Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Краткие сведения о возбудителе 13
1.2. Основные свойства возбудителя 14
1.3. Биохимические свойства возбудителя кишечного иерсиниоза 17
1.4. Антигенные свойства Y.enterocolitica 19
1.5. Генетика Y.enterocolitica 21
1.6. Психрофильность иерсиний 22
1.7. Устойчивость иерсиний 24
1.8. Распространение иерсиниозов 27
1.9. Эпизоотология иерсиниоза 28
1.10. Эпидемиология иерсиниоза 34
1.11. Лабораторная диагностика иерсиниоза 37
Глава 2. Экспериментальная часть 42
2.1. Материалы и методы 42
2.1.1. Штаммы 42
2.1.2. Биопрепараты 42
2.1.3. Питательные среды 42
2.1.4. Тест-системы для изучения биохимических свойств 44
2.1.5. Методы выделения, изучения и идентификации штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза 45
2.1.6. Обследование хозяйств и техника исследования молока КРС на Y.enterocolitica 50
2.1.7. Изучение влияния различных режимов пастеризации молока КРС на выживаемость Y.enterocolitica 51
2.1.8. Изучение выживаемости Y.enterocolitica в некоторых кисломолочных продуктах и сырах при различных условиях хранения 52
2.1.9. Апробация ПЦР для индикации Y.enterocolitica в молоке КРС 53
2.2. Результаты исследования и их обсужение 55
2.2.1. Исследование молока КРС хозяйств Саратовской области на наличие возбудителя кишечного иерсиниоза 55
2.2.2. Определение эффективности различных режимов пастеризации для устранения Y.enterocolitica в молоке и изучение выживаемости Y.enterocolitica в некоторых молочных продуктах 65
2.2.3. Использование ПЦР для быстрого обнаружения иерсиний в молоке 73
Заключение 81
Выводы 86
Список использованных источников 88
Приложения 113
- Основные свойства возбудителя
- Распространение иерсиниозов
- Тест-системы для изучения биохимических свойств
- Апробация ПЦР для индикации Y.enterocolitica в молоке КРС
Введение к работе
Актуальность работы
В последние 30 лет пристальное внимание эпидемиологов, бактериологов и инфекционистов привлекает проблема кишечного иерсиниоза -зооантропонозного заболевания, при котором источником инфекции являются сельскохозяйственные, домашние и дикие животные. Факторы передачи - пищевые продукты, в основном животного происхождения (молоко и молочные продукты, мясо и мясные продукты), употребляемые в пищу в сыром виде или хранившиеся при низкой температуре (Онищенко, 1999).
Возбудителю кишечного иерсиниоза особое внимание уделено в международной программе ФАО / ВОЗ по безопасности пищевых продуктов, созданной в рамках ООН (Ленченко, 2002).
Это обусловлено широким распространением возбудителя кишечного иерсиниоза во всем мире. Кишечный иерсиниоз регистрируется более чем в 30 странах: в Европе, США, Канаде, Бразилии, Южной и Северной Африке, Японии, Ираке, Израиле и др. (Ющенко, 1998; 1999). Особенно часто болезнь выявляют в крупных городах с развитой пищевой промышленностью и высоким экономическим уровнем, на территориях с умеренным климатом (Шувалова, 1982; Воронов, 1989).
В Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниозы по уровню заболеваемости населения занимают 3 место после сальмонеллеза и кампилобактериоза (Bockemuhl, 1995; Ленченко, 2000; Васильев, Померанцев, Золотухин, 2000). В странах, где налажена диагностика, на долю иерсиниоза приходится 4 % всех пищевых токсикоинфекций (Ленченко ,2000). В Российской Федерации по данным республиканских информационно - медицинских центров иерсиниозы занимают 2 место после сальмонелезов (Черкасский, Подунова, Акулова, 1995; Померанцев, Васильев, 1998). В некоторых странах иерсиниозы превосходят по распространению сальмонеллез, колибактериоз и шигеллез (Шумилов, Мельниченко, Селиверстов, 1998).
