Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1 Экстремальные среды обитания, экстремофилы 10
1.2 Метан в биосфере 13
1.2.1 Метан как парниковый газ 13
1.2.2 Источники и стоки метана 16
1.3 Метанокисляющие микроорганизмы 22
1.3.1 Метанотрофы как специализированная группа метилотрофов 22
1.3.2 История изучения и классификация 23
1.3.3 Метанмонооксигеназа - ключевой фермент метанокисления 29
1.3.4 Метанотрофы новых филогенетических ветвей 34
1.4 Среды обитания 38
1.5 Метанотрофы экстремальных местообитаний 39
1.6 Микробное окисление метана в экосистемах наземных газогидротерм 44
1.7.1 Культуральные методы 46
1.7.2 Аналитические методы 46
1.7.3 Молекулярно-биологические методы 46
1.7.4 Микроскопические методы 50
1.7.5 Иммунофлуоресцентный метод 50
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1 Объекты исследования 50
2.1.1 Кальдера вулкана Узон (Камчатка) 50
2.1.2 Условия и сроки отбора образцов 54
2.1.3 Определение содержания ионов 56
2.1.4 Измерение нативных концентраций метана 56
2.2 Определение скоростей метаболических процессов 57
2.2.1 Определение скорости потребления метана 57
2.3 Микроскопические методы 58
2.3.1 Световая микроскопия 58
2.3.2 Электронная микроскопия 59
2.4 Культуральные методы 63
2.4.1 Получение накопительных культур метанотрофов 63
2.4.2 Выделение чистых культур метанотрофов 66
2.5 Молекулярно-биологические методы 67
2.5.1 Выделение ДНК 67
2.5.2 Полимерная цепная реакция (ПЦР) 68
2.5.2.1 ПЦР-детекция прокариот 68
2.5.2.2 Количественная ПЦР 70
2.5.3 Электрофорез в агарозном геле 71
2.5.4 Создание библиотек клонов 71
2.5.5 Денатурирующий градиентный гель-электрофорез 71
2.5.6 Секвенирование 75
2.5.7 Филогенетический анализ 76
2.5.8 Депонирование нуклеотидных последовательностей 76
2.5.9 Гибридизация in situ с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH) 76
Глава 3 Результаты исследований и обсуждение 80
3.1 Характеристика гидротерм 80
3.2 Определение количества бактерий методом электронной микроскопии 86
3.3 Интенсивность микробного окисления метана 88
3.4 Детекция метанотрофов методом ПЦР в реальном времени 89
3.5 Выявление метанокисляющих бактерий методом End-point PCR 90
3.6 Оценка разнообразия метанокисляющих бактерий в обогащенных образцах 91
3.6.1 Оценка состава метаболически активных клеток метанотрофов методом FISH 91
3.6.2 ПЦР-ДГГЭ анализ фрагмента геяартоЛ 92
Заключение 106
Выводы 109
Список используемой литературы 111
- Экстремальные среды обитания, экстремофилы
- Молекулярно-биологические методы
- Гибридизация in situ с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH)
- ПЦР-ДГГЭ анализ фрагмента геяартоЛ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Метан (CH4) - важнейший энергетический источник, до 30% промышленных запасов которого, по мнению геологов, имеют микробное происхождение. Кроме того, метан вносит существенный вклад в парниковый эффект, что определяет его важную роль в формировании климата Земли. Поэтому изучение микробных процессов окисления метана в биосфере представляет большой интерес для специалистов разного профиля.
Окисление метана является одним из важных звеньев глобального геохимического круговорота углерода. За исключением термокаталитического образования, сжигания и фотохимического окисления, основные процессы трансформации углерода в цикле метана осуществляются исключительно высоко специализированными группами микроорганизмов.
