Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Краткие сведения о возбудителе кишечного иерсиниоза 14
1.2. Культурально-морфологические свойства Y. enterocolitica 17
1.3. Биохимические свойства иерсиний 19
1.4. Антигенное строение и серологические свойства иерсиний 21
1.5. Патогенность Y. enterocolitica 23
1.6. Психрофильные свойства иерсиний 25
1.7. Устойчивость во внешней среде и влияние на Y. enterocolitica различных факторов 28
1.8. Роль сельскохозяйственных животных в эпидемиологии и эпизоотологии иерсиниоза 31
1.9. Y. enterocolitica в мясе и мясопродуктах 35
1.10. Лабораторная диагностика иерсиниоза 38
Глава 2. Экспериментальная часть 43
2.1. Материалы и методы 43
2.1.1. Штаммы и биопрепараты 43
2.1.2. Питательные среды 43
2.1.3. Тест-системы для изучения биохимических свойств 45
2.1.4. Методика выделения Y. enterocolitica из мяса и мясопродуктов, изучение и идентификация выделенных штаммов 46
2.1.5. Изучение влияния параметров холодильной обработки и режимов хранения мяса на выживаемость Y.enterocolitica 52
2.1.6. Исследование выживаемости Y.enterocolitica при температурах +2...+4 С в мясном фарше в зависимости от различных концентраций NaCl 53
2.1.7. Методика определения влияния нитрита натрия, фосфатов и лактата на жизнеспособность Y.enterocolitica в мясном фарше 54
2.1.8. Исследование антагонистического действия стартовых культур и сушки на выживаемость Y.enterocolitica в традиционных сыровяленых колбасах 55
2.1.9. Непрямой метод флуоресцирующих антител для быстрого обнаружения Y.enterocolitica в мясе 57
2.2. Результаты исследования и их обсуждение 58
2.2.1. Исследование мяса и мясопродуктов на наличие иерсиний 58
2.2.2. Изучение влияния низких температур на динамику размножения Y.enterocolitica в мясном фарше 65
2.2.3. Определение эффективности пищевых добавок (соли, нитрита натрия, фосфатов, лактата) и стартовых культур для подавления роста Y. enterocolitica в мясопродуктах при созревании фарша 70
2.2.4. Влияние стартовых культур и сушки на жизнеспособность Y.enterocolitica в традиционных сыровяленых колбасах 81
2.2.5. Индикация Y.enterocolitica в мясе непрямым методом флуоресцирующих антител 84
Заключение 88
Выводы 97
Список использованных литературных источников 98
Приложение 1 116
- Антигенное строение и серологические свойства иерсиний
- Лабораторная диагностика иерсиниоза
- Изучение влияния параметров холодильной обработки и режимов хранения мяса на выживаемость Y.enterocolitica
- Изучение влияния низких температур на динамику размножения Y.enterocolitica в мясном фарше
Введение к работе
Актуальность темы
Интерес к проблеме кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза возрастает с каждым годом, что обусловлено не только широким распространением этих заболеваний, но и большим экологическим значением их возбудителей. До недавнего времени они считались достаточно редкими и не привлекали к себе особого внимания специалистов. Но с 60-70 гг. ситуация изменилась, когда была доказана их повсеместная распространенность.
Для специалистов мясной промышленности важно то, что мясо и мясопродукты являются частыми факторами передачи при иерсиниозе. По современным представлениям, кишечный иерсиниоз относится к пищевым зоонозам, то есть к болезням, источником инфекции при которых являются больные сельскохозяйственные, домашние и дикие животные, а факторами передачи — пищевые продукты. Установлено, что при кишечном иерсиниозе потенциальными факторами передачи бактерий являются пищевые продукты животного происхождения (мясо, молоко), а также корма, овощи, фрукты, которые могут быть контаминированы на всех этапах их получения, хранения и реализации (Покровский, 1993; Ющенко, 1997; Ленченко, 2002).
По данным ВОЗ (1977) распространенность иерсиниоза носит глобальный характер, и эта болезнь регистрируется более чем в 30 странах мира, но чаще в странах с более прохладным климатом. В частности, в Финляндии абсолютное число заболевших в 1999 г. составило 634 человека, в 2001г.- 720 человек; в Швеции в 1999 г.—549 человек, в 2001 Г.-579 человек; в Дании соответственно 337 и 285 человек. В Латвии, Литве, Эстонии и Архангельской области уровень заболеваемости характеризуется средними показателями, но имеет тенденцию к повышению. Например, в Латвии в 1999 г. абсолютное число заболевших составило 181 человек, а 2001 г. — 204 человека, в Архангельской области 100 и 220 человек. Число заболевших иерсиниозом в Санкт-Петербурге в 1999 г. - 478 человек, в 2001 - 321 человек.
Заболеваемость иерсиниозом в РФ на протяжении многих лет остается на достаточно высоком уровне. По данным Центрального НИИ Эпидемиологии Минздрава России этот показатель варьирует по отдельным регионам страны и на некоторых территориях сохраняется достаточно высоким — до 40-50 и даже 138 на 100 тыс. населения.
