Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные сведения о возбудителях кампилобактериоза 12
1.1. История открытия и начало изучения Campylobacter 12
1.2. Классификация бактерий рода Campylobacter 13
1.3. Методы лабораторной диагностики кампилобактериоза 15
1.4. Биологическая характеристика микроорганизмов рода Campylobacter 16
1.5. Экология Campylobacter 20
1.6. Эпидемиологические особенности кампилобактериоза 22
1.7. Кампилобактериоз у обезьян 33
Собственные исследования 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Материалы и объём работы 40
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Бактериологический метод 43
2.2.2. Иммунологический метод - реакция коагглютинации (РКА) 48
2.2.3. Молекулярно-генетическии метод — полимеразная цепная реакция (ПЦР) 49
2.2.4. Статистическая обработка 52
ГЛАВА 3. Лабораторная диагностика кампилобактерий у приматов 53
3.1. Результаты бактериологического метода исследования 53
3.2. Результаты иммунологического метода исследования 58
3.3. Результаты молекулярно-генетического метода исследования 59
3.4. Сравнение результативности данных трёх методов исследования 61
3.5. Определение чувствительности Campylobacter к антибиотикам 63
ГЛАВА 4 . Исследование на Campylobacter различных видов обезьян 68
4.1. Распространение кампилобактерий среди разных видов здоровых обезьян 68
4.2 Обнаружение Campylobacter при острых кишечных инфекциях у обезьян 74
4.3. Эпидемиологические аспекты кампилобактериоза обезьян 84
ГЛАВА 5. Клинико-морфологическая характеристика острых кишечных заболеваний обезьян, вызванных Campylobacter jej uni 90
5.1. Клинические проявления кампилобактериоза у обезьян 90
5.2. Патоморфологические особенности кампилобактериоза у обезьян 93
Заключение 99
Выводы по
Список литературы 112
- Биологическая характеристика микроорганизмов рода Campylobacter
- Иммунологический метод - реакция коагглютинации (РКА)
- Сравнение результативности данных трёх методов исследования
- Обнаружение Campylobacter при острых кишечных инфекциях у обезьян
Введение к работе
Проблема острых кишечных инфекций (ОКИ) в настоящее время является актуальной, в связи с их повсеместным распространением и социально-экономическим ущербом, наносимым ими. В последние десятилетия достигнуты значительные успехи в диагностике, лечении и профилактике ОКИ. Во многом это стало возможно благодаря тому, что для решения этих вопросов в экспериментах используются животные разных систематических групп. Наиболее подходящей моделью для изучения болезней человека являются приматы, которые уже с середины прошлого столетия широко используются в экспериментальной практике для решения разнообразных проблем медицины и биологии. Последнее обусловлено, в первую очередь, их уникальным биологическим сходством с человеком, связанном с филогенетическим родством представителей отряда приматов, куда входит и человек. Значительное увеличение использования приматов, признанных лабораторными двойниками человека, в медико-биологических исследованиях, особенно для производства и тестирования вакцинных препаратов (полиовакцина, коревая и другие), а также сокращение ареала обитания обезьян в связи с хозяйственной деятельностью человека, привели к резкому уменьшению популяций диких приматов [32]. Всё вышеизложенное стало причиной сокращения экспорта обезьян из стран их естественного обитания, следствием чего явилось принятие международной конвенции и национальных законов, ограничивающих или полностью запрещающих отлов обезьян на экспорт. Покрытие потребностей экспериментальной медицины и биологии в таких условиях было возможно путём создания многочисленных питомников, вивариев, заказников, как в странах интенсивного использования этих животных, так и в ареалах их естественного обитания.
Научно-исследовательский институт медицинской приматологии РАМН (НИИ МП РАМН) - единственное учреждение в Российской Федерации, где
основная масса научно-исследовательских работ медицинского и биологического профиля проводится с использованием обезьян. НИИ МП РАМН, наряду с экспериментальными исследованиями актуальных проблем современной медицины и биологии, широко изучает спонтанную патологию собственно обезьян в сравнительном плане с целью рационального разведения их в условиях неволи и наиболее целесообразного использования тех или иных видов для создания экспериментальных моделей. Вследствие этого одной из важнейших задач НИИ МП РАМН помимо выполнения научных программ, является создание благоприятных условий для осуществления программы широкомасштабного разведения разных видов обезьян, которая невозможна без фундаментальных знаний биологии и патологии этих животных.
