Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Основные свойства бактерий рода Listeria 11
1.2. Пищевые продукты, как факторы передачи листериозной инфекции 18
1.2.1. Овощи 19
1.2.2. Рыба и морепродукты 21
1.2.3. Мясо и мясопродукты 23
1.2.4. Молоко и молокопродукты 26
1.3. Корма, как основной источник заражения животных листериозом 33
1.4. Методы индикации листерий в пищевых продуктах 34
Глава 2. Экспериментальная часть 40
2.1. Материалы и методы 40
2.1.1. Штаммы. Сыворотки 40
2.1.2. Среды 42
2.1.3. Бактериофаги. Определение вирулентности 43
2.1.4. Пищевые продукты 44
2.1.5. Техника обработки патологического материала 46
2.1.6. Получение листериозных сывороток для типирования листерий, выделенных из пищевых продуктов 46
2.2. Сравнительное исследование свойств различных видов листерий 47
2.3. Исследование продуктов животноводства на наличие листерий 55
2.3.1. Молоко с молочно-товарных ферм Саратовской области 55
2.3.2. Мясо, фарш мясной, отобранные из хозяйств, с рынков и магазинов г. Саратова 62
2.4. Изучение динамики размножения листерий в различных пищевых продуктах 67
2.4.1. Сыры 67
2.4.2. Мясной фарш 72
2.5. ПНР - экспресс метод для индикации листерий в пищевых продуктах 74
2.5.1. Методика применения ПЦР для исследования пищевых продуктов ...74
2.5.2. Результаты исследования пищевых продуктов методом ПЦР 78
Заключение 83
Выводы 89
Список использованных литературных источников 91
Приложения 106
- Рыба и морепродукты
- Методы индикации листерий в пищевых продуктах
- Сравнительное исследование свойств различных видов листерий
- Методика применения ПЦР для исследования пищевых продуктов
Введение к работе
Актуальность работы
До 1960 года листериоз рассматривался в основном как ветеринарная проблема. Однако с 60 гг. постепенно стало ясно, что листериоз встречается гораздо чаще, чем было принято считать. Люди заражаются не только при уходе за больными животными, но и алиментарным путём, а сама инфекция должна рассматриваться не как зооноз, а как 'зооантропоноз или пищевой зооноз. В последнее время её трактуют как сапроноз. С 1960 по 1982 годы только в медицинской литературе было описано более чем 10000 случаев листериоза, и тысячи публикаций ежегодно свидетельствуют об актуальности данной проблемы (Rocourt, Jacquet, Reilly, 2000).
Листериоз - антропозооноз, характеризующийся полиморфизмом клинических проявлений, однако чаще всего он протекает с признаками поражения центральной нервной системы, органов размножения, септицемии, а также в форме бессимптомного носительства.
По данным Международной классификации болезней 10 пересмотра, принятой 43 Всемирной Ассамблеей Здравоохранения в рубрику A32 "Листериоз" была включена подрубрика "Листериозная пищевая инфекция" с доминированием алиментарного механизма заражения (Intern, statist, classif., 1992).
Следовательно, и роль листерий в инфекционной патологии человека претерпела значительные изменения. Во-первых, этому способствовал прогресс в области лабораторной и клинической диагностики, а во-вторых -антропогенная трансформация окружающей среды, влияющая на условия репродукции возбудителя, пути передачи инфекции и на восприимчивость различных групп риска, прежде всего связанных с различными видами иммунодефицитов (Опочинский и др., 1999).
Сегодня листериоз - это одна из важнейших пищевых инфекций, которая зарегистрирована в 82 странах мира, в том числе и в России. Ежегодно иозоареал листериоза охватывает до 40 стран в мире, причём в Европе в среднем 20 стран, в Азии - 6, Австралии и Океании - 3, Северной Америке — 6, Южной Америке - 3, в Африке - 4 страны (Книзе, Бузун, Шарма, 1999).