В странах северного полушария - Нидерландах, Бельгии, Дании, Норвегии, Финляндии, а также в Германии, Канаде, Австралии кишечный иерси-ниоз по уровню заболеваемости занимает третье место среди ОКИ после сальмонеллеза и кампилобактериоза (Garrigue, Poveda, Carniel, 1993; Logue et al., 1996; Померанцев, Васильев, 1998; Ленченко, 2000). В России иерсинио-зы занимают второе место после сальмонеллезов, а в некоторых странах превосходят по распространенности сальмонеллез, колибактериоз и шигеллез (Куликовский, Джентемирова, 1993; Куликовский, Соснина, 1995; Черкасский, 1995; Померанцев, Васильев, 1998; Шумилов, Мельниченко, 1998).
По данным Саратовского областного центра санэпиднадзора за период с 1997 по 2002 гг. в области систематически регистрируется иерсиниоз среди людей, причем доля детей среди заболевших составляет 60 %. Наблюдается рост заболеваемости: 1999 г. - 10 случаев, 2000 г. - 26, 2001 г. — 18. В 2001 г. с целью изучения иммунной прослойки среди населения по иерси-ниозам в 17 районах Саратовской области сотрудниками областного центра санэпиднадзора г. Саратова были обследованы 534 человека. Из них у 13 человек (2,4 %) обнаружены антитела к Y. enterocolitica ОЗ серовара в диагностических титрах, в том числе у 10 человек — 1:200: у 2 — 1:400, у 1 — 1:800. Лица с диагностическими титрами были выявлены в Аркадакском районе — 3, в Хвалынском - 4, в Петровском - 6. Причем, отмечается профессиональная принадлежность серопозитивных лиц в Петровском районе - доярки, свинарки, конюхи, что хорошо согласуется с данными Е.С. Осипчук (2003) о широком распространении кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в этом районе и подтверждает мнение некоторых авторов об иер-синиозе как о профессиональном заболевании (Колос, 1989).
Проблема иерсиниозов является актуальной как для здравоохранения, так и для предприятий пищевой промышленности. Центр Госсанэпиднадзора г. Москвы сообщает, что экономический ущерб, нанесенный иерсиниозами в 1997 г., составил 1 млрд. 208 млн. рублей (Зайцев и соавт., 1999; Шаханина, Осипова, Радуто, 2001). Н.М. Хакимов (1999) указывает, что 3-15 % всех ОКИ приходится на долю иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Однако следует отметить, что по количеству выявленных случаев нельзя судить об истинном распространении заболеваний, так как в связи с клиническим полиморфизмом они нередко проходят под другими диагнозами: дизентерия, сальмонел-лез, вирусный гепатит А, аппендицит и др. (Догель, Карплюк, 1984; Ценева, 1997; Зайцев и соавт., 1999; Ленченко, 2002). В.И. Покровский (1999) отмечает, что, несмотря на выраженную тенденцию к увеличению числа заболеваний иерсиниозами, данные часто являются заниженными из-за недостаточно полной их регистрации.
Официальная регистрация иерсиниоза животных в РФ стала проводиться лишь с 1996 г. (Санитарные правила СП 3.1. 094 - 96; Ветеринарные правила ВП 13.3.1318 - 96). До этого появлялись только единичные публикации об изоляции Г. enterocolitica от сельскохозяйственных животных (Васильев, 1986; Кирьянов, Савчук, 1989; Стефанов, 1989; Писаренко, Куцева-лов, Проценко, 1990; Каландадзе, 1991).
Иерсиниоз сельскохозяйственных животных впервые был обнаружен в Саратовской области Л.Ф. Зыкиным и соавт. в 1997 году. В течение последних семи лет на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Саратовского государственного аграрного университета проводятся исследования по иер-синиозу сельскохозяйственных животных. Их результаты обобщены в диссертациях З.Ю. Хапцева, СВ. Иващенко, Е.С. Гвинджилия, многочисленных отчетах, докладах и публикациях.
За последние десятилетия отечественными и зарубежными исследователями получены новые результаты, позволяющие иначе рассматривать некоторые вопросы этиологии, патогенеза и эпидемиологии иерсиниоза.
Но, несмотря на определенные успехи в проблеме изучения кишечного иерсиниоза, особенно в медицинском аспекте, остается много неизученных вопросов, например, касающихся роли мяса и мясопродуктов как факторов передачи при этой инфекции.
Анализируя современную литературу, можно сделать выводы, что исследования по обнаружению иерсиний в мясе и мясопродуктах проводятся постоянно. Также опубликованы данные по влиянию различных факторов: рН, упаковки, молочно-кислых бактерий, СВЧ-энергии на выживаемость иерсиний в мясе и мясопродуктах.