В условиях неволи обезьяны болеют многими болезнями, свойственными другим животным и человеку [32; 142]. В спонтанной патологии обезьян ведущее место отводится инфекционным заболеваниям антропонозной и зоонозной природы. По частоте и наносимому ущербу особое значение имеют ОКИ, являющиеся основными причинами заболеваемости и гибели животных, содержащихся в условиях неволи, что определяет большую научно-практическую значимость исследований по выявлению этиологических факторов указанной патологии [32]. Несмотря на успехи, достигнутые в лечении, кишечные инфекции (КИ) до настоящего времени остаются одной из актуальных проблем приматологии. Поэтому в программе НИИ МП РАМН существенная роль отводится изучению КИ, являющихся всё ещё ведущими в структуре заболеваемости и смертности обезьян Адлерского питомника, а также разработке методов профилактики и лечения больных животных. Так, по данным клинико-ветеринарной и патоморфологической служб НИИ МП РАМН, в структуре заболеваемости обезьян до 50% занимают ОКИ и при несвоевременном выявлении инфекционных агентов и отсутствии адекватного лечения погибают до 40% заболевших КИ животных.
До конца 1970-х годов, особенно в период массовых завозов обезьян, доставленных из мест естественного обитания (Юго-Восточная Азия, Африка), в ранний период акклиматизации и адаптации к новым условиям, ведущими патогенами, причастными к ОКИ, были шигеллы, сальмонеллы, реже -иерсинии. Однако с середины 1980-х годов ситуация резко изменилась: снизилась этиологическая роль патогенных энтеробактерий в структуре ОКИ и значительное место стали занимать заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) невыясненной этиологии, которые определяются как "клиническая дизентерия", "колит", "энтерит", "энтероколит" [32;89;141]. Таким образом, наибольшее число случаев ОКИ (50-70%), по данным НИИ МП РАМН и других приматологических учреждений, остаются этиологически нерасшифрованными, несмотря на то, что клиника и эпизоотологические наблюдения свидетельствуют об их инфекционной природе [32;124;130;136]. В связи с большим удельным весом ОКИ в инфекционной патологии обезьян и значительными экономическими потерями, связанными с ними, выяснение этиологических факторов данных патологий имеют большое научно-практическое значение. Наиболее перспективным для успешного решения проблемы расшифровки этиологии ОКИ представляется микробиологический поиск при указанных заболеваниях патогенных бактерий, вирусов и паразитофауны, которые малоизученны, но могут являться возбудителями данной патологии обезьян. В этом плане особое внимание заслуживают микроорганизмы семейства Campylobacteriaceae, в частности, микроаэрофильные бактерии рода Campylobacter, обусловливающие заболевания ОКИ [23;24;26;43;49]. Ранее эти возбудители выявлялись у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, птиц [28;43;62;70;112;135]. Исходя из этого, проблема трактовалась как ветеринарная. В настоящее время роль микроорганизмов рода Campylobacter в структуре ОКИ человека не вызывает сомнений. По инициативе ВОЗ изучение кампилобактериоза включено в
национальные программы по борьбе с диарейными заболеваниями примерно в 100 странах [31].
Изучение возможной связи Campylobacter с ОКИ у приматов началось за рубежом с конца 1970-х годов. В иностранной литературе есть сведения о роли кампилобактерий в возникновении диарейных заболеваний у обезьян [107;116;137;140;141]. В нашей стране такие исследования ранее не проводились.
Данные исследования по изучению распространения Campylobacter и их этиологической роли в структуре острых кишечных заболеваний (ОКЗ) среди обезьян в России проводилось впервые на базе НИИ МП РАМН.
Цель: изучить распространение бактерий рода Campylobacter среди различных видов обезьян в питомнике и выяснить роль указанных возбудителей в этиологической структуре острых кишечных инфекций приматов.
Задачи:
Сравнительное изучение методов лабораторной диагностики Campylobacter у приматов;
Определение частоты распространения Campylobacter среди различных видов обезьян;
Выделение Campylobacter от больных и погибших от острых кишечных инфекций животных;
Изучение биологических свойств Campylobacter, выделенных от обезьян и определение их чувствительности к лекарственным препаратам;
Характеристика клинико-морфологических особенностей кампилобактериоза обезьян;
Эпидемиологические особенности кампилобактериоза в питомнике обезьян.