Важным аспектом в рассматриваемой проблеме является разнообразие клинических проявлений данной инфекции, а также высокая летальность при ней. Листериоз является болезнью с высоким процентом гибели — до 62% .
У животных листериоз характеризуется энцефалитами, абортами, маститами, септицемией.
Листериоз у людей проявляется в следующих клинических формах: аборты и мертворождения у беременных женщин; септицемия и менингоэнцефалиты у новорождённых детей; глазо - железистая и ангинозно -железистая формы у подростков; листериозный сепсис у новорождённых; ангины; менингоэнцефалиты, урогенитальная патология у взрослых.
Доминирующим проявлением инфекционного состояния при листериозе является здоровое носительство (Котляров и др., 1999). Бессимптомное кишечное носительство листерий установлено по разным источникам у животных и людей в 5-60 % случаев (Бакулов, 1993). Стресс, угнетение иммунного статуса или другие неблагоприятные факторы способствуют манифестации инфекции различными клиническими признаками (Котляров, 1999).
Одним из основных принципов профилактики листериоза у людей и животных является постоянный контроль качества продуктов питания и кормов. До недавнего времени в России не было нормативных законодательных актов, о необходимости бактериологического контроля пищевых продуктов на этот микроорганизм.
Утверждённое Минздравом России дополнение № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.560-96 регламентирует уровень контаминации пищевых -7-продуктов листериями, нормой считается отсутствие Listeria monocytogenes в 25 г различных пищевых продуктов. В Саратовской области до последнего времени пищевые продукты на L. monocytogenes не исследовались.
Предпосылкой к выполнению нашей работы было сообщение Л.В. Савельевой (Савельева, 1999), которая при исследовании рыночного молока в Саратове и Энгельсе обнаружила в 1,97% проб Listeria monocytogenes; в 0,98% листерии оказались вирулентными в коньюнктивальной пробе на морских свинках.
Цель диссертационной работы - выяснение роли молока и мяса в передаче листериозной инфекции на территории Саратовской области.
Задачи исследования:
1. Провести исследование молока и молочных продуктов в хозяйствах области и объектах розничной торговли г. Саратова на L. monocytogenes.
Провести исследование мяса и продуктов переработки мяса в хозяйствах области и магазинах г. Саратова на L. monocytogenes.
Применить ПНР при исследовании молочных и мясных продуктов на наличие листерии.
Научная новизна
Доказано наличие L. monocytogenes в молоке коров из различных хозяйств Саратовской области в 4,26%.
Установлено присутствие L. monocytogenes в 14,28 % образцах мяса и мясопродуктов с рынков г. Саратова и ряда хозяйств области. Часть изолированных штаммов (3,57 %) были вирулентными.
3. Продемонстрирована высокая эффективность полимеразной цепной реакции (ПНР) по сравнению с бактериологическим методом при индикации L. monocytogenes в животноводческой продукции. -8-Практическая значимость
Показано, что мясо, мясные полуфабрикаты, молоко и молочные продукты из хозяйств и рынков Саратовской области, а также из сети розничной торговли довольно часто инфицированы листериями (4,26 - 27,77%), т.е. могут являться вероятными причинами листериозной инфекции.
В Татищевском районе выявлено хозяйство ГСП «Кологривовское», стойко неблагополучное по листериозу.
Изучены свойства других видов листерий (L. monocytogenes серовары 7, 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, ЗЬ, Зс, 4а, 4ab, 4b, 4с, 4d, 4е; L. ivanovii серовар 5; L.murray; L. innocua серовары 6а и 6Ъ; L. grayi).
Установлено, что сроки выживания L. monocytogenes в сырах мягких сортов и мясном фарше колеблются от 7 до 17 дней.
ПНР является высокоточным методом индикации листерий в молоке и мясе и может быть использована для быстрого обнаружения L. monocytogenes в этих продуктах.