Но эти сведения носят несистематизированный, разрозненный характер и не создают цельного представления обо всех аспектах проблемы. В связи со свойством психрофильности, стандартные условия хранения мясопродуктов при низких положительных температурах способствуют размножению и накоплению Y. enterocolitica. Поэтому актуальна выработка условий хранения мясопродуктов, препятствующих накоплению в них возбудителя. Как было сказано выше, иерсиниоз был включен в перечень официально регистрируемых лишь в 1996 году (СП 3.1.094-96, ВП 13.3.1318-96). В связи с этим работники животноводческих хозяйств и мясоперерабатывающих предприятий мало информированы о кишечном иерсиниозе и путях его распространения. В основную группу риска попадают ветеринарные работники (работники хозяйств по уходу и обслуживанию скота, животноводы, зоотехники) и работники мясокомбинатов, птицеферм, птицефабрик, мясоперерабатывающих предприятий.
В Саратовской области исследования по обнаружению иерсиний в мясе и мясопродуктах не проводились. Кроме того, не изучен вопрос о механизмах контаминации иерсиниями мясопродуктов и разработке методов, препятствующих этому процессу. Выяснение всех этих вопросов представляет научный и практический интерес.
9 Целью диссертационной работы явилось выяснение роли мяса и мясопродуктов как факторов передачи возбудителя при иерсиниозной инфекции, а также установление влияния различных технологических факторов и пищевых добавок на выживаемость У. enterocoUtica в процессе производства колбасных изделий.
Задачи исследования:
Исследовать мясо и мясопродукты, отобранные из хозяйств Саратовской области и магазинов г. Саратова, на наличие У. enterocoUtica.
Изучить динамику размножения кишечных иерсиний в мясном фарше при различных режимах охлаждения и хранения мяса и мясопродуктов.
Определить эффективность применения ряда добавок, используемых в мясоперерабатывающей промышленности, для подавления размножения У. enterocoUtica в мясопродуктах.
Провести исследование антагонистического действия молочнокислых микроорганизмов на выживаемость У. enterocoUtica в условиях производства сыровяленых колбас.
Апробировать непрямой метод флуоресцирующих антител для экспресс-индикации У. enterocoUtica в мясе и мясопродуктах.
Научная новизна
Впервые в Саратовской области из мяса и мясопродуктов изолированы культуры У. enterocoUtica'. 10 штаммов обладали признаками вирулентных иерсиний, у остальных четырех маркеры вирулентности носили вариабельный характер.
Доказано, что сыровяленые и сырокопченые колбасы являются благоприятными объектами для размножения в них кишечных иерсиний.
Показано, что использование некоторых штаммов молочно-кислых бактерий оказывает задерживающее действие на рост У. enterocoUtica в сыро-вяленых колбасах.
Установлено, что при стандартных режимах охлаждения и хранения происходит значительное накопление возбудителя иерсиниоза в мясе, что может способствовать передаче иерсиниозной инфекции.
Пищевые добавки, используемые в технологии изготовления мясопродуктов, в определенных концентрациях оказывают ингибирующее действие на размножение Y. enterocolitica.
Показано преимущество непрямого метода флуоресцирующих антител для индикации Y. enterocolitica в мясе по сравнению с бактериологическим методом по чувствительности и скорости проведения анализа.
Практическая значимость
Впервые показано, что мясо из 10 различных районов Саратовской области, а также мясной фарш из сети магазинов розничной торговли г. Саратова контаминированы иерсиниями, то есть могут являться вероятными причинами инфекции. Обращают внимание случаи изоляции иерсиний из мяса, полученного из животноводческих объектов Петровского района, неблагополучного по иерсиниозу.
Установлено, что быстрое охлаждение мяса при —3...—5 С и последующее его хранение при —1...-2 С оказывают задерживающее действие на размножение Y. enterocolitica и могут быть рекомендованы технологам мясоперерабатывающих производств как наиболее эффективные для подавления размножения этих бактерий в мясе.
В результате проведенных исследований определены концентрации пищевых добавок, препятствующие накоплению в мясопродуктах возбудителя иерсиниоза: хлорид натрия в концентрации 4,5 %, нитрит натрия — 0,01 %, фосфаты - 0,5 %, лактат натрия - 0,3 %.
Непрямой метод флуоресцирующих антител является более информативным и эффективным методом обнаружения Y. enterocolitica в мясе и мясопродуктах по сравнению с культуральным методом, позволяет существен-
но сократить время проведения анализа и рекомендуется как экспресс-метод при выявлении иерсиний в мясе.
Апробированные схемы выявления возбудителя иерсиниоза в мясе и мясопродуктах: экспресс-индикация и бактериологическое исследование рекомендуются к использованию практическим лабораториям при контроле мяса и мясопродуктов.
По результатам исследования подготовлены «Методические рекомендации по обнаружению Y. enterocolitica в мясе и мясопродуктах», утвержденные УМК Института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» им. Н.И. Вавилова (протокол № 34 от 17 декабря 2004 г.). Разработанные методические рекомендации позволяют получить полное представление о проведении исследования мяса на наличие Y. enterocolitica и могут быть использованы специалистами всех уровней, связанными с проведением экспертизы мяса и мясопродуктов, а также при обучении студентов специальностей «Технология мяса и мясопродуктов», «Ветеринария» и «Биотехнология».