Биогенный метан на Земле образуется метаногенными археями на конечных стадиях разложения органического вещества в анаэробных условиях. В природных экосистемах при высоких значениях температуры возможны абиогенные механизмы образования метана - химические, основанные на реакции H2 с СО, и физические, когда метан образуется при термических процессах разложения органики [Fiebig et al., 2007]. Содержание метана в геотермальных газах обычно составляет 0,01-1% [Etiope, Klusman, 2002], однако оно может быть гораздо выше. Так, например, имеются сведения о том, что в газах геотермальных систем Новой Зеландии содержание метана составляет 1-11%, а в ряде случаев достигает аномальных значений 27% [Giggenbach, 1995].
Метанотрофы — физиологически и биохимически специализированная группа аэробных прокариот, использующих метан в качестве источника углерода и энергии. Поступление метана в атмосферу из различных экосистем контролируется активностью «метановых фильтров», образуемых метанотрофами. В последние несколько десятилетий весьма основательно исследованы процессы метанокисления и состав метанотрофных сообществ морских и наземных экосистем. Менее изучены метанотрофы биотопов с высокими значениями температуры (выше 40С).
Термальные источники являются экстремальными экосистемами, микробные сообщества которых представляют значительный интерес для фундаментальных исследований и практического применения [Brock et al., 1971].
Поскольку в составе гидротермальных флюидов наряду с СО, H2S и СО2 присутствует CH4, высказывались предположения о наличии в этих местообитаниях термофильных/термотолерантных метанотрофов [Giggenbach, 1996]. Растворимость газов в водных растворах падает с повышением температуры, что зачастую считается главным лимитирующим фактором роста метанотрофов при высоких температурах. Однако, известно, что растворимость метана в жидких средах с низкой ионной силой (ниже 100 мM) понижается лишь до 33%, когда температура возрастает с 30С до 60С [Duan et al., 1992]. Это может объяснить наличие процесса окисления метана в биотопах с высокими температурами.
Сведения о метанотрофных бактериях высокотемпературных гидротерм немногочисленны и ограничены работами по выделению термофильных метанотрофов из гидротерм Венгрии и Японии [Bodrossy et al., 1997, 1999; Tsubota et al., 2005; Hirayama et al., 2011]. Гидротермальные образования на территории Российской Федерации сосредоточены на Курило-Камчатской островной дуге, а также Прибайкалье и Кавказе. Исследования, проведенные в этих районах, направлены, главным образом, на изучение гидрогенотрофных литотрофов, микроорганизмов с различными типами анаэробного дыхания (серо-, нитрат- и железоредукторов) и использующих оксид углерода II (СО) [Слободкин и др., 2011; Соколова, Кочеткова, 2011; Пименов, 2011; Черных и др., 2011; Перевалова, 2011; Прокофьева, 2011; Кубланов, Подосокорская, 2011]. Активность и состав метанотрофных сообществ гидротерм исследовали эпизодически [Цыренжапова и др., 2007; Зеленкина и др., 2009].
К началу проведения настоящих исследований сведения о метанокислении и метанотрофных организмах в термальных источниках кальдеры вулкана Узон были весьма ограничены. Так, из кислого горячего источника выделена метанокисляющая веррукобактерия Methylacidiphilum [Islam et al., 2008]. Для ряда источников обнаружены процессы микробного окисления метана с максимальной интенсивностью при 37С и выявлены метанотрофы родов Methylococcus, Methylomonas, Methylosinus, Methylocystis и Methyloacidiphilum [Хмеленина и др., 2011]. В то же время газогидротермальные проявления кальдеры Узона характеризуются большим разнообразием температур и минерального состава, что позволяет предположить существование различных по активности и составу метанотрофных сообществ. В связи с вышеизложенным, исследование состава и активности метанотрофных сообществ гидротерм представляется весьма актуальным.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в обнаружении и изучении разнообразия метанотрофных бактерий в газогидротермах кальдеры вулкана Узон, Камчатка. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
определить in situ основные физико-химические параметры газогидротерм кальдеры вулкана Узон (Камчатка);
-
оценить интенсивность метанокисления в исследуемых гидротермах с применением метода радиоактивных изотопов;
-
с помощью молекулярных методов (ПЦР, ПЦР в реальном времени, FISH) детектировать присутствие метанотрофных бактерий в гидротермах;
-
изучить разнообразие метанокисляющих бактерий в гидротермах на основе анализа последовательностей фрагментов генов pmoA;
-
получить и охарактеризовать накопительные культуры термофильных и термотолерантных метанотрофов;
-
описать филогенетическое разнообразие выявленных в гидротермах метанотрофов на основе последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК.