Научная новизна
Установлено инфицирование различных видов африканских и азиатских обезьян, живущих в условиях неволи, возбудителями кампилобактеряоза. Впервые использованы современные методы диагностики - полимеразная цепная реакция (ПЦР) и реакция коагтлютинации на стекле (РКА) для выявления и идентификации Campylobacter у обезьян. Впервые проведена сравнительная оценка использования для индикации и идентификации Campylobacter трёх методов исследования: классического бактериологического, иммунологического (РКА) и молекулярно-генетического (ПЦР). Впервые установлен удельный вес кампилобактериоза в структуре ОКЗ у обезьян, подробно описана клиника и патоморфология спонтанного кампилобактериоза. Данные сведения дополняют представления об этиологической структуре кишечных заболеваний приматов, что имеет большое значение для рациональной терапии животных, разработки методов эрадикации данной патологии как одной из возможных причин кишечных заболеваний и гибели обезьян.
Научно-практическая значимость
Так как приматы имеют сходную с человеком восприимчивость к ряду инфекционных агентов, изучение на них спонтанного кампилобактериоза вносит определённый вклад в представление о клинико-морфологических особенностях данной инфекции и позволяет использовать естественную инфекцию обезьян в качестве модели для апробации новых методов лечения и профилактики данного заболевания. Определение путей распространения, изучение биологических свойств кампилобактерий, выделенных в норме и при выраженной патологии обезьян, будут способствовать выяснению ряда нерешённых вопросов патогенеза, эпидемиологии и этиологии кампилобактериоза человека.
В ходе выполнения данного исследования были разработаны и внедрены в практику работы лаборатории инфекционной патологии бактериологический, иммунологический (РКА) и молекулярно - генетический (ПНР) методы исследования кампилобактериоза у приматов, которые используются при выполнении плановых тем лаборатории. Внедрение данных методов позволило увеличить частоту обнаружения возбудителей КИ, что в свою очередь снизило процент заболеваний неустановленной ранее этиологии. Выяснение удельного веса кампилобактериоза в структуре ОКИ обезьян, разработка методов терапии и профилактики способствуют снижению заболеваемости и смертности животных, что имеет практическое значение для производственной и коммерческой деятельности института.
По результатам исследования разработаны методические рекомендации по комплексной лабораторной диагностике кампилобактериоза у обезьян, которые утверждены комиссией по медико-биологическим исследованиям на приматах при президиуме РАМН (комиссия по медико-биологическим исследованиям создана в 1974 году и утверждена РАМН, председатель комиссии - академик Б. А. Лапин).
Теоретические положения исследования и основанные на нём практические рекомендации, используются в учебном процессе при прохождении курса инфекционной микробиологии на физиологическом факультете Сочинского филиала Российского Университета Дружбы Народов.
Апробация работы
Результаты исследования доложены на III конференции молодых учёных с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва, 20 - 24 января 2004 г.). Основные положения работы представлены на конференции молодых учёных, посвященной 60-летию Российской Академии Медицинских Наук (г. Сочи, 26 мая 2004 г.), Учёном Совете НИИ МП РАМН (г. Сочи, 8 октября 2004 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, 4 тезисов и методическое пособие.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа изложена на 127 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 11 рисунками и 3 схемами. Библиографический указатель включает 147 источников.
Положения, выносимые на защиту:
Штаммы Campylobacter, выделенные от обезьян, по своим биологическим, генетическим свойствам, чувствительности к лекарственным препаратам, не отличались от эталонных, выделенных от человека.
Имеются отличия в инфицированности между различными видами и возрастными группами здоровых животных. Среди здоровых обезьян рода макак наиболее инфицированными являются макаки лапундеры и макаки яванские. Носительство кампилобактерий у детёнышей первого года жизни в 1,7 раза выше, чем у обезьян старших возрастных групп.