На защиту выносятся следующие положения:
Инфицированность мяса и мясопродуктов Y. enterocolitica на территории Саратовской области составляет 9, 92 %.
Наиболее эффективным режимом холодильной обработки для подавления жизнеспособности иерсиний в мясе и мясопродуктах является охлаждение при —3...-5 С с дальнейшим подмораживанием.
Хлорид натрия, нитрит натрия, фосфаты и лактат в определенных концентрациях (4,5 %, 0,01 %, 0,5 %, 0,3 % соответственно) значительно уменьшают количество кишечных иерсиний в мясном фарше.
4. Препарат ПБ-МП, в состав которого входят штаммы L.plantarium,
оказывает сильное ингибирующее действие на размножение Y.enterocolitica.
5. Непрямой метод флуоресцирующих антител обладает высокой чувствительностью (1x104 КОЕ/мл) и является в два раза более информативным, чем бактериологический метод.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Межрегиональных научных конференциях молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения» (Саратов, 2003; 2004), на Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки — к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003), а также на 2-ой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004).
Материалы диссертации представлены в отчетах НИР Института ветеринарной медицины и биотехнологии в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2003 - 2004 гг.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводов и списка использованных литературных источников. Обзор литературы включает 10 разделов, посвященных проблеме иерсиниоза как инфекции, факторами передачи при которой, в частности, являются мясо и мясопродукты. Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста, включают 7 рисунков, 12 таблиц. Список использованных литературных источников включает 182 наименования, в том числе 65 иностранных.
13 Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы . Института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» в рамках основных тем направления работы кафедры:
НИР № 21/02 «Роль сельскохозяйственных животных в распространении некоторых бактериальных и вирусных инфекций в Саратовской области» (2001 - 2002 гг.).
НИР № 21/ОЗВ «Разработка и внедрение эффективных методов дифференциальной диагностики туберкулеза, кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулеза, листериоза и лейкоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области» (2002 — 2003 гг.).
Антигенное строение и серологические свойства иерсиний
Клетки возбудителя иерсиниоза обладают соматическим О-антигеном липополисахаридной природы, а при температуре инкубирования ниже 30 С-жгутиковым термолабильным Н-антигеном, разрушающимся при кипячении (Wauters, 1972). Все штаммы Y.enterocolitica имеют общий для представителей семейства Enterobacteriaceae поверхностный К-антиген. Отличительной особенностью микроорганизмов вида Y.enterocolitica является выраженное антигенное разнообразие (более 50 О-антигенов и 20 Н-антигенов) (Bockemuhl, Wong, 2003).
Свежевыделенные штаммы возбудителя иерсиниоза, патогенные для человека и обладающие вирулентностью, способны продуцировать антигены вирулентности Vi и W, расположенные в наружной клеточной мембране, которые не продуцируются при хранении в условиях лаборатории (Ющенко, 1985; Ценева, 1992; Померанцев, Васильев, 1998; Галимзянов и соавт., 2001). Н-антигены, различные по своему строению, имеют диагностическое значение в реакции агглютинации при температуре культивирования иерсиний не выше 26-28 С. В этой связи необходимо заметить, что О-серотипирование культур возбудителя иерсиниоза, выросших при 35-37 С, может приводить к сомнительным или отрицательным результатам. Это связано не столько с изменением структуры ЛПС, сколько с «экранированием» его поверхностными белковыми антигенами, синтезируемыми при температуре тела человека (Смирнов, 2004). По О-антигену, устойчивому к нагреванию и действию этанола выделяют 51 серовариант Y.enterocolitica. Среди людей и животных наиболее распространены серовары ОЗ; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 07,8; 08; 09 (Ценева, 1992; Галимзянов и соавт., 2001). Большинство штаммов, выделенных от человека при заболевании иерсиниозом, относится к сероварам 09 — 66 %, 03 - 30,5 %, несколько реже регистрируются сероварианты 05,27 - 3 %, 08 — 0,5 % и 06,30 — 0,2 % (Ющенко, 1985). От крупного рогатого скота, свиней и из продуктов животноводства (мяса, молока) чаще выделяют серовары ОЗ; 05,27;09;017.
В связи с неоднородностью О - и Н - антигенов, содержащих специфические и перекрестно-реагирующие антигены, патогенные иерсинии имеют антигенное сродство с другими возбудителями инфекций: сальмонеллами некоторых серогрупп, вибрионами, шигеллами, протеем, возбудителем туляремии, но наиболее выраженное - между Y.enterocolitica серогруппы 09 и возбудителем бруцеллеза (Дунаев, Амиркулов, 1981; Ющенко, Дунаев, 1987; Смирнов, 2004). Перекрестные антитела обнаруживают в сыворотках больных бруцеллезом и иерсиниозом, что затрудняет диагностику этих заболеваний (Ющенко, Дунаев, 1980; Померанцев, Васильев, 1998). Антигенное родство этих возбудителей связано с их антигенными компонентами липополи-сахаридного комплекса, расположенного в клеточной стенке.