Научная новизна. По единой методике проведены комплексные исследования физико-химических параметров 35 термальных источников кальдеры вулкана Узон (Камчатка). Впервые исследовано разнообразие и определена активность аэробных метанотрофных сообществ газогидротерм Камчатки с температурами выше 40С. Установлено, что выделенные метанотрофные сообщества включают исключительно метанотрофов I типа (Gammaproteobacteria).
В высокотемпературных гидротермах со слабокислыми и близкими к нейтральным значениями рН обнаружены представители рода Methylothermus, в то время как в источниках с низкими значениями рН и умеренными температурами - организмы, отличающиеся от известных метанотрофов и имеющие отдаленное сходство с представителями родов Methylomonas и Methylobacter.
Практическая значимость. Полученные данные расширяют знания о таксономическом составе метанотрофных сообществ термальных экосистем и создают базу для оценки биогеохимического потенциала микробных сообществ гидротерм, а также обусловливают возможность направленного скрининга и выделения эффективных продуцентов ферментов, биологически активных веществ и других соединений, синтезируемых метанотрофами, для целей биотехнологии.
Расширена база данных нуклеотидных последовательностей генов pmoA термофильных метанотрофных бактерий для использования молекулярно- генетических методов детекции этих микроорганизмов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих международных и российских конференциях: Международная конференция «Экосистемы. Организмы. Инновации-12», Москва, Россия, 2010; Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ, Россия - Улан-Батор, Монголия, 2011; VII молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, Россия, 2011; European Geosciences Union General Assembly 2012, Вена, Австрия, 2012.
Публикации. Основные результаты, представленные в диссертации, опубликованы в 7 печатных работах: 3-х научных статьях в реферируемых журналах, включенных в список ВАК, и 4-х тезисах конференций.
Работа выполнена в лаборатории выживаемости микроорганизмов ИНМИ РАН с 2009 по 2012 гг. под руководством чл.-корр. РАН, д.б.н. Гальченко В.Ф. при финансовой поддержке проектов РФФИ № 08-04-00164-а, № 09-04-10113-к и № 10- 04-10127-к.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю чл.-корр. РАН, д.б.н. В.Ф. Гальченко за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов, к.б.н Кравченко И.К. за полезные советы и поддержку на протяжении всего выполнения исследований, к.б.н. Кизиловой А.К., к.б.н. Менько Е.В. за помощь в освоении молекулярно-биологических методов, к.б.н. Сухачевой М.В. (Центр «Биоинженерия» РАН) и к.б.н. Русанову И.И. за участие в проведении отдельных экспериментов, Кострикиной Н.А. за помощь в освоении методов электронной микроскопии и д.б.н. Сорокину Д.Ю. за научные консультации и помощь в выполнении работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 листах машинописного текста, включает 11 рисунков и 13 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список
литературы включает работ, из них отечественных и зарубежных
авторов.
Экстремальные среды обитания, экстремофилы
Когда говорят о жизни на Земле, то обычно подразумевают растения, животные и микроорганизмы, населяющие водные или наземные экосистемы и приспособленные к определенным условиям. И чаще всего эти условия таковы, что значения температуры находятся в интервале от 10 до 40С, рН близок к нейтральному, давление близко к атмосферному, вода свободно доступна, а уровень ионизирующей радиации низок. Среды обитания с такими характеристиками включают большую часть биологического разнообразия, включая высшие растения и животных, которые обычно и ассоциируются с жизнью на Земле и поэтому считаются «нормальными» [Seckbach, 2006].
