Введение к работе
Актуальность проблемы
Термофильные и гипертермофильные микроорганизмы представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп экстремофильных микроорганизмов Продуцируемые ими ферменты, так называемые термозимы (Zeikus et al 1998), имеют ряд биотехнологических преимуществ перед мезофильными аналогами прохождение ферментативных реакций при высоких температурах позволяет работать с более высокими концентрациями субстрата из-за снижения вязкости раствора и увеличения коэффициентов диффузии, снижается риск побочных процессов тк большинство микроорганизмов, способных оказать нежелательное влияние на протекающие реакции, гибнут при температурах выше 70С, термостабильные ферменты, главным образом выделенные из архей, зачастую обладают повышенной устойчивостью к денатурирующим агентам, например, растворителям, детергентам (Bruins et al 2001, Eichler, 2001, Egorova & Antramkian, 2005) Кроме того, упрощается очистка термозимов, клонированных и экспрессированных в мезофильных микроорганизмах, от остальных белков клеток хозяина благодаря возможности проведения термообработки, при которой многие мезофильные белки денатурируют (Brums et al 2001, Vieille и Zeikus, 2001, Bertoldo et al, 2004)
К настоящему моменту известно довольно большое число термофильных микроорганизмов, обладающих гидролитической активностью Среди них продуценты гликозидаз умеренно-термофильные амилолитические бактерии Bacillus sp (Knslman & Chandra, 1983, Gupta et al, 2003), архей Thermococcus profundus (Chung et al 1995) Pyrococcus sp (Egorova & Antranikian, 2005), термофильные целлюлолитические бактерии Rhodothermus marinus, Acidithermus cellulolyticus, Caldibacillus cellulovorans (Bergquist et al, 1999), Caldicellulosintptor и Dwtyoglomus spp , археи с ксиланолитической активностью Thermococcus zilligu (Uhl & Daniel, 1999), Pyrodictium abyssi (Andrade et al, 2001), растущая на агарозе термофильная бактерия 'Caldancterobacter uzonensis' (Kozina et al, в печати) и др Термофильные протеолитики представлены бактериями родов Thermoanaerobacter, Thermus, Fervidobactenum и др и археями родов Desulfurococcus, Thermococcus, Pyrococcus, Aeropyrum и др Большинство из них растут и используют в качестве источника углерода и/или энергии пептиды благодаря наличию внеклеточных протеаз (в большинстве случаев относящихся к щелочным субтилизин-подобным сериновым протеиназам), активных в широких диапазонах значений рН (Klmgeberg et al, 1995, Ward et al, 2002) и температур Лишь немногие способны использовать в качестве субстрата белки, при гидролизе которых образуются пептиды, используемые другими органотрофными микроорганизмами
Области применения гидролаз, такие как текстильная и бумажная промышленность, выходящая в последнее время на передний план переработка отходов различной природы, и др постоянно расширяются, в связи с чем существует потребность в новых гидролазах, более эффективных, нежели имеющиеся, или обладающих новыми свойствами
Вместе с тем исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов в термальных местообитаниях показывают, что большое число термофильных микроорганизмов до сих пор не получено в лабораторных культурах, и, следовательно, их свойства неизвестны (Barns et al, 1996, Hugenholtz et al, 1998) Среди новых термофильных прокариот могут оказаться и организмы с новыми, биотехнологически привлекательными свойствами Таким образом, поиск новых термофильных микроорганизмов-гидролитиков остается актуальной проблемой исследований как с научной, так и с прикладной точки зрения
Цели и задачи исследования
Целью работы было обнаружение, выделение и изучение анаэробных термофильных микроорганизмов-гидролитиков, а также их ферментов
Задачи исследования состояли в следующем:
-
Изучение филогенетического разнообразия термофильных микроорганизмов-гидролитиков из горячих источников кальдеры Узон
-
Выделение и характеристика чистых культур анаэробных термофильных гидролитиков
-
Характеристика термостабильных гидролитических ферментов, продуцируемых новыми изолятами
Научная новизна и практическая ценность работы
Опробованный метод получения накопительных культур в условиях in situ с добавлением различных нерастворимых и слаборастворимых биополимерных субстратов является действенным методом накопления гидролитических микроорганизмов
Определение филогенетического положения наиболее
многочисленных микроорганизмов, населяющих полевые накопительные культуры показало, что в них, помимо представителей уже известных родов бактерий, присутствуют термофильные археи, ранее известные исключительно по природным клонам
Выделены и охарактеризованы новые целлюлолитические
термофильные бактерии Caldicellulosiruptor hydrothermalis,
Caldwellulosiruptor kronotskyensis и Dictyoglomus sp штамм 1521-1, первая агаролитическая бактерия рода Dictyoglomus - штамм 1507-9, протеинолитические бактерии Caldanaerobacter proteolyticus и Thermoanaerobacter sp штамм 1004, протеинолитическая архея
Desulfurococcus kamchatkensis, являющаяся первым идентифицированным представителем отдела Crenarchaeota, растущим на кератине
Показана способность протеиназ из Caldanaerobacter proteolytics и Thermoanaerobacter sp разрушать трудногидролизуемый белок кератин Такие свойства обеих кератиназ как активация додецилсульфатом натрия (ДСП), а также остаточная активность в присутствии растворителей, являются новыми для термофильных кератиназ
Выделенные нами кератиназы ввиду их исключительной активности в присутствии ДСН могут найти широкое применение в качестве добавок к моющим средствам Также привлекательна возможность их использования в качестве биодеградирующих агентов для разложения различных трудногидролизуемых белков, в том числе кератинов
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии», 2003, «Thermophiles», 2003, «Extremophiles», 2004, «Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова», 2004, «Archaea Meeting», 2005, «Biodiversity, molecular biology and biochemistry of thermophiles», 2005, «Химия протеолитических ферментов», 2007
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 12 работ 1 экспериментальная статья, 7 тезисов научных конференций и 4 статьи находятся в печати
Место проведения работы
Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С Н Виноградского РАН и в лаборатории функций и взаимодействий белков молока Национального Института Сельскохозяйственных исследований (INRA), г Нант при докторантуре Университета Нанта, Франция
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и включает 42 рисунков и 13 таблиц Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 141 наименование