Полученные результаты работы дают полное основание для углубленного изучения распространения листериоза у животных на территории Саратовской области, а также для налаживания контроля пищевых продуктов на наличие листерий согласно Утверждённому Минздравом России дополнению № 1010-01 от 01.04.2001 года к СанПин 2.3.2.560-96.
По результатам исследований подготовлены «Методические рекомендации по применению полимеразной цепной реакции для индикации листерий в продуктах животноводства», утвержденные УМС ИВМиБ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (протокол № 54 от 03.09.03).
Материалы диссертации нашли применение при чтении лекций и проведении практических занятий по теме листериоз на кафедре микробиологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ». -9-Основные положения, выносимые на защиту
1. Показана значительная обсемененность L. monocytogenes животноводческой продукции из различных хозяйств и объектов розничной торговли Саратовской области. 2. В ГСП «Кологиривовское» Татищевского района выявлен стойкий очаг листериоза свиней и КРС, требующий санации.
3. Сроки выживаемости листерий в животноводческой продукции (сыры мягких сортов, мясной фарш) колеблются от 7 до 17 дней и зависят от вида продукта и температуры хранения.
4. ПЦР рекомендуется как экспресс метод для индикации L. monocytogenes в молоке и мясе.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены на «Научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ по итогам научно-исследовательской работы за 2001-2002 гг., на Юбилейной научной конференции СГАУ им. Н.И. Вавилова, 2003г., а' также на Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» Покров, 2003г.
Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2001-2003 гг.
Публикации
Основное содержание работы отражено в 6 работах.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложения. Работа -10-изложена на 107 страницах, иллюстрирована 8 рисунками и содержит 12 таблиц. Список использованных литературных источников включает 152 наименования, в том числе 60 зарубежных.
Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» в соответствии с плановой тематикой: «Разработка и внедрение эффективных методов дифференциальной диагностики туберкулёза, кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулёза, листериоза и лейкоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области» (2001). «Роль сельскохозяйственных животных в распространении некоторых бактериальных и вирусных инфекций в Саратовской области» (2002).
Рыба и морепродукты
В Новой Зеландии в 1980 году в результате употребления в пищу сырой рыбы и моллюсков заболело 20 человек, летальность при этом составила 25%. Выделенная культура была идентифицирована как L.monocytogenes (серовар 1/2 b) (Lennon et al., 1984). В розничной торговле Японии был произведён осмотр и отбор проб на определение уровня контаминации продуктов листериями. Л истерии были изолированы в 5,4 % из 92 образцов копчёного лосося, в 3,3% из 213 готовых к употреблению морепродуктов (Satoshi Inoue et al., 2000). Уровень контаминации листериями импортированных в Канаду морепродуктов в 1996-1997 и 1997-1998 был равен 0,88 %и 0,3 % соответственно (Беленева, Быстрова, 1997). Во Франции (Nicolas et al., 1989) при изучении степени обсеменения пресноводных рыб микроорганизмами рода Listeria исследованы 54 пробы рыбы, отобранной в основном из розничной торговли. Выделены штаммы сероваров 4Ь и 1/2 а из 3 проб, a L.innocua из 8 отобранных проб. В Исландии (Hartemin Ralf, Georgsson Franklin, 1991) исследовали 128 видов продуктов моря и салаты из них на наличие L.monocytogenes и других видов Listeria. Листерии обнаружили в 56% проб сырой рыбы, в 29% копчёной рыбы, в 9% креветок, в 32% проб рыбных салатов. Т. Jammi (Farber, 2000) исследовал 496 проб рыбы горячего копчения (треска, угорь, сельдь, форель, макрель), 324 пробы рыбы холодного копчения (палтус, пикша, лосось), 89 проб ферментированной рыбы (лосось, сельдь) и установил, что 111 образцов оказались контаминированы листериями. У рыб горячего копчения данный показатель составил 8,9%, холодного копчения — 13,6%, ферментированной рыбы - 26 % образцов (Бакулов, Васильев, 1995). В заливе Петра Великого Японского моря из морских животных было выделено 12 штаммов, по своим свойствам не отличающихся от референс-штаммов L.monocytogenes (Беленева, Быстрова, 1997).