Однако существуют экосистемы с более широким спектром физико-химических факторов. Если сравнивать «нормальные» среды обитания с горячими источниками, которые имеют температуру выше 80С и рН ниже 2, то последние можно рассматривать как агрессивные для жизни. То же самое можно сказать и о содовых озерах насыщенных солями, в которых доступность воды крайне низка, а значения рН высоки (рН 10-11). Подобные среды обитания рассматривают как «экстремальные». Примером могут служить глубоководные черные курильщики, в которых сочетание высокой температуры и высокого гидростатического давления является чрезвычайно стрессогенным фактором для высших организмов, пытающихся колонизировать их. Другие более распространены, например глубоководные экосистемы с низкими температурами (1-4С) и гидростатическим давлением в сотни атмосфер.
Среды с экстремальными значениями вышеупомянутых факторов все же населены различными формами жизни - экстремофилами, чаще прокариотными микроорганизмами, но иногда и эукариотами и даже макроорганизмами. Говоря об экстремофильных организмах, обычно используют понятие «нормальных» сред обитания для высших организмов, включая человека в качестве опорной точки. Имея антропоцентрическое мировоззрение, не стоит забывать, что «агрессивные» среды обитания иногда представлены довольно большим микробным сообществом, которое вполне приспособлено к жизни в «жестких» условиях жизни. Более того, для некоторых из них небольшое изменение условий среды в «нормальную» сторону ингибирует рост или является губительным [Seckbach, 2006].
Таким образом, практически любое местообитание Земли, совместимое со стабильностью биомолекул, заселено, по крайней мере, несколькими типами микроорганизмов, адаптированных к специфическим условиям данного биотопа и агрессивно или непригодно для других форм жизни.
Экстремофилов можно классифицировать согласно природе стресс-фактора, имеющего место в экосистеме (табл. 1). Многие из них являются высоко специализированными организмами, приспособленными к строго определенным сочетаниям условий, и имеют низкий уровень приспособляемости в случае их изменения. Так, экстремально галофильная бактерия Halobacterium salinarum [Pfeiffer et al., 2008] приспособлена к жизни в среде с содержанием солей 200-250 г/л и при понижении концентрации до 150 г/л лизируется. Некоторые экстремальные ацидофилы (например, Picrophilus) не выживает при непродолжительной экспозиции при рН 4 [Blochl, 1997; Schlepper et al., 1995]. Другие экстремофилы более гибки. Отдельные галофильные представители домена Bacteria (например, Halomonas и виды Chromohalobacter) способны к существованию в широком диапазоне концентраций соли от близких к 0 до практически насыщенных растворов [Огеп, 2002; Ventosa et al., 1998].
Для многих экстермофилов оптимально являются среды, в которых «агрессивен» больше чем один экологический параметр. Такие организмы можно назвать мульти - или полиэкстремофилы [Rothschild and Mancinelli, 2001]. Например, одноклеточная красная водоросль Cyanidium caldarium [Seckbach and Walsh, 1999] термоацидофильна и растет в средах с кислыми значениями рН (0,5-3,5) при повышенных температурах (до 57С), выживает в диапазоне солености от 3 до 10% [Pinto et al., 2004] и 1 н растворе H2SO4 [Allen, 1959], кроме того, хорошо развивается в атмосфере со 100% С02 [Seckbach and Walsh, 1999].
Интерес к адаптациям микроорганизмов к экстремальным условиям связан с выяснением вопросов происхождения жизни на Земле, ее поисками на других планетах, а также использованием их в качестве моделей для изучения способов стабилизации биомолекул и целых клеток при воздействии различных физико-химических факторов. Экстремофильные микроорганизмы могут служить для оптимизации промышленных процессов с их участием, а также быть объектами для создания новых биотехнологий. Помимо этого исследования механизмов приспособлений расширяет наши представления о многообразии используемых живыми организмами физиологических и биохимических механизмов.