Установлена взаимосвязь между принадлежностью Y.enterocolitica к определенному биовару, серовару и источником их выделения. Известно, что штаммы возбудителя иерсиниоза, циркулирующие на территории европейских стран и России, относятся к серогруппам ОЗ; 05,27 и 09 (биовары 4, 2 и 3); в странах Северной Америки, наряду с указанными, часто выделяют другие «патогенные» серогруппы: 04,32; 08; ОІЗа; ОІЗЬ; 018; О20; 021, принадлежащие к биовару 1В. Эти данные подтверждаются результатами биоти-пирования штаммов Y.enterocolitica, изолированных из молока КРС из различных районов Саратовской области (Спиряхина, 2004). Часто выделяют непатогенные виды иерсиний, принадлежащие к биовару 1А (Смирнов, Це-нева, 1991; Смирнов, 2004).
Для вирулентных возбудителей иерсиниоза характерно наличие всех основных факторов патогенности, свойственных энтеропатогенным факультативным паразитам, в том числе: 1) адгезии, колонизации, пенетрации; 2) антифагоцитарных, антикомплементарных свойств, способности к размножению in vivo; 3) токсинов и токсических продуктов, вызывающих патологические процессы (Ценева, 2000; Смирнов, 2004).
Среди Y.enterocolitica, выделяемых от людей, животных и внешней среды, безусловно, вирулентными являются серовары ОЗ; 05,27 (биовара 4 и Зв) и 09 (биовара 2) (Fukushima et al., 1997), широко циркулирующие в природе и обусловливающие значительную распростаненность иерсиниоза в нашей стране и за рубежом. Другие представители Y.enterocolitica, относящиеся к сероварам 04,32; 08; 013а; 018; О20 и 021 и описанные как «американские типы», отличаются высокой патогенностью и способны вызвать инфекционный процесс. Среди них наиболее вирулентным является серовар 08, вызывающий вспышки энтероколита с летальным исходом. Есть сообщения о заболеваниях и даже вспышках, вызываемых Y.enterocolitica сероваров 07,8; 06,30; ОЗ (Гурлева, Колпинова, 1989).
Лабораторная диагностика иерсиниоза
Возбудитель кишечного иерсиниоза изучен менее других патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae, что во многом определяет трудности работы с ним. Основными недостатками лабораторной диагностики этого заболевания является малая чувствительность методов и длительность выделения и типирования иерсиний (Померанцев, Васильев, Золотухин, 2000). В.И. Дунаев и соавт. (1986) утверждают, что выделение иерсиний затруднено, в первую очередь, потому, что колонии этих микроорганизмов имеют небольшие размеры и легко перекрываются более крупными колониями быстро размножающейся кишечной микрофлоры. Данный факт приобретает особое значение при исследовании мяса и мясопродуктов, которые достаточно сильно контаминированы непатогенной и условно-патогенной микрофлорой. Поэтому важными моментами лабораторной диагностики иерсиниоза при исследовании мясных продуктов являются ингибирование посторонней микрофлоры и сокращение времени проведения анализа.
Для санитарно-бактериологического исследования берут смывы с инвентаря, тары, оборудования пищевых производств, животноводческих объектов (Рекомендации по дифференциальной диагностике бруцеллеза и иер 39 синиоза и меры по их профилактике, 2000). Исследуют также корма, молоко и молочные продукты, мясо и мясные продукты. Способы забора материала и его обработки регламентированы в Инструкции по эпидемиологии, лабораторной диагностике иерсиниозов, утвержденной Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко (1990), а также описаны в методиках по лабораторной диагностике Г.В. Ющенко (1985) и Г.Я. Ценевой (1992; 1997).
В связи с психрофильностью и неприхотливостью иерсинии широкое применение при обследовании на иерсйниоз получил метод выделения иерсинии, основанный на подращивании их при низких положительных температурах (+4...+8 С) в фосфатно-буферном растворе (Дунаев, Ющенко, Ел-кина, 1986). Этими же авторами была предложена для подращивания вместо фосфатного буфера стерильная дистиллированная вода (рН 6,8), в которой погибало до 80 % микрофлоры кишечника, а гибель иерсинии не превышала 10-20 %. Некоторыми авторами подчеркивается диагностическая эффективность жидкой среды накопления — БКД (Ценева, 1992; 1997; Хапцев, 2000; Ющук и соавт., 2003).
Способность иерсинии выживать при температурах замораживания 30 С и даже — 70 С положена в основу одной из методик выделения иерсинии из материала - «холодовой удар». Первыми авторами, предложившими эту методику, были В.И. Дунаев и Г.В. Ющенко (1986). Были испытаны два режима замораживания: при — 6 ...— 12 С и — 30 С. В этих условиях погибало 80-97 % кишечной флоры, а иерсинии выживали в 80-90 %. Результаты этих исследований подтверждаются сообщениями других авторов, получивших аналогичные результаты при исследовании пищевых продуктов (Mick-ova, 1990; Ленченко, Штукарева, 1995).