Причиной заражения может быть, как мясо, полученное от больных животных, так и мясо, обсеменённое по ходу технологического процесса. Контаминация мясных продуктов в технологическом процессе может быть значительной и играет весьма важную роль. Так, согласно сведениям, полученным Lowry, Tiong (1988), при исследовании мясного фарша листерии были выделены в 95% случаев, a Farber et al. (1988) индицировали листерии в мясных продуктах готовых к употреблению, в 33% случаев (Farber et al., 1989; Lovettetal., 1990).
Мясо от животных больных листериозом получают на санитарных бойнях мясокомбинатов, поскольку согласно правил ветеринарно-санитарной экспертизы использование мяса, полученного от таких животных, не выпускается в свободную реализацию, а подлежит дальнейшей термической обработке. Однако большую опасность представляет скрытое листерионосительство, когда у животных отсутствуют все клинические признаки болезни. Такие животные, попав на мясокомбинат, убиваются в общем порядке и полученные от них продукты питания идут на реализацию без ограничения, представляя собой непосредственную угрозу, а также являются дополнительным источником обсеменения других пищевых продуктов.
Не менее опасными в этом отношении являются продукты быстрого приготовления (гамбургеры, "хот-доги", котлеты); которые не подвергаются достаточной термической обработке. При сегодняшнем мобильном ритме жизни эти продукты питания являются наиболее удобными в условиях мегаполиса. Однако приготовление "фастфуд" на гриле или в микроволновой печи не всегда гарантирует надлежащее санитарное качество, и часто являются одной из причин пищевого листериоза (Васильев, 1998). Высокая терморезистентность листерии обуславливается двумя факторами, во- первых их внутриклеточным паразитизмом, во-вторых феноменом теплового шока, когда медленное постепенное нагревание (молока, бульона, мяса и т.д.) до сублетальных температур повышало устойчивость листерий при дальнейшей термообработке (Тартаковский, Малеев, Ермолаева, 2002).
Бактерии этого вида обладают довольно высокой устойчивостью при температурах пастеризации и варки колбасных изделий, которая также зависит от температуры и продолжительности экспозиции (Костенко, Янковский, Шагова, 1999).
P.Karaioannpglan (1980) установил, что прогревание мясных фрикаделек до температуры 85С в течение 15 минут не инактивирует листерий. При варке куска мяса, контаминированного листериями, массой 2,5 кг и толщиной не более 10 см, микроорганизмы погибают через 1 час. По данным М.П. Бутко (1983) при производстве варёной колбасы, когда температура воды достигает 75-85С, листерий погибают через 75 минут в батоне диаметром 35-50 мм и через 90 минут в батоне диаметром 65мм. Особый интерес представляет способность "лъстерий к репродукции при довольно низких температурах, именно поэтому их называют "микробами холодильника". Коварность этой инфекции состоит в способности листерий к накоплению в пищевых продуктах при температуре холодильника. Эта особенность листериозной палочки получила отражение в трудах многих учёных. Листерий сохраняются в баранине при -Ю...-28С в течение 20 суток, в свинине при -10... -20С - 14 месяцев. При длительном хранении мяса, контаминированного листериями при низких температурах (-16...-18С) число листерий быстро уменьшается в первые 1-3 месяца. Однако даже через 9 месяцев хранения листерий полностью не уничтожаются (Костенко и др., 1999).
Методы индикации листерий в пищевых продуктах
Бактериологический метод является традиционным в микробиологической практике. Однако при использовании его для исследования продуктов питания и кормов возникает ряд трудностей, связанных с сильной обсеменённостью этих объектов непатогенной или условнопатогенной микрофлорой.
"Метод холодового культивирования", впервые предложенный М. Грей, позволяет не только затормозить рост посторонней микрофлоры, но и способствует кумуляции листерий в процессе культивирования. Сущность метода заключается в выдерживании исследуемого материала в холодильнике при +4+6 С длительное время. Первый высев делают через 2-3 недели от начала хранения, а затем еженедельно. Этот метод эффективен, но весьма продолжителен (до 3-6 месяцев), что делает невозможным его применение в целях обычной экспертизы (Бакулов, Васильев, 1991).
Для первичного скрининга листерий часто применяют метод освещения по Генри, который применим для колоний выросших на бесцветных и прозрачных средах. При освещении чашек снизу под углом 45 и просмотре под углом 90 колонии листерий опалесцируют голубым или голубовато-серым цветом. Этот метод очень прост и достоверен (Тартаковский, Малеев, Ермолаева, 2002).
По другим данным при освещении колоний листерии под углом 45 они в основном давали зелёную гамму (Савельева, 1999).
В современных схемах выделения листерии из продуктов питания используют селективные среды и среды обогащения. Наиболее часто используемыми селективными агентами являются следующие: теллурит калия, налидиксовая кислота, хлорид лития, акрифлавин, эскулин, красители (фенилрот), антибиотики (цефтазидим, полимиксин В), циклогексимид, которые используют как ингибиторы сопутствующей микрофлоры, а также дифференцирующие индикаторы (Тартаковский, 2000).
Из проб исследуемого материала после подращивания или из проб после хранения в холодильнике делают мазки отпечатки и окрашивают по Граму и микроскопируют под иммерсионной системой микроскопа. Для выделения листерии из сильно контаминированных продуктов питания используют процедуру вторичного обогащения с последующим высевом на селективный агар (Тартаковский, 2000).
Параллельно с этим из этого же материала делают посевы или из суспензии, приготовленной на физиологическом растворе в соотношении 1:5 и из неё делают посевы. В качестве основных сред для культивирования листерии используют среды с добавлением 1% глюкозы; 2% дрожжевого экстракта; 2-3% глицерина. На данный момент наибольшее распространение за рубежом получили Оксфорд агар и PALCAM агар. На Оксфорд- агаре вырастают чёрные колонии листерии, окружённые чёрным ореолом. На PALCAM- агаре колонии листерии серо-зелёные с чёрным вогнутым центром, характерным также является чёрный ореол на красном фоне агара. Почернение среды происходит вследствие гидролиза эскулина в присутствии ионов Fe+. Последующий анализ характерных колоний, утилизирующих эскулин (в результате чего и происходит почернение среды), позволяет идентифицировать культуру Listeria monocytogenes (Тартаковский, 2000; Curtis et al., 1989).
Подвижность определяют методом висячей или раздавленной капли, либо посевом методом укола в ПЖА. Активной подвижностью обладают 6-18 часовые бульонные культуры листерий, выращенные при температуре 22С.
Для определения биохимической активности чистую бульонную культуру пересевают на пёстрый ряд и культивируют в течение 10 дней при 37С. Листерий разлагают с образованием кислоты, без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, салицин и не разлагают маннит, дульцит, раффинозу, инулин.
Для определения каталазной активности к суточной бульонной культуре добавляют равный объём свежеприготовленный 5% раствор перекиси водорода. При исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель перекиси водорода. Образование пузырьков газа свидетельствует о наличии фермента каталазы в данной бактериальной культуре.