При ОКИ обезьян кампилобактерий выделяются в 2 раза чаще, чем у клинически здоровых.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологическая характеристика микроорганизмов рода Campylobacter
Campylobacter - это мелкие спирально-изогнутые грамотрицательные неспорообразующие подвижные палочки длиной 0,5 - 8,0 мкм и шириной 0,2 -0,5 мкм с одним или несколькими завитками и с заострёнными концами. По морфологии клетки напоминают веретено или «крылья чайки» (при соединении двух клеток в короткую цепочку), а также принимают S-образную форму. Стареющим культурам Campylobacter свойственно наличие кокковых и гиперспирализованных форм. Некоторые авторы [73] считают, что кокковидные клетки являются деструктивной формой, которая претерпевает клеточную дегидратацию. Бактерии обладают одним или двумя полярно расположенными жгутиками, благодаря которым обеспечивается высокая подвижность со стремительным «штопорообразным» поступательным движением. Campylobacter легко окрашиваются фуксином, азур эозином, кристаллическим фиолетовым.
Campylobacter - микроаэрофильные и капнофильные бактерии, растущие в газовой смеси с пониженным содержанием кислорода (5 - 7%) и повышенным - углекислого газа (5 - 7%), не растущие в строго анаэробных и аэробных условиях. Оптимальные условия для культивирования кампилобактерий -газовая атмосфера, содержащая 5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота, что достигается при использовании газогенерирующих пакетов или баллонного газа. Возможно также культивирование в атмосфере 10% углекислого газа или «сгоревшей свечи» [74]. Ряд видов Campylobacter требует для роста ионы водорода - С. sputorum, С. concisus, С. mucosalis, С. curius, С. rectus, С. hyointestinalis. Для их роста необходима газовая смесь 10% углекислого газа, 6% водорода, 4% кислорода и 80% азота [23]. Оптимальное время инкубации при 37С 48 — 72 часа. Биохимические тесты
Для проведения межродовой дифференциации используют тест на продукцию каталазы, который позволяет вьщелить две большие группы Campylobacter: каталазопозитивные и каталазонегативные (или слабо продуцирующие). Campylobacter - оксидазоположительные микроорганизмы [74].
Для проведения дифференциации на межвидовом уровне, ещё на этапе инкубации посевов первичного материала, используется «ростовой тест», позволяющий подразделить Campylobacter на мезофильные (растут при 25 -37С) и термофильные (температурный оптимум роста 37 - 44С). Совокупность таких признаков, как редукция нитратов и нитритов, потребность в водороде, способность к гидролизу индоксилацетата, отсутствие способности гидролизовать мочевину и утилизировать углеводы позволяет подтвердить принадлежность выделенных культур к различным видам рода Campylobacter (табл. 1) [23].
Идентификация штаммов по культуральным и биохимическим свойствам была упрощена в результате разработки микрометода (API Campy, фирма "BioMereux", Франция) для дифференциации Campylobacter на основе 20 тестов. Более точными являются физико-химические методы идентификации -хроматография и электрофорез. ДНК-ДНК - гибридизация позволяет безошибочно идентифицировать Campylobacter до вида в чистой культуре или в смеси культур.
Чувствительность Campylobacter к лекарственным препаратам
Данные о лекарственной устойчивости возбудителей заболеваний, вызванных Campylobacter, являются основой для выбора правильной химиотерапии и подбора антибактериальных препаратов, применяемых в качестве селективных добавок к питательным средам для этих микроорганизмов. Так, по утверждению одних авторов, культуры Campylobacter высокочувствительны к байтрилу, гентамицину, тетрациклину, доксициклину, олеандомицину, эритромицину, тиамулину, китасалицину; малочувствительны — к ампициллину, пенициллину, тилозину [6;13;23;29]. Campylobacter резистентны к рифампицину, полимиксину, феноксиметилпенициллину, триметоприму [13;29], трифенилтетразолия хлориду [64], ванкомицину, полимиксину М, цефалотину, цефаперазону и к некоторым другим антибиотикам р-лактамов, что обусловлено наличием у бактерий бета-лактамной активности. Высокой активностью в отношении Campylobacter обладают хинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин, эноксацин и другие).
В настоящее время увеличивается число штаммов С. jejuni резистентных к налидиксовой кислоте, что связано либо с мутацией гена gyr А, который ответственен за синтез фермента гиразы, блокируемого у чувствительных бактерий налидиксовой кислотой, либо с изменением проницаемости клеточной стенки (гены nfx, cfx) [23]. Необходимо отметить, что в настоящее время идёт процесс распространения устойчивости к эритромицину среди Campylobacter, но это, по-видимому, не носит глобальный характер [23].
Названные антибиотики используются для лечения кампилобактериоза. В настоящее время в терапии данного заболевания можно использовать также энтеросорбенты различных классов, которые воздействуют на возбудителя и при этом, в отличие от антибиотиков, лишены побочных влияний (Смекта, Энтерокат). Один курс применения энтеросорбентов оказывается более эффектным, чем антибактериальная терапия. При употреблении энтеросорбентов в ранние сроки заболевания происходит нормализация стула, уменьшение длительности интоксикации, эксикоза, рвоты [16].Кампилобактерии входят в состав как аллохтонной, так и аутохтонной микрофлоры окружающей среды. Имеющиеся в литературе сведения касаются только воды как среды обитания этих микроорганизмов, при этом сведения о «свободноживущих» видах Campylobacter крайне скудны. Сапрофитные виды -Campylobacter DSM, Campylobacter DL-1 - относятся по типу метаболизма к сероредуцирующим бактериям. С. jejuni являются представителями аллохтонной микрофлоры водоёмов. Так, при исследовании 142 проб воды из реки Невы, Campylobacter обнаружены в 43 (30,3%) пробах и идентифицированы как С. jejuni [23;53].
Иммунологический метод - реакция коагглютинации (РКА)
В реакции коагглютинации был использован диагностикум, изготовленный в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, любезно предоставленный нам д.м.н., проф. Ю.А. Белой. Кампилобактериозный антительный диагностикум к антигенам Campylobacter (поливалентный), позволяет определить циркулирующие в биологических средах организма О-антигены возбудителей кампилобактериоза. Метод РКА основан на взаимодействии Staphylococcus aureus, сенсибилизированных специфическими диагностическими сыворотками, с антигенами микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале. Из неадсорбированных сывороток с помощью тест-штамма золотистого стафилококка Cowan 1 извлекается Ig Gj 4, который соединяется в области Fc-фрагмента — с протеином А стафилококков, a Fab-фрагментом - со специфическими антигенами, что проявляется феноменом агглютинации стафилококков, видимым невооружённым глазом.
Пробы для исследования собирали в пробирки. Исследование проводили согласно методическим рекомендациям [3].
Исследование кала. Кал в количестве 1 грамма заливали фосфатно-буферным раствором (ФСБ) в соотношении 1:5, перемешивали, прогревали на водяной бане 20 минут, центрифугировали 15 минут при 2000 об/мин. Для проведения реакции использовали супернатант.
Исследование сывороток. При исследовании сывороток крови сначала проводили осаждение иммунных комплексов полизтиленгликолем (ПЭГ) 6000. Для этого к 0,5 мл пробы добавляли 2,5 мл боратного буфера и 4,5 мл 5% ПЭГ 6000, перемешивали, выдерживали 2 часа при 4С, центрифугировали 30 минут при 2000 об/мин, осадок растворяли в 0,5 мл ФСБ, встряхивали и прогревали 20 минут при 100С.
На предметное стекло наносили каплю исследуемого материала и каплю диагностикума. Результат учитывали через 1 час после экспозиции стёкол во влажной камере при 37С над вогнутым зеркалом и регистрировали появление агглютинации.
Молекулярно-генетический метод — полимеразная цепная реакция (ПЦР) Метод ДНК - диагностики основан на комплементарном взаимодействии нуклеиновых кислот, которые позволяют с высокой точностью идентифицировать последовательность нуклеотидов в генах искомого микроорганизма. С помощью этой реакции можно выявить патогенные микроорганизмы в очень низких концентрациях. ПЦР основана на том, в исследуемый образец, содержащий тот или иной инфекционный агент, вносят синтезированные в лаборатории нуклеотидные последовательности (праймеры), комплементарные генетическому материалу искомого возбудителя, которые специфически взаимодействуют с ДНК инфекционного агента. Если исследуемую пробу подвергнуть температурной обработке, то двуспиральная ДНК возбудителя денатурирует и становится доступной для взаимодействия с двумя праймерами, комплементарными определённой зоне ДНК исследуемого объекта. При повторных циклах денатурации и ренатурации нуклеиновых кислот образца в определённых условиях достигается избирательное размножение (амплификация) участка нуклеиновой кислоты определённого размера, который задаётся при выборе праймеров. Каждый цикл ПЦР состоит из трёх этапов:
1) Денатурация - на первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92 - 95С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
2) Отжиг - на втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит согласно правилу комплементарности Чаргаффа: в двухцепочечных молекулах ДНК напротив аденина находится тимин, а гуанина - цитозин. После отжига праймеров Tag-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3 —конца праймера. Поскольку праймеры («амплимеры») присутствуют в реакционной смеси в большом избытке, их отжиг происходит практически мгновенно, так что время отжига может быть небольшим. Праймеры образуют с реакционной смесью комплекс и проводят репликацию ДНК in vitro. Поскольку амплимеры гибридизуются с обеими цепями ДНК, то и нативная последовательность, и синтезируемые ПНР - продукты служат матрицами в последующих раундах репликации, в результате чего число копий уникальной последовательности увеличивается.