На долю иерсиниоза и псевдотуберкулеза приходится 3-15 % ОКИ (Хакимов, 1999; Косенко, 1999). В последние годы наблюдается выраженная тенденция к увеличению числа заболеваний иерсиниозами, причем нередко данные являются заниженными из-за недостаточно полной их регистрации (Ленченко, 2002; Зайцев, Маненкова, 1999).
В настоящее время заболеваемость людей иерсиниозом составляет 0,3-3,9 на 100 тыс. населения, а псевдотуберкулезом 0,1-8,9 в различных климатических зонах (Ющенко, 1998)
Исследования животных на кишечный иерсиниоз в нашей стране до последнего времени не проводились, и лишь в 1996 г. эта инфекция была включена в перечень официально регистрируемых (СП 3.1.084-96, ВП 13.3.4.1100-96).
При кишечном иерсиниозе особую опасность представляют собой обсемененые иерсиниями пищевые продукты животного происхождения-
7 потенциальные факторы передачи бактерий. Они могут быть контаминированы на всех этапах получения, хранения и реализации, от животного до прилавка магазина (Покровский, 1993; Ющенко, 1997;
Ленченко, 2002).
По данным ряда исследователей серопозитивными в отношении Y.enterocolitica являются от 34,5 до 66,8 % молочных коров (Колос, Гнутов, Ющенко, 1985; Ющенко, 1986; Гурлева, 1987), 6-49 % свиней (Померанцев, Васильев, 1998; Собакин, Зыкин, Хапцев, 1998), овец от 9,5 % до 31,8 % (Колос, Гнутов, Ющенко, 1985; Степанов, 1986; Тихонов, 1999).
Иерсинии высевают от домашних животных, птиц, рыб, грызунов (Тимофеева, 1986; Ющенко, 1997; 1998; Некрасова, 1999).
Особенно важно, что Y.enterocolitica выделяется от 11-14 % коров, как с клиническими признаками иерсиниоза, так и при латентном течении болезни (Степанов, 1980; Ющук, Кареткина, Ценева, 2000).
Иерсинии обнаружены в 20 % проб сырого молока, в 7-9 % проб пастеризованного молока (Померанцев, Васильев, 1998; Ющенко, 1998), в 35,8 % проб пастеризованного молока (Кузнецов, Багрянцев, 1992), в 6 % проб пастеризованных сливок (Ошейкр, Панькова, 1997), а также в мясе и мясных продуктах, птице, яйце, овощах и фруктах (Гордейко, 1990; Невенчаная, 1997; Ющенко, 1998; Березкина, 2001). Y.enterocolitica обнаруживается на различных объектах окружающей среды и в питьевой воде (Березкина, 2001; Покровский, 1986; 1993).
Проблема иерсиниоза была признана ВОЗ глобальной (WHO report, 1980,
8 1998).
Л.М. Ошейкр и Р.Н. Панькова (1997) считают, что "Санитарные правила для предприятий молочной промышленности" № 4431-87 от 12.10.87 не обеспечивают очищения молочных продуктов от возбудителя кишечного иерсиниоза. Поэтому проблема совершенствования существующих режимов пастеризации остается актуальной в настоящее время.
Заболеваемость иерсиниозом привлекает пристальное внимание органов здравоохранения и санэпидслужбы, так как болезнь наносит большой экономический ущерб (1 млрд. 208 млн. руб. только по Москве за 1997) и характеризуется тяжелым клиническим течением, возникновением рецидивов, трудностью клинической диагностики и возникновением групповых очагов (Зайцев, Маненкова, 1999; Ленченко, 2002).
В Саратовской области иерсиниоз сельскохозяйственных животных был обнаружен Л.Ф. Зыкиным и соавт. (1997). Роль пищевых продуктов как факторов передачи иерсиниозной инфекции не изучалась.
Целью работы явилось изучение распространения кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в Саратовской области и выяснение роли молока и молочных продуктов как факторов передачи возбудителя при иерсиниозной инфекции.
