Введение к работе
Актуальность проблемы.
Оксид углерода - СО - широко известен как высоко токсичный газ для человека и животных. СО - один из важных малых газов атмосферы. Он присутствует в атмосфере в концентрации 0.06-0.15 ppm (IPCC). Значение СО определяется тем, что его участие в фотохимических реакциях в тропосфере приводит к усилению парникового эффекта (Cratzen, 1974, Bergamaschi et al., 2000). Предполагается, что атмосфера ранней Земли содержала СО в значительной концентрации (Holland, 1984; Kasting, 1990; Kharecha et al., 2005); ряд гипотез приписывает СО важную роль в происхождении жизни (Pinto et al., 1980; Chameides and Walker, 1981; Wachtershauser 1997; Miyakawa et al, 2002; Martin and Russel 2004). Аналогами древних биоценозов считаются современные сообщества гидротерм (Заварзин, 1984; Stetter, 2006). Источниками СО в гидротермах являются вулканические газы, которые могут содержать до нескольких % СО по объему (Соколов, 1971; Symonds et al., 1994). СО также может быть продуктом термического разложения органического вещества (Conrad and Seiler, 1985; Schade et al., 1999; Hellebrand and Schade, 2008) и промежуточным метаболитом микробного синтеза или разложения ацетил-КоА по пути Вуда-Льюнгдаля (Conrad and Thauer, 1983; Diekert et al,1984; Eikmans et al, 1985; Ragsdale, 2004).
Окисление CO микроорганизмами было открыто в начале прошлого века (Bejerinck & van Delden, 1903; Kaserer, 1906). Аэробное окисление СО карбоксидобактериями по реакции: 2СО + 02 = 2С02 подробно изучено (Ножевникова, 1974; Заварзин, 1977; Meyer et al., 1986; Conrad, 1996; King & Weber, 2007). Среди аэробных кар бокси до бактерий известно несколько умеренных термофилов (Lyons et al., 1984; Meyer and Schlegel, 1983; Kraeger and Meyer 1984; Gadkari et al., 1990). До начала нашей работы было известно, что некоторые анаэробы - ацетогены, метаногены и сульфатредукторы - могут использовать СО как субстрат для роста с образованием ацетата, метана или сероводорода, соответственно. Среди них было известно лишь несколько термофильных представителей (Savage et al., 1987; Diekert & Thauer, 1978; Daniel et al., 1990; Daniels et al., 1977). Кроме того, был выделен один штамм мезофильной фототрофной несерной пурпурной бактерии Rhodocyclus (Rubrivivax) gelatinosus, способный расти в темноте в анаэробных условиях за счет окисления СО до СОг, сопряженного с восстановлением воды до водорода (Uffen, 1983). В 1990 г. В.А. Светличным в гидротермальных местах обитания
Курильских островов были обнаружены анаэробные СО-окисляющие бактерии с новым для термофилов типом метаболизма, использовавшие для роста энергию реакции: СО + ЩО = С02 + Щ (AGo= - 20 кДж/моль) (Светличный и др., 1990; Svetlicnhy et al., 1991). К началу наших исследований ничего не было известно о филогенетическом и физиологическом разнообразии водородобразующих (гидрогеногенных) СО-окисляющих (карбоксидотрофных) прокариот, их распространении в гидротермальных местах обитания и роли в микробных сообществах гидротерм.
Интерес к термофильным гидрогеногенным карбоксидотрофным прокариотам носит и прикладной характер. Гидрогеногенные карбоксидотрофы могут быть использованы для получения высокоочищенного водорода при переработке синтез-газа. Синтез-газ, получаемый в результате паровой конверсии природного газа или газификации угля, является наиболее дешевым сырьем для получения водорода и содержит от 29 до 76 % водорода и от 5,6 до 60 % СО. Водород - экологически чистое средство аккумулирования, транспортировки и потребления энергии. Переработка синтез-газа с участием микроорганизмов, образующих водород как один из продуктов, может значительно увеличить выход водорода и одновременно избавляет от токсичного компонента - СО. Помимо этого, СО-трофы, как и все термофильные микроорганизмы, являются потенциальными источниками новых термостабильных ферментов.
Цели и задачи исследования. Целью представленного исследования являлось изучение термофильных гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот: их физиологического и филогенетического разнообразия, распространения в различных гидротермальных местах обитания, их роли в микробных сообществах гидротерм.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие
задачи:
-
характеристика исследуемой группы и определение активностей предполагаемых ключевых ферментов метаболизма СО у термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот;
-
обнаружение термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в разнообразных по физико-химическим параметрам и географическому положению наземных и глубоководных гидротермах;
-
определение скорости и основных продуктов трансформации СО микробными сообществами горячих источников;
-
определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в горячих источниках;
(5) выделение и характеристика микроорганизмов, осуществляющих анаэробную трансформацию СО в горячих источниках;
Научная новизна работы. Впервые с помощью разработанного нами радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной СО трансформации в горячих местах обитания. Определены основные продукты микробной трансформации СО.