Учитывая относительную резистентность к щелочи иерсинии и чувствительность к ней других энтеробактерий, некоторые специалисты предлагают перед высевом со среды накопления на дифференциально 40 диагностические среды использовать методику щелочной обработки с целью ингибиции посторонней микрофлоры (Ющенко, 1985; Ценева, 1992).
Из дифференциально-диагностических сред по мнению многих авторов наиболее эффективными являются среда Эндо, позволяющая распознать колонии лактозоположительных культур, среда Серова с мочевиной, а также среды с индикатором бромтимоловым синим (ИПС, СБТС) (Ющенко, 1980, 1987; Ценева, 1992, 1997; Онищенко, 1999). Некоторые авторы подчеркивают преимущества сред с бромтимоловым синим, в состав которых входят ингибиторы, подавляющие рост сопутствующей кишечной микрофлоры и позволяющие увеличить высеваемость иерсиний (Кожаева, Померанцев, 2000; Хайруллина, Черепанова, Нафеев, 2002).
Одними из важных признаков энтеропатогенных иерсиний считают отсутствие пиразинамидазной активности. О наличии у иерсиний пиразина-мидазы свидетельствует темное окрашивание поверхности агара с выросшими иерсиниями в результате образования кислоты. Доказано, что результаты теста не зависят от содержания pYV, но зависят от принадлежности к тому или иному виду, биотипу, серотипу, что дает основание считать его ценным методом дифференциации патогенных и непатогенных иерсиний (Kandolo, Wauters, 1985; Naktin, Beavis, 1999; Кузнецов, 2000; Ющук и соавт., 2003).
Ряд авторов утверждают, что для правильного решения вопроса о вирулентности штамма необходимо, помимо определения серотипа и биотипа, исследовать его факторы патогенности (Ющук и соавт., 2003). Проверка вирулентности Y.enterocolitica на лабораторных животных не всегда удается, так как этот возбудитель является слабо патогенным для лабораторных животных и не вызывает видимых изменений внутренних органов (Белова, Ющенко, 1968; Kwaga, Iversen, 1992; Хапцев, 1999). В связи с этим, большое значение для лабораторной диагностики иерсиниозов приобретает определение маркеров вирулентности иерсиний (Опочинский и соавт., 2002).
Исследованиями И.В. Смирнова (1991) установлено, что для Y.enterocolitica с плазмидой/?ГКхарактерным является признак температуро зависимой морфологии колоний. В качестве ведущего адгезина иерсиний может рассматриваться белок YadA, необходимый для прикрепления патогена к эукариотическим клеткам (Cornelis et ah, 1998). Yad А обуславливает ау-тоагглютинацию иерсиний и защищает клетки возбудителя иерсиниоза от действия человеческой сыворотки, что естественно усиливает вирулентность иерсиний.
Наиболее детально изучен вопрос о проявлении температурозависимых потребностей у вирулентных иерсиний в ионах кальция (Gemski, Lazere, Casey, 1980; Grant, Bennett-Wood, Robins-Browne, 1998).
С помощью тестов на вирулентность (определение кальцийзависимо-сти, температурозависимой морфологии колоний, пигментсорбции, феномена аутоагглютинации, РА с сывороткой СВИ) были проверены с положительным результатом 15 штаммов Y.enterocolitica, выделенные от свиней и КРС, а также 19 штаммов, изолированные из молока КРС хозяйств Саратовской области (Хапцев, 2000; Осипчук, 2003).
Многие авторы рекомендуют использовать более информативные серологические и иммунологические методы, обладающие высокой чувствительностью и строгой специфичностью. К наиболее перспективным иммунологическим методам относят РКОА, ИФА, НМФА и РЛА (Шпилюк и соавт., 1988; Ценева, 1992). Результаты собственных исследований З.Ю. Хапцева (1998) показали, что РКОА является достаточно специфичной, обладает вы-сокой чувствительностью (5x10 —1x10 КОЕ/мл) и эффективностью 56-65 %. Эти данные согласуются с сообщениями О.Ф. Белой и соавт. (1990) и Г.Я.Ценевой (1992).
Изучение влияния параметров холодильной обработки и режимов хранения мяса на выживаемость Y.enterocolitica
Изучение влияния режимов холодильной обработки и хранения на динамику размножения Y.enterocolitica в мясном фарше проводили в соответствии со следующей схемой: заражение фарша = выдержка в холодильнике при соответствующих режимах определение числа жизнеспособных клеток методом серийных разведений в 0,85 %-м NaCl с последующим высевом на ИПС или CIN — агар = инкубация посевов при 26 С 48 часов= подсчет колоний.
Образцы фарша массой 20 г контаминировали культурой Y.enterocolitica ОЗ серотипа (штамм № 66-82) в дозах 1х103 и 1х104 КОЕ/г фарша и выдерживали при трех соответствующих одностадийных режимах охлаждения.