Задачи исследования
1. Исследовать сборные и индивидуальные пробы молока КРС
9 хозяйств Саратовской области на наличие возбудителя кишечного иерсиниоза.
Определить эффективность существующих режимов пастеризации молока для освобождения от Y.enterocolitica.
Изучить выживаемость кишечных иерсиний в некоторых кисло -молочных продуктах и сырах.
Апробировать ПЦР для обнаружения ДНК Y.enterocolitica в молоке КРС хозяйств, в которых ранее неоднократно выделялся возбудитель кишечного иерсиниоза.
Научная новизна
Впервые в Саратовской области установлен факт обнаружения вирулентных штаммов Y.enterocolitica в молоке КРС нескольких хозяйств, то есть подтверждена важная роль молока в передаче кишечных иерсиний.
Впервые доказано, что в некоторых сортах мягких сыров происходит размножение и накопление возбудителя кишечного иерсиниоза и, следовательно, эти виды сыров могут играть важную эпидемиологическую роль.
Установлено, что ПЦР является эффективным методом индикации Y.enterocolitica в молоке и по информативности существенно превосходит общепринятый бактериологический метод.
10 Практическая значимость
Выявлен стойкий очаг кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных в Петровском районе Саратовской области с помощью бактериологического метода.
Установлено, что сроки выживания Y. enter-ocolitica в кисломолочных продуктах и сырах твердых сортов не превышают 3-4 суток, тогда как в мягких сырах идет активное размножение иерсиний. Это позволяет оценить мягкие сыры как возможный фактор передачи возбудителя при кишечном иерсиниозе.
ПЦР, является в два раза более информативной чем бактериологический метод и позволяет сократить время исследования до 5 - 6 часов вместо 2 -3 недель при использовании бактериологического и рекомендуется в качестве экспресс - метода при выявлении иерсиний в молоке.
По результатам исследований подготовлены «Методические рекомендации по индикации возбудителя кишечного иерсиниоза в молоке методом полимеразной цепной реакции», утвержденные УМС ИВМиБ
ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» (протокол № 20 от
20 декабря 2002г.).
Материалы диссертации вошли в монографию Л.Ф. Зыкина и соавт. «Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйственных животных», Саратов, 2002, а также используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и ВСЭ ИВМиБ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И.
Вавилова».
На защиту выносятся следующие положения
Показано распространение кишечного иерсиниоза среди сельскохозяйственных животных в Саратовской области.
Изучена выживаемость Y. enterocolitica в некоторых кисломолочных продуктах и сырах.
ПЦР рекомендуется для индикации Y.enterocolitica в молоке КРС.
Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова» в соответствии с плановой тематикой: «Разработка и внедрение эффективных методов дифференциальной диагностики туберкулеза, кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулеза, листериоза и лейкоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области» (2001). «Роль сельскохозяйственных животных в распространении некоторых бактериальных и вирусных инфекций в Саратовской области» (2002).
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на «Научных конференциях
12 профессорско - преподавательского состава и аспирантов СГАУ по итогам научно - исследовательской работы за 2001 и 2002 г.г.», а также на «Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов СГАУ, посвященной
115 - летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова» (2003).
Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2001 - 2002 г.г.
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 4 работы в отечественной литературе.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованных литературных источников и приложения. Материалы диссертации изложена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрированы 14 таблицами и 5 рисунками. Список использованных литературных источников включает 196 наименований, в том числе 59 зарубежных.
Основные свойства возбудителя
Y. enterocolitica представляет собой палочки с закругленными концами длиной 0,8 - 1,5 мкм и шириной 0,5 - 1,0 мкм в зависимости от возраста культуры, температуры и среды культивирования. Грамотрицательные, часто окрашиваются биполярно. Подвижны при температуре не выше 25 С, имеют перитрихиально расположенные жгутики и фимбрии по всей поверхности бактериальной клетки (Водопьянов, Родионова, 1984; Maclagan, 1980; Мартиневский, 1986). При особых условиях культивирования могут образовывать капсульную субстанцию. Спор не образуют (Шувалова, 1982; Лобзина ,2000).
