Введение к работе
Актуальность темы
Исследование структур микробных сообществ, ассоциированных с высокотемпературными экологическими нишами, представляет интерес для фундаментальной микробиологии, в том числе эволюционной, поскольку многие обитающие в этих условиях микроорганизмы относятся к эволюционно древним ветвям бактерий и архей. Анализ структуры сообществ термофильных микроорганизмов проводился с момента их обнаружения микробиологическими методами, предполагающими получение и характеристику чистых культур микроорганизмов. В последние 20 лет также применяются не требующие культивирования молекулярные методы, основанные на ПЦР-амплификации и секвенировании фрагментов генов 16S рибосомной РНК. Применение методов анализа 16S рРНК показало, что, как правило, не более 0.1-1% микроорганизмов удается культивировать в лабораторных условиях. Эти работы позволили выявить новые филогенетические группы прокариот, в том числе таксоны высокого уровня, для многих из которых до настоящего времени не получено культивируемых представителей. Однако, применявшиеся до последнего времени методы анализа 16S РНК предполагали клонирование фрагментов генов 16S РНК и секвенирование отдельных клонов с помощью капиллярного электрофореза, что на практике позволяло проанализировать не более нескольких сот последо-вательностей 16S рРНК. Однако, многие природные сообщества могут содержать тысячи различных видов микроорганизмов (Huber et al., 2007).
Развитие методов геномного секвенирования в последние несколько лет позволило совершить качественный скачок в их производительности, заключающийся в возможности проведения единовременного анализа десятков-сотен тысяч нуклеотидных последовательностей. Применение методов пиросеквенирования позволяет проводить «глубокую» характеристику микробного сообщества, выявляя не только доминирующие виды, но и минорные компоненты сообщества, а также количественно определять доли отдельных групп, что необходимо для реконструкции путей метаболизма сообщества в целом (Sogin et al., 2006).
За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено
большое число новых термофильных бактерий и архей, в том числе
представляющих обособленные филогенетические группы и характеризующихся
различными типами метаболизма (Заварзин, 2004; Лебединский и др., 2007).
Однако по сравнению с такими объектами, как гейзеры Исландии и
Иеллоустонского парка США, биоразнообразие термофильных
микроорганизмов Камчатки менее изучено. Помимо культуральных методов, для характеристики термофилов Камчатки использовались традиционные молекулярные методы анализа 16S рРНК, однако, число анализируемых независимых последовательностей в разных работах не превышало нескольких десятков. Таким образом, задача «глубокой» количественной характеристики сообществ термофильных микроорганизмов, в особенности горячих источников Камчатки, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области микробиологии и молекулярной биологии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является определение структур сообществ микроорганизмов термальных источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка. Для этого в работе решались следующие задачи:
Отбор образцов и выделение препаратов метагеномной ДНК из термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся по температуре и кислотности.
Идентификация микроорганизмов на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рибосомной РНК, определенных методом пиросеквенирования.
Реконструкция путей метаболизма сообществ в целом на основе данных об их составе.
Определение полной нуклеотидной последовательности генома термофильной археи рода Vulcanisaeta, широко распространенного в кислых термальных источниках, анализ путей ее метаболизма и возможной экологической роли в термальных сообществах.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые проведена глубокая количественная характеристика состава сообществ микроорганизмов термальных источников Камчатки с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования фрагментов генов 16S рРНК. Определена зависимость состава и степени разнообразия микробных сообществ от температуры и рН. Установлено, что в источниках с нейтральным рН разнообразие микроорганизмов максимально при умеренно высоких температурах (55-58С), при этом в сообществе доминируют термофильные бактерии, а доля архей незначительна. В кислых источниках (рН 3.7-4.1) большинство микроорганизмов сообществ составляют археи, причем в источнике с температурой около 50С доминируют различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, в источниках с температурой 60-90С, - кренархеи порядка Sulfolobales и наноархеи.
Определена полная нуклеотидная последовательность генома термоацидофильной археи рода Vulcanisaeta, широко распространенного в кислых термальных источниках. Анализ генома и путей метаболизма этой археи показал, что представители рода Vulcanisaeta могут играть важную экологическую роль в кислых гидротермах, завершая анаэробный цикл углерода и осуществляя полное окисление органических веществ.
Практическая значимость работы обусловлена биотехнологическим потенциалом термофильных микроорганизмов. Идентифицированные в геноме Vulcanisaeta moutnovskia гидролитические ферменты могут быть использованы для разработки новых биотехнологий, основанных на применении термостабильных ферментов. Апробация работы
Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", (г. Петропавловск-Камчатский, 2010), "Extremophiles 2010" (Португалия, 2010), 15-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (г. Пущино, 2011), 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology "BAGECO-11" (Греция, 2011).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 141 странице машинописного текста и включают 36 рисунков и 19 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 9 отечественных и 186 иностранных источников.
Похожие диссертации на Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки
