна и должна учитываться при разработке новых биоремедиационных технологий.

Образование внеклеточных кристаллов магнетита термофильными прокариотами может быть использовано при создании новых наноматериалов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

6. International Conference on The Biology, Ecology and Biotechnology of Thermophilic Microorganisms. Athens, GA, USA. 1996.

7. International Conference "Thermophiles' 98". Brest, France. 1998.

8. 3 International Congress on Extremophiles. Hamburg, Germany. 2000.

9. International Conference "Thermophiles' 2001". New Delhi, India. 2001.

10. 4 th International Congress on Extremophiles. Naples, Italy. 2002.

11. Всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии» Улан-Удэ. 2003.

12. International Symposium on Environmental Biogeochemistry. Oirase, Japan. 2003.

13. 8^th International Conference on Thermophiles Research. Gold Coast, Australia. 2005.

14. 2^nd FEMS Congress of European Microbiologists. Madrid, Spain. 2006.

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 57 печатных работах, включающих 26 экспериментальных статей, 3 обзора и 28 тезисов.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 частей, включающих 14 глав, заключения и выводов, изложенных на 374 страницах, включая 42 таблицы, 66 рисунков и списка литературы из 574 наименований, из них 58 на русском и 516 на английском языке.

Место проведения работы

Основная часть работы была выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Работы по термофильной микробной железоредукции были начаты в отделе микробных сообществ ИНМИ РАН под руководством академика РАН Г.А. Заварзина в 1993 г. В 1995-1996 гг. часть работы проводилась в Университете штата Джорджия, США в лаборатории проф. Ю. Вигеля (J. Wiegel). С 1997 г. основным местом исследований является лаборатория гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, руководимая д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской. В отдельных этапах работы принимали участие сотрудники и аспиранты лаборатории: М.Л. Мирошниченко, Г.Б. Слободкина, Д.Г. Заварзина, С.Н. Гаврилов. Электронно-

микроскопические исследования были выполнены в ИНМИ РАН Н.А. Кострикиной. Геносистематические исследования проводились Т.П. Туровой, Н.А. Черных, A.M. Лысенко и Б.Б. Кузнецовым. В исследованиях микробной железоредукции в нефтяных месторождениях принимала участие д.б.н. Т.Н. Назина. Изучение глубоководных гидротерм стало возможным благодаря участию соискателя в рейсе французского научно-исследовательского судна "Atalante" с глубоководным спускаемым аппаратом "Nautile" (руководитель миссии - К. Жантон (С. Jeanthon)). Мёссбауэровские исследования минералов железа проводились Н.И. Чистяковой и B.C. Русаковым (Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова). Биохимические исследования железоредуктазы выполнялись в Технологическом Университете г. Дельфт, Нидерланды совместно с проф. С. де Врисом (S. de Vries). Восстановление соединений урана исследовалось совместно с Т.В. Хижняк (ИНМИ РАН) и Д. Ллойдом (J. Lloyd) в Университете г. Манчестер, Великобритания. Исследования восстановления технеция проводили совместно с К.Э. Германом и В.В. Перетрухиным в Институте физической химии РАН и в лаборатории проф. М. Симонофф (М. Simonoff) в Университете г. Бордо, Франция. Помощь на разных этапах работы была также оказана со стороны проф. Б. Джонса (В. Jones) Нидерланды; Б. Кампбелл (В. Campbell) Университет штата Делавер, США; профессоров Н.-К. Биркеланда (N.-K. Birkeland) и Т. Лиена (Т. Lien) Университет г. Бергена, Норвегия; проф. И. Шредер (I. Shroeder) Университет Калифорнии, Лос-Анджелес, США и проф. Ф. Робба (F. Robb) Университет штата Мэриленд, США. Соискатель выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.

Основные защищаемые положения

15. Термофильные микроорганизмы способны использовать трёхвалентное железо в качестве акцептора электронов для роста.

16. Термофильные прокариоты, способные к восстановлению нерастворимых соединений Fe(III), распространены в различных типах термальных экосистем.

17. Термофильные железовосстанавливающие микроорганизмы не являются единой филогенетической группой.

18. Железовосстанавливающие термофилы сопрягают восстановление Fe(III) с окислением широкого спектра органических и неорганических веществ.

19. Термофильные железовосстанавливающие бактерии способны энзиматически восстанавливать токсичные и радиоактивные металлы переменных валентностей.

Похожие диссертации на Термофильные железовосстанавливающие прокариоты

Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариотыСоколова, Татьяна Геннадиевна

Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifHСлободова Наталья Валерьевна

Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферментыКубланов Илья Валерьевич

Применение методов геносистематики для решения вопросов таксономии и изучения биоразнообразия прокариотТурова, Татьяна Павловна

Гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты в горячих источниках КамчаткиСлепова Татьяна Вячеславовна

Про- и антиоксиданты как факторы формирования и регуляции симбиотических систем с участием прокариотСгибнев, Андрей Викторович