Иерсинии факультативные анаэробы. Неприхотливы и нетребовательны к питательным средам, растут на обычных средах (МПА, агар Хоттингера и Мартена), на средах для выделения энтеробактерий (среды Эндо, Левина). Хорошо развиваются на кровяном и шоколадном агаре, на специальных дифференциально - диагностических средах (среда с бромтимоловым синим, ИПС, среда Серова), а также на бедных средах (ФБР, 1 % ЗПВ) (Ющенко, 1984; Покровский, 1986).
Для иерсинии оптимальная рН 7,2 - 7,4, наиболее благоприятная температура роста 22 - 28 С, при 37 С часто диссоциируют в R - формы, активно размножаются в диапазоне температур от 4 до 14 С, при 40 С рост прекращается (Конопаткин, Артемов, Баракулов, 1993; Покровский, 1999).
На жидкой среде через сутки культивирования иерсинии образуют равномерное помутнение и осадок, поднимающийся при встряхивании в виде косички, могут образовывать пленку на поверхности среды или пристеночное кольцо. R - формы дают рост в виде осадка, среда остается прозрачной (Шувалова, 1982; Фролов, 1987).
На МПА и агаре Хоттингера через сутки при 22 - 28 С иерсинии образуют мелкие (0,1 -0,5 мм в диаметре) круглые, выпуклые, бесцветные, полупрозрачные, блестящие колонии с ровным краем, мягкой консистенции, имеющие голубоватый оттенок в проходящем свете. Через 36 -48 часов колонии теряют прозрачность и голубоватый оттенок, может быть сливной рост (Ценева, 1997). При культивировании при 37 С колонии мелкие, непрозрачные, с неровным краем - R - формы (Смирнов, Ценева, 1991). На среде Эндо иерсинии образуют мелкие, росинчатые, круглые, выпуклые, блестящие, бесцветные колонии с ровным краем и розоватым центром. На вторые сутки колонии увеличиваются в диаметре и могут приобретать розоватый оттенок. На среде Левина вырастают колонии неправильной формы от темно - фиолетового до светло - синего цвета (Гурлева, Колпикова, 1989; Покровский, 1999).
На среде ИПС образуют через сутки мелкие желтые колонии с потемнением среды вокруг них, на вторые сутки колонии и среда приобретают сине - зеленый цвет. Края колоний волнистые, центр приподнят.
При определенных условиях (наличие в среде пенициллина или стрептомицина, хлорида лития и, особенно, метионина) способны образовывать L - формы (Ющенко, 1984; Pease, 1979), а также протопласты и сферопласты (Дзадинева, 1987).
У вирулентных штаммов иерсинии (0:3 серотипа) описана способность образовывать зону Р - гемолиза на агаре с добавлением 5- 10 % бычьей или бараньей крови при температуре 22 С (Pedersen, 1981; Бондаренко, Голубев, 1988). 1.3. Биохимические свойства возбудителя кишечного иерсиниоза Y.enterocolitica обладает широким спектром ферментов, обеспечивающих питательные и энергетические потребности, а также возможность существовать в различных условиях, в том числе во внешней среде. Возбудитель кишечного иерсиниоза не образует сероводород, не разжижает желатин, не образует фермент оксидазу и лизиндекарбоксилазу, не обладает способностью дезаминировать фенилаланин и утилизировать цитрат Симмонса, не разлагает Д - арабинозу, дульцит, инулин, L - ксилозу, лактозу, мелибиозу. Y.enterocolitica выделяет индол, образует ферменты уреазу, каталазу, нитратредуктазу, {3 - галактозидазу, дает положительную реакцию на метилрот. Ферментирует до кислоты без газа арабинозу, глюкозу, маннозу, мальтозу, глицерин, инозит (Томэску, Гаврилэ, Гаврилэ, 1982; Покровский, 1983). У Y.enterocolitica описано наличие гемолизина (фосфолипазы А), продуцируемого бактериями в присутствии лецитина (Бондаренко, Голубев, 1988), что связывают с вирулентностью бактерий. В отличие от псевдотуберкулезного микроба, возбудитель кишечного иерсиниоза не утилизирует рамнозу, дает положительные реакции в тестах на сахарозу, целлобиозу, сорбит, орнитиндекарбоксилазу и вырабатывает фермент пенициллиназу (Кожаева, Васильев, 2000; Померанцев, Васильев, 2000). Вид Y.enterocolitica разделяют на пять биоваров, различающихся по комплексу биохимических тестов (Boer, Nows, Nijland, 1991; Покровский, 1986; 1993; Ценева, 1992; 1997). В настоящее время разработана схема сокращенного биотипирования Y.enterocolitica.
Распространение иерсиниозов
Как уже отмечалось выше, начиная с 60-х гг. XX столетия наблюдается выраженная тенденция к росту заболеваемости кишечным иерсиниозом как людей, так и животных. Иерсиниоз распространен повсеместно (Черкасский, Подукова, Акулова, 1995, Bockemuhl, 1995; Васильев, Померанцев, Золотухин, 2000).
Распространенность иерсиниозной инфекции в большой степени обусловлена психрофильностью возбудителя. Последняя, являясь адаптационным механизмом, обеспечивает микроорганизмам возможность обитания в окружающей среде с относительно низкой и непрерывно меняющейся температурой (Литвин, 1992; 1988).
На территории России в основном выделяют 0:3; 0:5,27 и 0:9 серовары Y.enterocolitica, (Собакин, Зыкин, Хапцев, Оркин, 1998; Померанцев, Васильев, 2001; Нафеев, Никишина, Корчагин, Васильев, 2001), реже 0:22; 0:6,30 и 0:7,8 (Гурлева, 1990; 1997). В Италии также распространены 0:3 и 0:9 серотипы кишечных иерсиний (Хачатрян, Гукасян, Ханджян, 1990). Некоторые сероварианты Y.enterocolitica (0:8; 0:13; 0:18; 0:20; 0:4,32) называют «американскими», в Европе их выделяют очень редко (Zilmour, Walked, 1998; Fukushima, Marugama, Omori, 1997; Онищенко, 1999).
Иерсиний обнаруживают в питьевой воде колодцев (5,4 % случаев), речной воде (8,3-10,5 %), озерной (46,9 %), водопроводной (4 %), а также в сточных водах свинокомплексов и молочно-товарных ферм (10 %) (Дранкин, Гельдыев, 1994; Хачатрян, 1994; Ющенко, 1999). Иерсиний высевают из вод, используемых для орошения полей (14,3 %), а также из растений, выращенных на этих полях (Гордейко, Литвин, Шустрова, 1991; Литвин, 1991; Сомов, 1994).
Одно - и многолетние травы, куда иерсиний проникают через корневую систему, а также вода и почва, где при пониженной температуре и высокой влажности иерсиний могут длительное время сохраняться и размножаться, могут быть резервуаром инфекции (Кузнецов, 1983; Schiemann, 1990; Christensen, 1987). А при пассировании через некоторых водных одноклеточных (инфузорий) иерсиний повышают свою способность противостоять фагоцитозу (Пушкарева, Литвин, 1991; Литвин, 1999).
Иерсиний выделяют от теплокровных животных, птиц, рептилий, рыб, насекомых, простейших, ракообразных (Сомов, 1997). Среди млекопитающих иерсиний высевают от грызунов, землероек, хищных, непарно - и парнокопытных, обезьян, домашних, сельскохозяйственных и диких животных (Kaneko, Hamada, Kato, 1978; Ющенко, 2000). Животные могут быть носителями как патогенных, так и непатогенных штаммов иерсиний. Они могут болеть иерсиниозом с признаками диареи и выбросом возбудителя во внешнюю среду и погибать от инфекции (Furowicz, Gzermonysy - Furowicz, 1996; Барабанова, 1996; Ленченко, 2002).
Существует четкая закономерность выделяемости различных серовариантов кишечных иерсиний из определенных объектов окружающей среды, животных, человека, пищевых продуктов и на различных географических территориях (Смирнов, 2002).
Различают адаптированные к определенному хозяину (заяц, свинья, человек) и неадаптированные или дикие штаммы, чаще выделяемые из объектов окружающей среды (вода, пищевые продукты) с менее выраженными патогенными свойствами (Степанов, 1982).
Роль различных животных в эпизоотическом процессе неодинакова. Источником инфекции могут быть сельскохозяйственные животные и птица: свиньи, КРС, МРС, лошади, олени, куры, и т.д.; домашние животные: кошки, собаки; животные и птицы, содержащиеся в зоопарках и питомниках, а также грызуны (Carter, 1980; Makela, 1986; Стефанов, 1989). Бактерии обычно обитают в кишечнике и выделяются с испражнениями во внешнюю среду. Микроорганизмы могут проникать в кровь, органы и ткани, выделяться с мочой и молоком (Павлов, Филипов, 1982; Lakubsak, 1994; Ленченко, 2002).
В природных биотопах иерсиний паразитируюг; в основном, на мелких млекопитающих из отряда грызунов, насекомоядных и сумчатых. Зараженность их кишечным иерсиниозом составляет 5,3 %, псевдотуберкулезом - 3,9 % (Ющенко, 1998; 1999). У мышевидных грызунов имеет место алиментарный путь распространения инфекции. В цепь естественной циркуляции включаются и другие виды животных и птиц, обитающих в этой местности (Калошина, Ющенко, Шестопалов, 1989; Куликовский, Джентемирова, 1993). Иерсинии обнаружены у некоторых видов клещей, блох и комаров, но трансмиссивный путь передачи этой инфекции не доказан (Ющенко, 1998). Иерсинии выделяют в 10 % от собак и кошек, как с бессимптомным течением инфекции, так и с признаками болезни: диарея, поражение суставов и генерализованная инфекция, приводящая к смерти. Описаны редкие случаи заражения людей от домашних животных (Gueraud, Poveda, Carviel, 1993; Ющук, 2000).
Однако основным источником инфекции при иерсиниозе являются сельскохозяйственные животные - свиньи и КРС, главными факторами передачи - животноводческая продукция, а применительно к животным -инфицированные корма (Куликовский, Сосина, 1995; Черкасский, 1995). Пока не зарегистрировано случая заражения человека кишечным иерсиниозом при употреблении мяса промысловых животных: зайцы, нутрии, ондатры (Ющенко, 1984). В литературе встречаются описания водных вспышек кишечного иерсиниоза в Америке, России и др. странах. Однако вода не является главным фактором передачи инфекции. (Сомов, Тимченко, 1997; Дранкин, Гельдыев, Хотько, 1994).
Тест-системы для изучения биохимических свойств
Для развёрнутого изучения биохимических свойств и рсиний применялись наборы для биохимической идентификации энтеробактерий ММТ Е1 (С. 2, К. 244) и ММТ Е2 (С. 2, К. 733) производства ФГУП «Аллерген» г. Ставрополь. ММТ Е1 включает в себя наборы для определения следующих признаков: образование сероводорода, утилизация маннита, присутствие лизиндекарбоксигазы, утилизация цитрата натрия, уреазной активности, утилизация малоната натрия, сахарозы, наличие дезаминазы фенилаланина, утилизация лактозы, сорбита. ММТ Е2 включает такие тесты: определение аргининдегидралазы, галактозидазы, выявление утилизации инозита, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, салицина, глюкозы и присутствия нитратредуктазы. Для изучения антибиотикоувствительности микроорганизмов использовали диски производства НИЦФ (С. 9), пропитанные растворами следующих антибиотиков: байтрил, гентамицин, левомицетин, карбеницилин, тетрациклин, ампиокс, доксициклин, пенициллин, цефазолин, рифампицин, олеандомицин. При постановке ПНР применяли амплитест - системы производства фирмы «Ниармедик плюс» г. Москва (С. 150402). Тест - система содержит праймеры, специфичные для фрагмента гена ompH Y.enterocolitica с размером фрагмента 324 н.п. Методы выделения, изучения и идентификации штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза Выделение, изучение и идентификацию штаммов Y.enterocolitica проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по лабораторной диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулёза» (Ценева, 1997). Молоко в объёме 0,5 мл засевали в пробирку с 5 мл одной из жидких сред накопления, подращивали при температуре +4 С в течение 7 суток и высевали на дифференциально - диагностическую среду - среда Эндо или ИПС на 3, 5, и 7 сутки, после щелочной обработки жидкой среды.
Отбор подозрительных колоний со среды Эндо проводили через 48 часов инкубирования при 26 С: исследовали мелкие, 1-2 мм в диаметре, выпуклые, полупрозрачные, гладкие, гомогенные серо - белого цвета колонии с ровным краем и более плотным иногда розоватым центром. На среде ИПС через сутки вырастали мелкие и средние (до 4-5 мм в диаметре), выпуклые, матовые, гладкие жёлтые колонии с ровным краем и пожелтением среды вокруг них. На 3 - 4 сутки инкубирования при 26 С колонии на среде ИПС приобретали сине - зелёную окраску, шероховатость и неровный контур, среда восстанавливала цвет. Подозрительные колонии в течение 48 часов подращивали на МБП и инкубировали 2 суток при 26 С. После этого делали мазки и окрашивали их по Граму. В положительном случае при микроскопии обнаруживались мелкие палочки или коккобактерии, грамотрицательные, часто окрашивающиеся биполярно. Затем подозрительные колонии отсевали на среду Олькеницкого уколом в столбик и расштриховкой по скосу. Посевы выдерживали в термостате 48 часов при 26 С. В положительном случае наблюдалось разложение мочевины, что проявлялось окрашиванием среды в малиновый цвет. Отсев уреазаположительных штаммов проводили на среды Гиса с лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. Посевы инкубировали при 26 С 48 часов. Отбирали культуры, разлагающие сахарозу, мальтозу, маннит и не ферментирующие лактозу.
Подозрительные штаммы отсевали методом укола на две пробирки 0,5 %-ного ПЖА и выдерживали одну пробирку при 37 С, а вторую при 26 С 48 часов. В положительном случае наблюдалась подвижность при 26 С, а при 37 С она отсутствовала. Затем изучали биохимические свойства с тест - системами ММТ Е1 и ММТ Е2. Пластинки выдерживали при 26 С 48 часов, после чего проводили визуальный учёт с использованием приложенной таблицы «цветовой указатель». Для определения биотипа культур ставили дополнительные биохимические тесты: выявление лецитиназной активности, ферментаци D ксилозы и реакция Фогес - Проскауэра при 26 С. мтаммы с признаками, соответствующими Y.enterocolitica подвергали серотипированию. При определении лецитиназной активности суточную агаровую культуру засевали в виде бляшки на желточный агар и выдерживали трое суток при 26 С. В положительном случае наблюдалась зона просветления вокруг роста микроорганизмов. При постановке реакции Фогес - Проскауэра, к 1 мл трехсуточной культуры в бульоне Кларка добавляли 0,6 мл 60 % -го спиртового раствора а - нафтола и 0,2 мл. 40 % - го раствора КОН, встряхивали и выдерживали 1 час при 26 С. В положительном случае наблюдалось красное окрашивание всей среды или появление красного крльца.
Апробация ПЦР для индикации Y.enterocolitica в молоке КРС
Исследования проводили в лаборатории диагностики инфекционных болезней Российского НИИ противочумного института «Микроб», заведующий лабораторией профессор А.Н. Куличенко, которому автор приносит глубокую благодарность.
Выделение ДНК из образцов проводили методом нуклеосорбции с трехкратным центрифугированием их при 8000 g 20 сек., приливая в промежутках к осадку поочередно буфер 1, сорбент, буфер 2, буфер 3 и перемешивая на вортексе. После чего, осадок с необходимым количеством бидистилированной воды выдерживали при 65±1 С 10 минут, периодически встряхивая, затем центрифугировали 1 мин. при 8000 g. Для ПЦР использовали 10 мкл супернатанта.