Показано физиологическое и филогенетическое разнообразие термофильных гидрогеногенных кар бокси дотрофных прокариот, их широкое распространение в разнообразных гидротермальных местах обитания.
Описана новая физиологическая группа анаэробных термофильных прокариот. Узаконены новый класс, новое семейство, 5 новых родов, 8 новых видов. В типе Firmicutes описан новый класс Thermolithobacteria, включающий семейство Thermolithobacteriales и новый род Thermolithobacter, содержащий два вида Т. carboxydivorans и Т. ferrireducens. Выделены и описаны новые роды Carboxydothermus, Thermincola, Carboxydocella, Thermosinus. Выделены гидрогеногеннные карбоксидотрофные представители рода Dictioglomus и типов Euryarchaeota и Crenarchaeota: Thermococcus АМ4 и новый вид "Thermophilum carboxydotrophus ".
Впервые было показано наличие и высокая активность ферментов метаболического пути Вуда-Льюнгдаля: формиатдегидрогеназы, гидрогеназы, СО дегидрогеназы, фолатных соединений в бесклеточном экстракте представителя гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот С. hydrogenoformans. Обнаружена высоко термостабильная СО дегидрогеназа.
Практическая значимость работы. Разработан аналитический метод нехроматографического разделения газовой смеси метана и СО, и радиоизотопный метод количественного определения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами. Создана коллекция новых термофильных микроорганизмов, которая может быть использована для целей биотехнологии. Экстремально термофильные бактерии и гипертермофильные археи являются потенциальными продуцентами термостабильных ферментов. Умеренно термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты представляют большой интерес как потенциальные агенты для переработки синтез-газа с целью получения водорода.
Личный вклад соискателя. Цикл работ, составляющих диссертационную работу, был начат автором как работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук под руководством академика РАН профессора Г. А.
Заварзина. В дальнейших исследованиях, составляющих данную диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщения полученных результатов. Автор принимал личное участие в организации и реализации научных экспедиций в районы гидротермальной активности: Баргузинский и Кроноцкий Национальные Заповедники. В работах, выполненных в соавторстве, вклад соискателя заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования, - от постановки задач и проведения конкретных экспериментов до обсуждения полученных результатов и подготовке их к публикации.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Thermophily today. International meeting on cell constituents, genetics and biotechnological applications of thermophilic microorganisms" - 1990, "Extremophiles 2000", "15th International Symposium of Environmental Biogeochemistry" - 2001, "Thermophiles 2001", «Astrobiology in Russia» - 2002, "Extremophiles 2002", "Extremophiles 2004", "Thermophiles 2005", "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles" - 2005, The 2n FEMS congress of European microbiologists - 2006, The 11 International Symposium on Microbial Ecology - 2006, "Extremophiles 2006", "Thermophiles 2007", The 181 International Symposium on Environmental Biogeochemistry - 2007 и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005».
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 49 печатных работах, включая 19 экспериментальных работ, 3 главы в Bergy's Mannual, З обзора, 24 тезисов конференций.
Место проведения работы. Работа проводилась с 1991 по 1996 гг. в Лаборатории микробных сообществ и с 1996 по 2008 гг. в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ РАН).
Радиоизотопные исследования проводились в Лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов ИНМИ РАН. Секвенирование последовательностей 16S рДНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре Биоинженерии РАН, в Центре Морской Биотехнологии, Балтимор, США, факультете биологии Университета Портлэнда, США. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автор приносит искреннюю благодарность академику РАН Г.А. Заварзину и д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за постоянное внимание, помощь и интерес к
работе. Автор глубоко благодарен за помощь и поддержку на начальном этапе работы В.А. Светличному и д.б.н. М.А. Пушевой. Автор выражает глубокую признательность Н. А. Черныху, А.В. Лебединскому, Т.В. Слеповой, Н.А. Кострикиной, Т.П. Туровой, Т.В. Колгановой и A.M. Лысенко (ИНМИ РАН), д.г.-м. н. Г.А. Карпову (Институт вулканологии и сейсмологии ДВО РАН), проф. Фрэнку Робу (Центр Морской Биотехнологии, Балтимор, США) за предоставленные пробы из Иеллоустонского Национального Парка и глубоководные пробы из гидротерм Окинавской впадины. Автор выражает глубокую признательность всем соавторам за сотрудничество, а также сотрудникам и аспирантам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ за дружескую поддержку и участие.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 240 страницах машинописного текста и включает 35 рисунков и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 52 русских и 197 английских наименований.