Дальнейшие серологические исследования позволяют определить серогрупповую принадлежность выделенных штаммов. Чаще всего для этих целей применяют капельную реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой. Серогрупповые сыворотки агглютинируют культуры листерий соответствующих серогрупп. Сыворотка 1-го серовара (1 серогруппа) содержит О-фактор II, а сыворотка 4-го "в" серовара (2-ая серогруппа) - О-факторы V, VI. Патогенные свойства листерий проверяют коньюнктивальной пробой на морских свинках (проба Антона). Для этого на конъюнктиву глаза морской свинки наносят 2 капли бульонной культуры с последующим массажем век. Вирулентные штаммы листерий вызывают у морской свинки гнойный кератоконьюнктивит (Бакулов, Васильев, 1991). В последние годы листериозные бактериофаги успешно применяют для индикации листерий в пищевых продуктах. Этот метод высокоспецифичен и также позволяет определить видовую принадлежность штаммов. Установлено, что бактериофаг L-2A обладал высокой активностью и строгой специфичностью в отношении культур Listeria monocytogenes 1-ой серогруппы, а бактериофаг L-4A в отношении культур Listeria monocytogenes 2-ой серогруппы. Исследования пищевых продуктов с помощью реакции нарастания титра фага, разработанная во ВНИИВВиМ, позволяют обнаружить листерий в них в короткие сроки и без выделения чистой культуры. Сущность РНТФ заключается в том, что при её постановке изучаются количественные изменения, происходящие в популяции фага после контакта его с исследуемым субстратом (Котляров, Бакулов, 2001). Метод иммунофлуоресценции (РИФ) используют в качестве экспресс-метода для выявления листерий в пищевых продуктах и кормах с последующим подтверждением бактериологическим методом, а также для идентификации выделенной культуры. Для этого из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки на которые наносят специфические люминесцирующие глобулины. Интенсивность свечения не менее чем на три креста свидетельствует о принадлежности к листериям (Котляров, Чевелева, 2001).
Сравнительное исследование свойств различных видов листерий
Ранее в этом хозяйстве были зафиксированы случаи заболевания свиней листериозом, характеризовавшиеся сверхострым течением и высокой летальностью. В момент проведения исследований среди коров регистрировались случаи абортов, эндометритов и маститов.
Пробы молока были отобраны у 51 коровы, как у клинически здоровых животных, так и у животных с различными вышеуказанными поражениями. Из 40 проб молока после холодового обогащения было выделено 3 штамма L. monocytogenes, что составило 7,5% случаев. После серотипирования все штаммы были отнесены к серовару 1/2а. Штамм №1 был выделен от коровы с диагнозом "эндометрит", №9 - от коровы с геморрагическим маститом и №40 -от клинически здорового животного.
Причём была отмечена однородность свойств выделенных штаммов L, monocytogenes, что даёт основания предполагать о наличие очага инфекции в этом хозяйстве. Листерии постоянно циркулирует в этом хозяйстве, поскольку молоко, полученное от коров, скармливается поросятам без предварительной пастеризации или кипячения, что приводит к инфицированию свиней. Среди молодняка свиней отмечается высокая летальность, трупы поросят скармливались собакам, при этом круг инфицированных животных постоянно расширялся.