3) Элонгация (синтез). На этом этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Tag-полимеразы (72 С), и продолжается синтез второй цепи. Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезируемых копий фрагмента ДНК удваивается. Считают, что копирование каждой 1000 н.п. занимает 1 минуту. Результатом циклического синтеза является экспоненциальное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что позволяет амплифицировать в одной реакции не менее 10 копий ДНК-мишени [71].
Для выявления возбудителей кампилобактериоза С. jejuni методом ПЦР мы использовали тест-систему " КАМ - БАК ", которую выпускает ЦНИИЭ МЗ РФ. Эта тест-система представляет собой многокомпонентный набор для выявления ДНК методом ПЦР и состоит из четырёх комплектов: 1. Набор № 1 для выделения ДНК;
2. Набор № 2 для проведения ПЦР;
3. Набор № 3 для электрофоретического анализа продуктов ПЦР;
4. Набор № 4 контрольных образцов.
Чувствительность тест-системы составляет не менее 500 клеток в пробе (100 мкл). Забор проб проводили согласно инструкции по применению тест-системы [36].
Сравнение результативности данных трёх методов исследования
С целью выявления инфицированности кампилобактериями обезьян, населяющих питомник, обследовано 1249 особей, из которых 928 были клинически здоровыми и 321 — больными и погибшими от ОКИ.
Как показало обследование всех 1249 обезьян (больных ОКИ и клинически здоровых) в среднем у 26,0±1,3% животных были обнаружены бактерии рода Campylobacter (табл. 8). Одной из важнейших задач исследования явилось выяснение частоты распространения кампилобактерий среди клинически здоровых обезьян разных видов (табл. 9, рис. 5). обезьяны обследованы анонимно.
Різ табл. 9 следует, что носительство кампилобактерий среди клинически здоровых обезьян в среднем достигает 20,9±1,4% (194 положительных из 928 обследованных). В табл. 9 также приведены результаты исследования по распространению носительства кампилобактерий у разных видов обезьян.
При анализе данных, представленных в табл. 9, видно, что инфицированность кампилобактериями разных видов приматов неодинакова и колеблется от 11,2% до 30%. Наибольший процент инфицированных обезьян обнаружен среди макаков лапундеров и макаков яванских (30±14,5% и 28,7±3,0% соответственно). Примерно одинаковый процент выявления кампилобактерий у павианов гамадрилов (20,8±3,3%) и макаков резусов (19,8±2,1%). У павианов анубисов возбудители кампилобактериоза были обнаружены в 14,6±4,8%, а у мартышек зелёных - в 11,2±2,9% случаев.
При сравнительном анализе распространённости Campylobacter среди клинически здоровых обезьян разных видов показано, что частота встречаемости возбудителей кампилобактериоза достоверно различна, то есть р 1,97.
Анализу распространения кампилобактерий в зависимости от возраста было подвергнуто 885 из 928 обезьян (43 обезьяны не учитывались, так как они были обследованы анонимно без установления возраста).
Как видно из табл. 10, в которой приведены данные по инфицированности кампилобактериями клинически здоровых обезьян в зависимости от возраста, наиболее инфицированными являются детёныши до года (29,9%). С возрастом инфицированность Campylobacter несколько снижается (до 14,1 %). Согласно данным табл. 10, у макаков яванских микроорганизмы рода Campylobacter выделялись во всех возрастных группах с достаточно высокой частотой (26% — 42,5%). У павианов гамадрилов частота выделения кампилобактерий во всех возрастных группах достаточно высокая, и только в возрасте 1-3 лет она составляет 4,7%. У макаков резусов высокий процент выделения кампилобактерий во всех возрастных группах, лишь у старых обезьян он несколько снижался (11,1%). У мартышек зелёных наибольший процент выявления наблюдался у детёнышей до года, а наименьший - в возрасте 4-10 лет, затем снова в 16-28 лет возрастал до 18,2%. Из всех обследованных павианов анубисов кампилобактерий были выделены только у одного детёныша до года, что составило 10%.
Таким образом, наиболее инфицированными являются детёныши первого года жизни и среди них на первом месте макаки яванские. Встречаемость возбудителей кампилобактериоза среди детёнышей и обезьян старше года различна (р 1,97). Сравнительный анализ распространённости штаммов Campylobacter среди других возрастных групп животных показал, что частота встречаемости данных патогенов у них не имеет достоверных различий (р 1,97).
Одновременно с исследованиями на Campylobacter фекалии всех здоровых животных были подвергнуты бактериологическому обследованию на носительство патогенных, условно-патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Посевы проводили на дифференциальные среды Эндо и Плоскирева, кровяной агар, желточно-солевой агар, селективные среды для выделения Proteus, Pseudomonas, с последующей идентификацией выделенных микробов по общепринятой схеме. В результате было установлено, что у всех здоровых обезьян в фекалиях обнаруживаются Escherichia coli, Enterococcus spp. (100%). Наряду с этим, в фекалиях животных в 18,5% случаев выявлены условно-патогенные бактерии (Уlib), такие как Proteus spp., Providencia spp. — в 7,3%, Citrobacter spp. - в 3,2%, Klebsiella spp. - в 0,9%, Serratia и Edwardsiella - в 0,1%. Из патогенных энтеробактерий Shigella flexneri (тип 0 и 4а) были выделены в 4 случаях, что составило 0,4%.
Полученные данные соответствуют установленным в лаборатории нормативным показателям микрофлоры толстого кишечника здоровых обезьян. Таким образом, у клинически здоровых обезьян, несмотря на значительную инфицированность кампилобактериями (20,9±1,4%), отклонений от нормативных показателей в содержании энтеробактерий не наблюдается.
Нами проведено обследование на продолжительность носительства Campylobacter spp. в специальных опытах на детёнышах обезьян, содержащихся в индивидуальных клетках (в яслях) и находящихся на искусственном вскармливании, а также экспериментальных животных, содержащихся длительное время в специальном помещении. Каждая из этих обезьян обследовалась в среднем четыре раза с интервалом в один месяц. Все посевы после взятия ректального тампона проводили немедленно на селективную питательную среду Campylobacter Agar, а также ставили РКА и ПЦР. У 13 из 40 наблюдаемых обезьян были выделены Campylobacter spp., что составляет 32,5±7,4%. Необходимо отметить, что во время исследований у некоторых экспериментальных обезьян наблюдалась дисфункция кишечника и методом генной диагностики (ПЦР) было подтверждено наличие С. jejuni, хотя бактериологически не удалось выделить культуру. Из 25 клинически здоровых детёнышей у 8 были высеяны Campylobacter spp. (32±9,3%), причём четверо животных были постоянными бактерионосителями в течение трёх месяцев. Следовательно, длительность бактериовыделения у детёнышей может быть от нескольких дней до нескольких месяцев. Здоровое ли это носительство или субклиническая форма заболевания с достоверностью сказать нельзя. Но, возможно, здоровое, поскольку детёныши нормально росли, развивались, были активны и не отставали в весе.
Обнаружение Campylobacter при острых кишечных инфекциях у обезьян
. С целью установления возможной этиологической связи кампилобактерий с острыми кишечными инфекциями было обследовано 189 больных и 132 погибших от острых кишечных заболеваний обезьян (табл. 11). Из табл. 11 видно, что основная масса обследованных больных и погибших животных принадлежала к роду макак (макаки резусы, макаки яванские, макаки лапундеры, макаки ассамские) и значительно меньшее количество - к родам павианов (павианы гамадрилы, павианы анубисы) и хлороцебус (мартышки зелёные).