Молекулярно-биологические методы
1.7.3 Молекулярно-биологические методы позволяют проводить исследование таксономической принадлежности микроорганизмов не только в культурах, но и в природных образцах, что делает возможным выявлять некультивируемые формы, минуя этап выделения [Wise et al., 1999]. Молекулярные подходы, привлекаемые для определения или идентификации метанотрофных бактерий в различных местообитаниях, можно разделить на прямые и косвенные. В основе прямых методов лежит специфическое обнаружение целых клеток in situ. Такую возможность дает идентификация искомых организмов посредством гибридизации клеток с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (fluorescent in situ hybridization - FISH) с последующим микроскопическим анализом (рис. 2). Метод не только позволяет детектировать организмы в образцах, но и дает возможность оценить филогенетическое разнообразие и количество клеток, а визуализация клеток позволяет оценить их морфологию и локализацию в субстратах.
На сегодняшний момент разработаны зонды разной степени специфичности, позволяющие получать данные о количестве и доле в биотопе представителей той или иной группы, рода или вида метанотрофов [Дедыш, 2006]. Однако только репрезентативнее популяции, составляющие не менее 0,1-1% общей численности поддаются выявлению методом FISH. Метанотрофные же организмы далеко не всегда являются столь значимым компонентом. Кроме того к ограничениям метода относится невозможность детекции покоящихся форм клеток, в том числе экзоспор и цист, формируемых метанотрофами.
Косвенные молекулярные методы имеют дело не с интактными клетками микроорганизмов, а с ДНК или РНК, выделенными из образца. Данная группа методов основывается на выявлении генов, являющихся молекулярными маркерами для данной группы микроорганизмов. При выборе молекулярных маркеров основываются на доступности последовательностей генов, в большом количестве представленных в базах данных. Самым широко используемыми филогенетическими маркерами являются:
а) ген, кодирующий 16s рРНК, выбор которого в качестве маркера основан на том, что данный ген присутствует у всех прокариот и является наиболее консервативным, изменения в его структуру вносятся редко, поэтому чем более филогенетически близки организмы между собой, тем меньше отличий в генах, кодирующих 16s рРНК. При описании новых организмов производится секвенирование гена 16S рРНК, с дальнейшим сравнением результатов с сиквенсами, полученными ранее.
Анализ гена, кодирующего 16S рРНК достаточен, когда устанавливается филогенетическая принадлежность чистой культуры в случае высокого сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК исследуемого образца и известных организмов. Таким образом, анализируя нуклеотидные последовательности этих генов, можно установить степень родства организмов (их филогенетическое положение).
б) изучение функциональных генов метаболических процессов, являющихся уникальными для физиологии и метаболизма определенной группы прокариот дает дополнительную информацию. Их наличие сужает область исследования до изучаемой группы и позволяет идентифицировать некультивируемых представителей групп с неизвестными последовательностями.
Для метанотрофов особенно часто применяются маркерные последовательности генов ртоА и ттоХ, кодирующие ключевые ферменты метаболизма метанотрофов - мембранную и растворимую метанмонооксигензу (гены рММО и sMMO), соответственно, или метанолдегидрогеназу (ген mxaF). [Троценко, Хмеленина, 2008].
Выявление этих генов позволяет в сложном сообществе сфокусироваться на конкретной физиологической группе микроорганизмов. Кроме того, по наличию тех или иных функциональных генов можно утверждать о существовании новых представителей данной физиологической группы, чего нельзя сделать на основе анализа гена, кодирующего 16s рРНК.
Методы, основанные на использовании ПНР (полимеразная цепная реакция), позволяют добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе), позволяя обнаруживать организмы, представленные в сообществе минорными компонентами (рис. 3).
По результатам End-point ПЦР можно говорить о наличие исследуемого организма в образце. ПЦР в режиме реального времени (qPCR) используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. Благодаря этому возможно определение количества копий искомого гена в исходном образце, что, к сожалению, не дает полной информации о количестве клеток исследуемых организмов. Применение условных коэффициентов для пересчета вносит существенную ошибку в результаты анализа, т.к. копийность генов метанотрофов является не только видоспецифичной, но и может варьировать в зависимости от стадии развития клетки [Auman et al., 2000].
Клонирование и метод ДГГЭ (денатурирующий градиентный гель-электрофорез) с последующим секвенированием и анализом позволяют установить филогенетическую принадлежность метанотрофных организмов, присутствующих в образце.
Гибридизация in situ с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH)
При использовании метода FISH применяли группо-специфичные зонды, меченные флуоресцентным красителем СуЗ. Синтез зондов выполнен компанией «Синтол» (Россия).
Образец (2 мл) обрабатывали ультразвуком (40 сек, 22 кГц) для десорбции микроорганизмов с поверхности частиц осадка. Полученную суспензию отстаивали (30 мин), затем центрифугировали (2000 об/мин в течение 2 мин). Дальнейшие операции проводили с супернатантом.
Фиксация образцов [Dedysh et al., 2001] проводилась по следующей процедуре:
1. Готовили 4% раствор параформальдегида в PBS буфере (NaCl - 8,0 г; КС1 - 0,2 г; Na2HP04 - 1,44 г; NaH2P04 - 0,2 г; Н20 - 1,0 л; рН 7,0). Для этого смешивали 10 мл PBS буфера и 0,4 г параформальдегида, инкубировали смесь на водяной бане при температуре (+65)-(+70С) до полного растворения параформальдегида, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
2. Клетки из 1,5 мл образца осаждали центрифугированием (8 мин, 12000 об/мин), сливали супернатант и ресуспендировали клетки в 0,5 мл PBS буфера.
3. К полученной суспензии добавляли 1,5 мл 4% параформальдегида, осторожно перемешивали смесь вращением пробирки, инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре.
4. Осаждали фиксированные клетки центрифугированием (12000 об/мин, 1 мин), супернатант сливали и двукратно промывали клетки PBS буфером.
5. Ресуспендировали клетки в 0,5 мл PBS буфера +0,5 мл 96% этанола. Полученные образцы хранили при -20С.
Гибридизация образцов с зондами [Stahl and Amann, 1991; Dedysh et al., 2001]: 1.2 мкл фиксированного образца наносили на предметные стекла для гибридизации с окошками, разделенные тефлоновым покрытием, распределяли суспензию наконечником пипетки. Для улучшения связывания клеток со стеклом стекла предварительно опускали в 0,1% водный раствор желатина (50-60С) и подсушивали. С той же целью после нанесения образца оставляли стекла на 1 -2 ч или ночь.
2. Готовили гибридизационный буфер из расчета 1 мл буфера на 8-10 лунок. Состав буфера различался в зависимости от концентрации формамида (табл. 9). 850 мкл буфера наносили на фильтровальную бумагу, выстилающую 50-мл пластиковый флакон, и помещали герметично закрытый флакон в термостат, прогретый до 46С. Эппендорф с оставшимися 150 мл буфера помещали на водяную баню (49С). 3. Предметное стекло с нанесенными образцами обрабатывали в градиенте концентраций этанола: 50%-80%-96% (по 3 мин в каждом), просушивали на воздухе (1-2 мин) и помещали в гибридизационный флакон на фильтровальную бумагу. Флакон закрывали и помещали в термостат на 15-20 мин.
4. На прогретое стекло наносили гибридизационный буфер (по 10 мкл на каждое окошко) и добавляли по 1 мкл раствора (50 нг/мкл) соответствующего олигонуклеотидного зонда (табл. 8). Стекло помещали обратно во флакон и инкубировали в термостате в течение 1,5-2 ч.
5. После гибридизации стекло вынимали из флакона и, используя 3-5 мл прогретого на водяной бане промывочного буфера (табл. 9), смывали буфер с зондом. Затем стекло помещали вертикально в пластиковый флакон с промывочным буфером, герметично закрывали и инкубировали на водяной бане (49С) 20 мин для удаления зонда, не связавшегося с клетками.
6. Стекло вынимали из флакона, осторожно промывали дистиллированной водой, подсушивали на воздухе. На каждое окошко наносили по 10 мкл 2 мкл раствора универсального, ДНК-специфичного флуоресцентного красителя ДАФИ (4 ,6 -диамидино-2-фенилиндол) и инкубировали в течение 10 минут в затемненном месте. Дистиллированной водой осторожно смывали остатки красителя и подсушивали стекло на воздухе.
Готовый препарат анализировали при помощи эпифлуоресцентного микроскопа «Axio Imager Dl» («Carl Zeiss», Германия).
ПЦР-ДГГЭ анализ фрагмента геяартоЛ
Филогенетический анализ транслированных аминокислотных последовательностей, полученных в 2008 г. показал, что все они образуют компактный кластер с последовательностями бактерий рода Methylothermus (рис. 6).
Для культуры К14 из источника Культурный (Сиквенс-тип 4) установлена высокая степень сходства с термофильным метанотрофом НВ [Bodrossy et al., 1999].
Остальные последовательности образовали три сиквенс-типа, продемонстрировавшие сходство с Methylothermus thermalis из горячего источника Японии [Tsubota et al., 2005] и М. subterraneus из горячих подземных водоносных слоев золотодобывающих рудников Японии [Hirayama et al., 2011]. Сиквенс-тип 1 состоял из последовательностей фрагмента гена ртоА накопительной культуры К8 (Глаз Дракона), в сиквенс-тип 2 входили последовательности накопительных культур из донного ила источников Глаз Дракона (К7) и Строма (К 12), а также культуры К8, а в сиквенс-тип 3 -накопительной культуры К11, полученной из ила, отобранного в источнике Строма.
Для обогащенных образцов 2010 г. из 8 источников, в которых был успешно амплифицирован продукт фрагмента гена ртоА ожидаемого размера, проведено разделение смеси ампликонов методом ДГГЭ. Количество характерных полос для каждого образца составляло не более трех, что может служить свидетельством низкого разнообразия метанотрофов. Исключением стал образец из источника Строма, где в полиакриламидном геле было зафиксировано 8 отдельных четких полос. Однако после реамплификации и сиквенса материала этих полос все полученные последовательности оказались одинаковыми (100% идентичности транслированных белковых последовательностей) и проявили высокое сходство с последовательностями Methylothermus subterraneus [Hirayama et al., 2011].
Филогенетический анализ показал, что в четырех источниках района озера Фумарольное (Культурный, Терра, Строма, Квадрат - последовательности Kul9-04, Т20-11, S21-05, Kv22-14, соответственно) присутствуют метанотрофы, наиболее близкие к представителям рода Methylothermus (рис. 7). В пробах из источников Культурный (последовательность Ки 19-04) и Квадрат (Kv22-14) идентифицированы метанотрофы, проявившие сходство с утраченным в культуре термофильным метанотрофом НВ [Bodrossy et al., 1999], но, тем не менее, значительно отличающиеся от него (около 90% идентичности). Один из двух метанокисляющих организмов из источника Терра (Т20-11) оказался достаточно далеким родственником как термофильного метанотрофа НВ, так и валидно описанных метанотрофов рода Methylothermus. Для метанотрофа из образца Строма (S21) ближайшим родственником оказался Methylothermus subterraneus, выделенный из горячих (69С) подземных водоносных слоев золотодобывающих рудников Японии. В образцах из источников Терра и Глаз Дракона были обнаружены последовательности Т20-10 и DY23-25, наиболее близкие к некультивируемым представителям рода Methylomonas (65-70% сходства), что для высокотемпературных источников показано впервые.