Для изучения динамики выживаемости возбудителя иерсиниоза при воздействии физико-химических факторов использовали три режима охлаждения:
быстрый (-3...-5 С, 12 - 16 ч);
ускоренный (0 С, 20 - 24 ч);
медленный (+2 С, 26 — 28 ч).
После созревания мяса в холодильнике при вышеназванных режимах определяли число жизнеспособных клеток Y.enterocolitica методом серийных разведений в 0,85 %-м растворе NaCl. Для этого от каждого исследуемого образца фарша отбирали 1 г и растирали в ступке со стерильным 0,85 %-м NaCl в соотношении 1:10. Из разведения 1:100 делали высевы на среду ИПС или CIN-arap в объеме 0,1 мл. Подсчет колоний производили через 48 часов инкубации в термостате при 26 С. В качестве контроля ставили РА на стекле с соответствующей моновалентной кишечно-иерсиниозной сывороткой. Каждый опыт повторяли пятикратно с последующей статистической обработкой результатов. С целью исследования влияния режимов хранения мяса на возбудитель иерсиниоза мясной фарш контаминировали взвесью Y.enterocolitica ОЗ серо-типа (штамм № 66-82) в дозе 1x103 КОЕ/г фарша и выдерживали при различных режимах в холодильнике: +2 С, О С и —1...-2 С. Последний режим с частичным подмораживанием рекомендован как увеличивающий стойкость мяса и мясопродуктов при хранении (Шеффер, Шишкина, Белоусов, 1973). Высевы на дифференциально-диагностические среды и подсчет колоний производили ежедневно. Принадлежность выросших колоний к Y.enterocolitica контролировали постановкой РА на стекле с моновалентной кишечно-иерсиниозной сывороткой. Статистическую обработку результатов исследования производили по общепринятым методам с применением t-критерия Стьюдента (Лакин, 1980) и пакета прикладных программ Statistica 6.0.
С целью изучения влияния процесса посола на выживаемость иерси-ний, были выбраны различные концентрации поваренной соли, применяемые в современном отечественном производстве мясных продуктов: 2,5 % (вареные колбасы); 3,5 % (полукопченые и варено-копченые колбасы); 4,5 % (сырокопченые колбасы).
Для исследования выживаемости предварительно проводили 3-4-х кратный пересев музейного штамма Y.enterocolitica 66-82. Затем активно-растущую суточную культуру высевали на плотную питательную среду и инкубировали 24 ч при температуре 26 С. Из иерсиний, смытых с агара 0,85 %-м раствором хлорида натрия, готовили взвесь, содержащую 1 млрд. микробных клеток в 1 мл, соответствующую стандарту мутности бактериальных взвесей ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Ценева, 1992). Методом серийных разведений получали необходимую для заражения фарша суспензию клеток Y.enterocolitica с последующим контролем методом подсчета количества колоний из соответствующих разведений. Полученную суспензию микроорганизмов вносили непосредственно в 20 г фарша, содержащего различные концентрации NaCl. Модельные образцы фарша заражали из расчета 1x103 и 1x104 КОЕ/г и выдерживали в холодильнике при соответствующей температуре. Высевы производили каждые сутки на среду ИПС или CIN-агар. Контаминированный фарш растирали в ступке со стерильным 0,85 %-м NaCl в соотношении 1:10, с последующим разведением 1:100 и высевали в объеме 0,1 мл. Посевы инкубировали при температуре 26 С 48 часов. Затем подсчитывали колонии, контролируя принадлежность к Y.enterocolitica постановкой РА на стекле. Опыт повторяли пятикратно с последующей статистической обработкой результатов.
Для исследования воздействия нитрита натрия на выживаемость Y.enterocolitica в мясном фарше при созревании применяли концентрации, максимально приближенные к используемым в производстве мясопродуктов: 5 г и 7 г NaNC 2 на 100 кг фарша — для вареных и полукопченых колбас; 10 г NaNC 2 на 100 кг фарша - для варено-копченых и сырокопченых колбас. Кроме того, названные концентрации соответствуют эффективной минимальной концентрации нитритов (50 — 160 мг на 1 кг продукта) для замедления развития патогенных и токсичных микроорганизмов (Люк, Ягер, 2000). С целью изучения влияния лактата натрия на динамику роста возбудителя иерсиниоза в фарше был использован 60 %-й лактат натрия PURASAL S фирмы «PURAC biochem bv» (Нидерланды) - натриевая соль натуральной молочной кислоты, являющаяся продуктом брожения сахара, в концентрациях 3 % и 5 % к массе фарша.