В мазках, окрашенных по Граму, отмечали наличие коротких грамположительных палочек. При культивировании на МПА на 2-3 день отмечали рост мелких, росинчатых, гладких, полупрозрачных колоний. На МПБ - лёгкое помутнение среды, при встряхивании со дна поднималась косичка. Все культуры были каталазоположительными и обладали активной подвижностью при 26С . При проведении люминесцентной микроскопии после обработки мазков люминесцирующей листериозной сывороткой отмечали специфическое свечение интенсивностью на четыре креста. Все штаммы сбраживали с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу и лактозу, не сбраживали маннит. При изучении гемолитической активности более значительная зона гемолиза была отмечена у штамма №40, слабый гемолиз давали штаммы №1 и №9 (табл. б). В ПНР положительными были 2 штамма (табл. 6). При дальнейшем серологическом изучении в реакции агглютинации было установлено, что штаммы относятся к серовару 1/2а (табл. 7). Таким образом, при обследовании четырёх молочнотоварных ферм из 211 проб молока было изолировано 8 штаммов Listeria monocytogenes ser.l/2a и один штамм ser.l/2c, а также один штамм Listeria monocytogenes ser.l/2a из мозга павшей коровы обладавших типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами, что составило 4,73%. Обращает внимание ГСП "Кологривовское" Татищевского района, в котором наблюдались многочисленные случаи падежа свиней от листериоза. Это даёт нам основание утверждать, что в ГСП "Кологривовское" существует стойкий очаг инфекции, требующий санации. Наши результаты о важной роли молока в передаче листериозной инфекции подтверждают данные Л.В. Савельевой, которая показала, что в молоке и молочных продуктах с городских рынков и хозяйств Саратовской области в 1,97 % обнаруживается L. monocytogenes. Всего было исследовано 54 образца мяса. проб свинины, полученные из ГСП "Кологривовское" Татищевского района Саратовской области, из которых методом бактериологического исследования было выделено 4 штамма L. monocytogenes (№/№5, 6, 15, 16). Также были проведены исследования 22 проб свинины и говядины, 14 проб мясного фарша, изъятых из объектов розничной торговли города Саратова. При помощи бактериологического метода изолирован 1 штамм L.monocytogenes - 26 из мяса, поступившего для проведения ветсанэкспертизы на один из рынков города из СХ ПК «Сысоевский» Алтайского района и 3 штамма из фарша - 22, 25, 31. Все штаммы L. monocytogenes, изолированные из мяса и мясопродуктов, обладали типичными морфологическими, биохимическими и культуральными свойствами, которые приведены в табл. 8. Выделенные штаммы обладали каталазной активностью и подвижностью при посеве уколом на ГОКА давали равномерный рост. Все изоляты обладали обладали Р-гемолитической активностью, в большей степени штамм- 15. Штамм 15, изолированный из мяса свинины из ГСП "Кологривовское" давал положительный результат в кератоконьюнктивальной пробе на морских свинках, т.е. был вирулентен. На 8 день у морской свинки отмечали слезотечение, геморагичность конъюнктивы, 10 день сужение глазной щели и гнойный кератоконъюнктивит, а на 12 день наблюдалось помутнение роговицы (рис.2). В контроле никаких изменений не было. Проба Антона была также положительной со штаммом №31, выделенным из мясного фарша. Этот штамм на 12 день у заражённой морской свинки вызывал конъюнктивит, на 15 день гнойный кератоконъюнктивит.
Методика применения ПЦР для исследования пищевых продуктов
Предварительно для исследуемых образцов пищевых продуктов применяли методику холодового обогащения. Молоко или мясной экстракт засевали на питательный бульон Oxoid с селективной добавкой для культивирования листерий в соотношении 1:9 и помещали при +4С.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с тест-системой "ЛИСТЕР" Всероссийского Государственного НИИ контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, а также тест-систему "Листериомоно ампли-тест" ЗАО НиармедикПлюс. Используемые в "Листериомоно ампли-тест" тест-системе видоспецифичные праймеры выбраны на основе нуклеотидной последовательности гена детерминирующего синтез листериолизина Ыу-А. Праймеры обеспечивают амплификацию специфичного фрагмента ДНК размером 174 п. н.
Этот раздел исследований был выполнен на базах Областной ветеринарной лаборатории (директор Частов А.А., врач-бактерилог Черчимцева В.П.) и лаборатории диагностики инфекционных болезней Российского НИ противочумного института «Микроб» (Зав. лабораторией проф. Куличенко А.Н.). Автор приносит свою благодарность названным специалистам.
ПЦР осуществляли по прилагаемой к тест-системам инструкции. Использовалась следующая аппаратура, реактивы и условия.