Амплификацию ДНК осуществляли в микропробирках объёмом 0,6 мл. Для этого, на поверхность реакционной смеси, содержащей Taq -полимеразу, под вазелиновое масло наслаивали выделенную из образцов ДНК. Параллельно ставили положительный контроль с иерсиниозной ДНК и отрицательный контроль с деионизированной водой вместо ДНК. Пробирки центрифугировали 5 сек. при 3000 об ./мин и помещали в амплификатор. Проводили 30 циклов амплификации, каждый из которых включал денатурацию ДНК при температуре 94±0,1 С в течение 1 мин., отжиг праймеров при 66±0,1 С в течение 1 мин и синтез комплементарной цепи при70±0,1С-1мин. Продукты ПЦР анализировали методом гельэлектрофореза в 1,2 %-ной агарозе в аппарате типа Пг-9, с блоком питания и набором штампов для подготовки геля. Электрофорез проводили в течение 30 минут. Окрашенную ДНК в геле просматривали под ультрафиолетовым излучением. Анализируемые фрагменты проявлялись в геле в виде светящихся полос. Результаты оценивали по наличию ДНК-фрагментов, полосы которых располагались на том же уровне в геле, что и полосы в положительном контроле с препаратом ДНК Y. enter-ocolitica. При наличии в пробах ДНК-матриц других микроорганизмов и отрицательном контроле специфичные полосы отсутствовали.
Полученные результаты документировали фотографированием гелей в проходящем ультрафиолете. На первом этапе была изучена чувствительность и специфичность использованной тест-системы. Для определения чувствительности суточную агаровую культуру Y.enterocolitica штамм №.66-82 0:3 серовара раститровывали в физрастворе и сыром молоке КРС в концентрациях от 1X10 до 1X10 м.т./мл. Опыты повторяли трёхкратно. Для определения специфичности тест - системы, молоко и физраствор искусственно контаминировали гетерогенными микроорганизмами, которые, часто обсеменяют молоко в естественных условиях: Salmonella enteritidis, E.coli, Enterococcus и представителями рода Yersinia: Y.pseudotuberculosis и Y.pestis с содержанием 1X105 м.т./мл. Опыт также повторяли трехкратно. На заключительном этапе работы были исследованы 30 индивидуальных проб молока КРС из хозяйства «Надежда» Петровского района Саратовской области, где ранее, в 2000 - 2001 г.г., нами уже неоднократно выделялась Y.enterocolitica. Все опыты по постановке ПЦР сопровождались бактериологическим контролем. В результате исследования 35 проб сборного молока с молокозаводов Энгельского, Новобурасского, Красноармейского и Петровского районов Саратовской области выделено 5 штаммов Y.enterocolitica из хозяйств «Россия», «Надежда», «Мирное»,«Таволжанка» и «Чапаево» Петровского района Саратовской области.
Основные свойства этих штаммов представлены таблицах 2-3. Таблица 2 Культурально — морфологические свойства Y.enterocolitica, выделенных из молокеа КРС хозяйств Петровского района Саратовской Эталон.штамм мелкие грамотрицательные палочки и коккобак-терии. мелкие и средние бесцветные колонии. мелкие исредниесеро-белыеполупрз-рачныеколонии. Помутнение, осадок, пристеночное кольцо. + + + + + + Обозначения: «+» - подвижность наблюдается, «-» - подвижность отсутствует. Как видно из таблицы 2, выделенные штаммы по культурально -морфологическим свойствам были типичны для Y.enterocolitica: мелкие грамотрицательные палочки, часто окрашивающиеся биполярно; на плотных питательных средах образуют мелкие и средней величины гладкие, выпуклые, блестящие, полупрозрачные колонии с более плотным центром и ровным краем; на жидких питательных средах образуют помутнение, пристеночное кольцо и осадок, поднимающийся при встряхивании в виде косички.