Все животные с диареей обследовались в первые два дня заболевания, до начала лечения. 50% больных животных (94 из 189) были обследованы от двух до четырёх раз в процессе лечения. У погибших обезьян материал для исследования брали на вскрытии из трёх отделов кишечника (тонкой, слепой и прямой кишок) и иногда из желудка. Кампилобактерии обнаружены у 80 из 189 (42,3±3,6%) больных и 50 из 132 (37,9±4,2%) погибших от ОКИ обезьян. У больных животных эти бактерии найдены в первые дни заболевания. При обследовании во время лечения через 3-5 дней, а также после окончания лечения, кампилобактерии обнаружены не были. Из 132 погибших обезьян 11 находились на лечении. У 8 из этих животных кампилобактерии post mortem обнаружены не были. Однако у 3 обезьян, погибших на следующий день после начала лечения, были обнаружены С. jejuni. В двух случаях с диагнозами «травма, покусы» и погибших на фоне судорожного синдрома при последующем исследовании методом ПЦР были выявлены С. jejuni в тонком и прямом отделе кишечника соответственно. Кампилобактерии чаще удавалось выделить из слепого отдела кишечника, чуть реже - из тонкого. Всего от больных и погибших обезьян выявлено 113 штаммов С. jejuni (86,9%), 4 штамма С. coli (3,1%) и 13 штаммов С. spp. (10%), вид которых установить нам не удалось. Большинство обезьян, выделявших С. jejuni относилось к роду макак, в том числе макакам резусам и макакам яванским (53 и 18 особей соответственно).
Частота обнаружения кампилобактерии среди разных видов больных обезьян была неодинаковой. Как видно из данных табл. 11, наиболее часто их удалось выделить у больных макаков резусов (53,7±5,1%) и павианов гамадрилов (42,9±18,7%). Также высока частота выявления у макаков яванских (34,4±6,1%) и макаков лапундеров (29,4±11,1%). У больных павианов анубисов, мартышек зелёных, макаков ассамских и мангобея кампилобактерии обнаружены не были (рис. 6).
Что же касается погибших от ОКЗ обезьян, то наиболее высока частота обнаружения (50±10,2%) кампилобактерии у погибших павианов гамадрилов. Обнаружение этих патогенов от погибших макаков резусов и мартышек зелёных, как видно из табл. 11 примерно одинаково (39,6±6,1% и 37,5±17,1% соответственно). Частота обнаружения Campylobacter у макаков яванских составляет 30,2±7,0%. У погибших павианов анубисов возбудители кампилобактериоза обнаружены не были. У одной из двух погибших макаов лапундеров post mortem был обнаружен C.jejuni (табл. 11, рис. 7).
При сравнительном анализе выявлено, что частота обнаружения Campylobacter среди макаков резусов и макаков яванских была достоверно различна (р 1,97).
Данные по обнаружению Campylobacter среди разных возрастных групп больных и погибших обезьян представлены в табл. 12. При анализе этих данных видно, что с высокой частотой возбудители кампилобактериоза обнаружены в трёх возрастных группах: до 1 года (50%), от 1 до 3 лет (50,6%) и от 16 до 28 лет (50%). В других возрастных группах, начиная с 4 до 15 лет, наблюдается некоторое снижение частоты выделения кампилобактерий с 34,2% до 25,7% соответственно. Выраженные статистически достоверные различия при этом обнаруживаются между детёнышами, обезьянами — подростками (1-3 года) и взрослыми животными (4-15 лет) (р 1,97).
При анализе результатов обнаружения кампилобактерий у разных видов обезьян в зависимости от возраста, мы установили, что наибольшая частота выделений у больных ОКЗ макаков резусов и павианов гамадрилов во всех возрастных группах (у макаков резусов - от 26,1% до 66,7%, а у павианов гамадрилов - от 37,5% до 62,5%). У больных макаков яванских достаточно высокий процент обнаружения возбудителей кампилобактериоза до года и в возрасте от 16 до 28 лет (40% и 50% соответственно), в то время как в других возрастных группах частота выявления кампилобактерий значительно ниже (18,4% - 23,1%). Как видно из табл. 12, у макаков лапундеров и мартышек зелёных разных возрастов частота обнаружения возбудителей кампилобактериоза также достаточно высока (в среднем 27,2%). У больных павианов анубисов кампилобактерий обнаружены не были.
Частота обнаружения кампилобактерий у погибших обезьян с разными патоморфологическими диагнозами представлена в табл. 13.
![Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс]](/i/i/4703/193414.png "Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс] Ахмедова Гульнора Махмуджановна")