Для выделения ДНК использовали метод нуклеосорбции. После обеззараживания в пробы вносили 30 мкл сорбента и оставляли при комнатной температуре на 10 мин, периодически встряхивая на вортексе, в течение 10 сек. Затем образец центрифугировали при 8000 g 20 секунд, отбирали супернатант, а к осадку добавляли 300 мкл буфера 2. Содержимое перемешивали до гомогенного состояния в течение 1 мин, центрифугировали 20 секунд при 8000 g на микроцентрифуге, отбирали супернатант, к осадку добавляли буфер 3 в объеме 1 мл. Осадок вновь перемешивали на вортексе, центрифугировали при 8000 g на микроцентрифуге 20 секунд, после чего отбирали супернатант.
Для проведения амплификации ДНК готовили микропробирки соответственно количеству исследуемых и контрольных образцов. Смесь компонентов брали из расчёта на одну пробу в следующей последовательности: реакционная смесь 15,0мкл, Taq-полимераза 2,5ед/мкл - 0,5 мкл. Приготовленную смесь перемешивали пипетированием и разливали по 15мкл в каждую пробирку для амплификации. На поверхность реакционной смеси наслаивали 30 мкл вазелинового масла, затем под масло добавляли по 10 мкл ДНК, выделенной из исследуемых образцов. В пробирки с положительным контролем вносили по 2 мкл положительной контрольной ДНК и 8 мкл деионизованной воды. В пробирку с отрицательным контролем вместо ДНК вносили 10 мкл деионизованной воды. Общий реакционный объем во всех микропробирках составил 25 мкл. Пробирки закрыли и центрифугировали 5 сек. при 3 тыс. об/мин, затем помещали в программируемый амплификатор для проведения реакции амплификации.
Продукты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 1,2 %-ной агарозе ("Промега", Швеция) в аппарате типа ПГ-9. Для подготовки 1,2 % агарозного геля к 0,6г агарозы добавляли 50 мл ІхТАЕ буфера. Смесь помещали в термостойкую колбу и нагревали в кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после чего охлаждали до температуры 50 С и выливали на подготовленный столик для заливки геля. Для проведения гель-электрофореза к 12 мкл амплифицированного продукта добавляли 1 мкл Юхбуфер; 0,025 г бромфенолового синего и 2,5 г фиколла 400 помещали в химический стакан на 25 мл, растворяли в 5 мл дистиллированной воды, после чего доводили общий объем раствора до 10 мл. Электрофорез осуществляли в течение 30 минут. Окрашенную ДНК в геле просматривали под ультрафиолетовым излучением, для чего использовали трансилллюминатор "LKB-20H" ("LKB", Швеция) с максимальной длиной волны 254 нм. Анализируемые фрагменты проявляются в геле в виде светящихся красных полос. Гель фотографировали в проходящем ультрафиолете на фотопленку "Микрат-300" ("Тасма", РФ). Результаты ПЦР оценивали по наличию фрагментов ДНК, полосы которых располагаются на том же уровне в геле, что и полосы в положительном контроле с препаратом ДНК L.monocytogenes. В присутствии ДНК-матриц микроба L.monocytogenes должны быть видны полосы специфичные для фрагмента гена листериолизина Ыу-А. Размер фрагмента величиной 174 п.н.. При наличии в пробах ДНК-матриц других микроорганизмов и в отрицательном контроле специфичные полосы отсутствовали. Перед проведением исследований ставили контроль чувствительности и специфичности ПЦР. Для определения чувствительности молоко и физиологический раствор заражали свежеприготовленной взвесью культуры L.monocytogenes ъ количестве 1мл, таким образом, были получены следующие разведения в молоке L.monocytogenes 1 103, 1 104; в физиологическом растворе 1 102, 1-Ю3, 1-104. Чувствительность этого метода составила в молоке 1-Ю4, а в физиологическом растворе 1 103 КОЕ/мл. Для определения специфичности использовали физиологический раствор и молоко искусственно контаминированные L. grayi и L.innocua ser. 6а и 6b в концентрации 1-Ю5 -реакция была отрицательной во всех случаях (контроль отрицательный).
![Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс]](/i/i/4703/193414.png "Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс] Ахмедова Гульнора Махмуджановна")
