Введение к работе
Актуальность проблемы
Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты представляют физиологическую группу микроорганизмов, способных расти за счет энергии окисления СО в реакции с водой с образованием Н2 и С02. Впервые термофильные микроорганизмы с данным типом литотрофного метаболизма были обнаружены В.А. Светличным в микробных сообществах горячих источников Курильских островов (Светличный и др., 1990; Svetlichny et al., 1991а). Впоследствии в различных типах гидротерм, а также в антропогенных горячих местах обитания было показано широкое распространение гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, относящихся к обоим доменам - бактериям и археям (Svetlichny et al, 1991b; Sokolova et al, 2001; 2002; 2004a, b; 2005; 2007; Parshina et al., 2005; Zavarzina et al., 2007; Kozina et al., 2008). Биохимия этого процесса была подробно исследована на первом выделенном организме этой группы - Carboxydothemus hydrogenoformans (Dobbek et al., 2001; Svetlichnyi et al., 2001; 2004; Soboh et al., 2002; Jeoung, Dobbek, 2007). Полностью прочитан геном С. hydrogenoformans (Wu et al., 2006), и в стадии аннотирования находятся геномы еще трех представителей данной группы.
Интерес к термофильным гидрогеногенным карбоксидотрофам связанпрежде всего с тем, что данная группа прокариот является компонентом микробных сообществ гидротермальных мест обитаний, рассматриваемых учеными как аналоги древнейших биоценозов (Заварзин, 1984; Stetter, 2006). Также представляет интерес, в том числе и прикладной, исследование термостабильных ферментов организмов, относящихся к данной группе термофилов. Запатентована РНК-зависимая ДНК-полимераза Carboxydothermus hydrogenoformans (Европейский патент No. 97.121151.1), обладающая рядом полезных свойств. Ведутся исследования по использованию гидрогеногенных карбоксидотрофных термофилов в очистке синтез-газа, состоящего в основном из Н2, СО и С02, и увеличении эффективности получения Н2 из него (Sipma et al., 2007). Однако об экологии данной группы в природных местообитаниях термофильных прокариот - горячих источниках ничего не известно.
В гидротермах основными энергетическими субстратами литотрофных прокариот считаются Н2 и восстановленные соединения серы (Бонч-Осмоловская и др., 1999; Spear et al., 2005). СО также поступает в гидротермы с вулканическими газами (Symonds et al., 1994), образуется за счет термального и фотохимического разложения органического вещества (Hellebrand et al., 2008) и как продукт метаболизма некоторых термофильных прокариот (Conrad, Thauer, 1983; Diekert et al., 1984). Таким образом, и СО может также являться источником энергии для литотрофных прокариот.
Известно, что СО могут использовать для роста следующие группы термофильных прокариот: метаногены (Daniels et al., 1977), ацетогены (Diekert, Thauer, 1978; Savage et al., 1987; Balk et al., 2008), железоредуцирующие
(Slobodkin et al., 2006) и сульфатредуцирующие (Parshina et al., 2005a, b; Henstra et al., 2007) прокариоты, а также большая группа гидрогеногенных карбоксидотрофов, которым посвящено данное исследование. Несмотря на большое разнообразие анаэробных термофилов, способных расти на СО, не известно, идет ли в горячих источниках микробное потребление СО. Не известно также, микроорганизмы каких физиологических групп участвуют в трансформации СО в анаэробной зоне гидротерм, и какова роль гидрогеногенных карбоксидотрофов в ней. Одним из направлений данной работы было определение с помощью радиоизотопных и хроматографических методов скорости микробной трансформации СО, идущей в горячих источниках. В задачи исследования входило также определение основных продуктов микробной трансформации СО для оценки участия различных физиологических групп прокариот в исследуемом процессе.
К началу наших исследований группа анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов состояла из бактерий, относящихся к классу Clostridia (Svetlichny et al, 1991; Sokolova et al, 2001; 2002, 20046, 2005), и одной архей рода Thermococcus (Sokolova et al., 2004a). Впоследствии было выделено еще несколько представителей Clostridia, способных расти на СО с образованием Н2 (Parshina et al., 2005; Zavarzina et al., 2007; Kozina et al., 2008), а также описан представитель нового бактериального класса Thermolithobacteria (Sokolova et al., 2007). Таким образом, стало ясно, что физиологическая группа гидрогеногенных карбоксидотрофов не является филогенетически однородной. Поэтому данная работа включала поиск новых термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных бактерий и архей.
Цели и задачи исследования
Целью работы было исследование микробной трансформации СО на примере микробных сообществ горячих источников Камчатки и характеристика разнообразия участвующих в ней термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
определение активности и основных продуктов трансформации СО чистыми культурами и микробными сообществами карбоксидотрофных термофильных прокариот;
определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников;
выявление возможных агентов трансформации СО в микробных сообществах горячих источников при помощи методов молекулярной экологии;
выделение и характеристика новых анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые с помощью радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной СО трансформации в термальных местообитаниях. Определены основные продукты микробной трансформации СО. Для количественного разделения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами разработан радиоизотопный метод.
Выделены, частично или полностью охарактеризованы новые термофильные анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты. Выделен новый вид гипертермофильных архей 'Thermofilum carboxydotrophus' sp. nov.; новые виды термофильных бактерий 'Dyctioglomus carboxydivorans' sp. nov., 'Carboxydothermus siderophilus' sp. nov., Carboxydocella sporoproducens sp. nov., a также четыре новых штамма рода Carboxydocella. Показано широкое распространение представителей p. Carboxydocella в горячих источниках Камчатки.Полученные результаты расширяют филогенетические и фенотипические границы группы термофильных анаэробных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.
Создана коллекция новых термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, которая может быть использована в водородной энергетике, очистке сточных вод, а также как потенциальный источник термостабильных ферментов.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Extremophiles 2004", "Thermophiles 2005", "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles 2005", "The IIі International Symposium on Microbial Ecology - 2006", "Extremophiles 2006", "Thermophiles 2007", "The 18 International Symposium on Environmental Biogeochemistry - 2007" и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005».
Публикации
Материалы диссертации содержатся в 11 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 8 тезисах конференций.
Место проведения работы
Основная работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ РАН).
Радиоизотопные исследования проводились в лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов ИНМИ РАН. Секвенирование последовательностей 16S рДНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре Биоинженерии РАН. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автор приносит искреннюю благодарность всем, кто помогал и участвовал в данной работе: д.б.н. Пименову Н.В., д.г.-м.н. Карпову Г.А., Камзолкиной О.В., к.б.н. Русанову И.И., к.б.н. Дулову Л.Е., к.б.н. Слободкиной Г.Б., к.б.н. Черных Н.А., к.б.н. Лысенко A.M., к.б.н. Переваловой А.А., к.б.н. Туровой Т.П., к.б.н. Колгановой Т.В., к.б.н. Кострикиной Н.А., к.б.н. Гаврилову С.Н.; а также всем сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Соколовой Т.Г., д.б.н. Бонч-Осмоловской Е.А. и к.б.н. Лебединскому А.В. за практическую помощь, постоянное внимание и ценные советы на всех этапах выполнения работы.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста
и включает 22 рисунка и 9 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 165 наименований.