Исследования, проведенные с помощью системы праймеров A189F и A682R и протокола амплификации со сниженной температурой отжига для уменьшения специфичности праймеров [Pol et al., 2007], не выявили присутствия в высокотемпературных источниках с низкими значениями рН (Извилистый - №15, Комета - №17, Сборный - №18) метанокисляющих Verrucomicrobia, ранее найденных в сходных условиях. В то же время, в данных источниках были обнаружены метанокисляющие организмы, относящиеся к Gammaproteobacteria. Во всех трех источниках ближайшим культивируемым родственником выявленных нами метанотрофов (последовательности Iz 15-23, Kml7-18 и Sb 18-21) была гаммапротеобактерия Methylomonas methanica (рис. 7). В источнике Комета был также обнаружен второй метанокисляющий организм (Кт17-22), проявивший наибольшее сходство с Methylobacter tundripaludum (рис. 7).
Проведенный анализ разнообразия метанотрофов на основе анализа фрагментов генов ртоА выявил существенные различия в их составе для разных источников. Для выяснения возможных причин этих различий был проведен сравнительный анализ физико-химических и геохимических показателей, а также микробного разнообразия гидротерм Строма, Глаз Дракона, Культурный и ручья Извилистый (табл. 10). В двух из них - Строма и Культурный, характеризовавшихся высокими показателями значений температуры и рН, были обнаружены метанотрофы, проявившие высокое сходство с разными представителями рода Methylothermus. В источнике Культурный, отличающемся низкой минерализацией, был обнаружен метанотроф, наиболее близкий к Methylothermus НВ, выделенному из горячего источника Венгрии.
В то же время, в источнике Строма с такими же физико-химическими характеристиками, но высоким содержанием сульфатов, был обнаружен другой метанотроф, ближайшим родственником которого оказался Methylothermus subterraneus. В образце из источника Глаз Дракона был обнаружен метанотроф, проявивший наибольшее сходство с некультивируемыми представителями рода Methylomonas.
По своим физико-химическим характеристикам источник Глаз Дракона (59,8С; рН 6,2) был близок к источникам Культурный и Строма и имел высокий уровень минерализации. Особенно высоко оказалось содержание ионов хлора, натрия и калия, отмечено присутствие минеральных соединений азота - аммония и нитрата. Анализ обогащенного образца из ручья Извилистый обнаружил присутствие в нем организма, ближайшим культивируемым родственником которого была бактерия Methylomonas methanica. Этот ручей отличался не только умеренными. значениями температуры и экстремально низкими значениями рН, но и высокой степенью минерализации.
Нам не удалось обнаружить представителей метанотрофных Verrucomicrobia в исследованных кислых источниках. Возможно, их количество было ниже предела детекции ПЦР, или последовательность их гена ртоА настолько сильно отличается от таковой у протеобактерий, что существующие праймерные системы не могут успешно применяться даже при использованной нами процедуре снижения их специфичности.
Впервые обнаружено присутствие метанотрофных Gammaproteobacteria в термальных экосистемах с экстремально низкими значениями рН (2,6-2,8). В настоящее время описан только один ацидотолерантный метанокисляющий организм I типа, Methylomonas paludis, выделенный из сфагнового болота (рН 3,9) северо-восточной части России [Danilova et al., 2013].
Таким образом, горячие источники, в которых были обнаружены метанотрофные бактерии, образуют две группы - высокотемпературные нейтральные гидротермы в районе оз. Фумарольное, в которых обнаружены организмы, близкие к Methylothermus, и кислые источники с умеренными значениями температуры, располагающиеся вдоль ручья Извилистый, в которых присутствовали бактерии, отдаленно сходные с Methylomonas и Methylobacter.