Для восстановления жизнеспособности тест-культуры Y. enterocolitica 66-82 проводили ее многократный пересев, затем высевали на МПА и выра 55 щивали при температуре 26 С. Из суточной культуры делали 1 млрд. взвесь и методом последовательных разведений получали необходимую концентрацию. В образцы фарша массой 20 г вводили необходимые концентрации нитрита натрия (0,005 %, 0,007 % и 0,01 %), тринатриевого пирофосфата Na3HP207 (0,3 % и 0,5 %) и лактата натрия (3 % и 5 %). Затем эти образцы с добавками контаминировали культурой Y.enterocolitica 66-82 из расчета 1x104 КОЕ/г и выдерживали в холодильнике при температуре +2...+4 С, что соответствует температурному режиму созревания фарша в производственных условиях. Высевы производили каждые сутки на среды ИПС или CIN — агар. Предварительно растирали 1 г образца в ступке со стерильным раствором NaCl в соотношении 1:10. Затем 1 мл суспензии разводили 9 мл стерильного физиологического раствора и высевали на чашки со средой в объеме 0,1 мл. После инкубации посевов при 26 С в течение 48 ч, производили подсчет колоний.
Изучение влияния низких температур на динамику размножения Y.enterocolitica в мясном фарше
Результаты исследования воздействия режимов охлаждения на выживаемость Y. enterocolitica в мясном фарше представлены в таблице 4.
При изучении влияния режимов охлаждения на жизнеспособность Y. enterocolitica в мясном фарше установлено, что независимо от заражающей дозы более эффективными являются быстрый и, в меньшей степени, ускоренный режимы охлаждения мяса и мясопродуктов.
Как видно из таблицы 4, при быстром одностадийном охлаждении скорость размножения иерсиний уменьшается в 1,5 раза, по сравнению с ускоренным одностадийным охлаждением. Медленное одностадийное охлаждение способствует быстрому размножению иерсиний в контаминированном мясе. Полученные результаты исследования подтверждают мнение, что об-семененность мяса быстрого охлаждения значительно ниже, чем медленного (Шеффер, Шишкина, Белоусов, 1973).
Далее была изучена динамика выживаемости Y. enterocolitica в мясном фарше при различных режимах хранения. Результаты исследования отражены в таблице 5 и на рисунке 1. В первые сутки хранения при температурах +2 С и О С отмечено резкое увеличение количества клеток в мясном фарше, а наибольшей концентрации они достигали на 3-й сутки. Затем происходило постепенное, но не полное отмирание бактерий. При режиме хранения -1... —2 С в первые сутки наблюдалось незначительное увеличение концентрации иерсиний с последующим интенсивным отмиранием У. enterocolitica, а на 5-е сутки эти микроорганизмы не высевались вообще.
Полученные результаты исследований показали, что мясной фарш является благоприятной средой для интенсивного размножения иерсиний, особенно при стандартных режимах хранения, а температура хранения +2 С наиболее оптимальна для развития Y. enterocolitica. Это подтверждает псих-рофильную природу иерсиний.
Быстрое охлаждение мяса выгодно отличается с санитарно-гигиенической точки зрения, так как при этом замедляется процесс размножения кишечных иерсиний в фарше.
Важно подчеркнуть, что резкое снижение температуры при хранении мяса практически до криоскопической точки обеспечивает эффект торможения роста Y. enterocolitica, а следовательно уменьшает вероятность заражения иерсиниозом. Поэтому режим хранения с подмораживанием (—1... -2 С) может быть рекомендован как наиболее эффективный для ингибирования размножения Y. enterocolitica в мясопродуктах при хранении.
Из материалов вышеприведенных таблиц и рисунков можно заключить, что при всех испытанных концентрациях соли, за исключением 2,5 %, в первые 3 суток происходит резкое увеличение популяции иерсиний. На 4-е сутки количество клеток иерсиний постепенно снижается, но они продолжают высеваться даже на 6-е сутки. На рисунке 3 видно, что при дозе заражения 1x104 КОЕ/г фарша и концентрации соли 2,5 % наблюдается ста-бильный рост и размножение Y.enterocolitica. При дозе 1x1 (Г КОЕ/г и вышеуказанной концентрации соли количество иерсиний постепенно снижается.
Результаты эксперимента показали, что возбудитель иерсиниоза относится к умеренно солеустойчивым бактериям. Также необходимо отметить, что концентрации соли 3,5 % и 4,5 % оказывают наибольшее задерживающее воздействие на рост бактерий независимо от дозы заражения.
Исследования действия нитрита натрия на жизнеспособность иерсиний показали, что этот консервант значительно снижает количество клеток иерсиний уже с первых суток созревания фарша. Независимо от концентрации нитрита натрия на 3-й сутки иерсиний в образцах фарша не обнаруживали (табл. 9, рис. 4). Это подтверждает мнение некоторых авторов о том, что нитрит натрия является сильнейшим ингибитором патогенной микрофлоры (Люк, Ягер, 2000).
По сравнению с нитритом натрия фосфаты оказывают умеренное подавляющее действие на размножение Y. enter-ocolitica. В 1-2-е сутки созревания отмечали активное нарастание количества иерсиний в фарше. Далее происходил процесс постепенного, отмирания иерсиний. Но даже на 7-е сутки иерсиний высевали в количествах 6,8-1,2x103 КОЕ/г фарша при концентрациях фосфата в фарше 0,3 % и 0,5 % соответственно (рис. 4).
