Введение к работе
Актуальность проблемы
Одно из ключевых мест в клеточной биологии занимает изучение механизмов проведения клеточного сигнала. Особое внимание при этом уделяется факторам роста - полипептидам, регулирующим пролиферацию, дифференцировку, либо апоптоз разных типов клеток. Наиболее изученным на сегодняшний день является эпидермальный фактор роста (ЭФР). Связываясь на поверхности клеточной мембраны со специфическим рецептором, ЭФР вызывает в клетке ряд событий, приводящих в конечном счете к передаче внешнего сигнала на геном.
Классическая схема ЭФР-опосредованной передачи сигнала в клетке включает в себя ассоциацию ЭФР с рецептором ЭФР (ЭФР-Р), что вызывает димеризацию последнего и автофосфорилирование рецепторной тирозинкиназы, расположенной на С-концевом участке молекулы ЭФР-Р и экспонированной в цитоплазму. Активированная таким образом тирозинкиназа ЭФР-Р приобретает, в свою очередь, способность активировать, путем фосфорилирования, ряд внутриклеточных субстратов, осуществляющих дальнейшее проведение сигнала (Никольский и др., 1987). Наиболее изученными на сегодняшний день являются так называемые STAT и Ras пути проведения сигнала. В первом случае активная тирозинкиназа ЭФР-Р вызывает фосфорилирование STAT белков, что влечет за собой образование транскрипционноактивных гомодимеров которые, в свою очередь, транспортируются в ядро, где вызывают активацию генов раннего ответа (Darne!!, 1997). Центральным событием Ras-пути передачи сигнала язляется активация малой ГТФазы Ras. Далее сигнал с активированного Ras передается на каскад серин-треониновых протеинхиназ. Первой в этом ряду оказывается с-Raf киназа, которая передает сигнал на МЕК киназы, а те, в свою очередь, активируют серин-треониновые киназы ERK семейства. Последние
транспортируются в ядро, где фосфорилируют такие ядерные мишени, как Elk-1, Elf-1, а также Sapla (Marshall, 1994).
Необходимо отметить, что одновременно с активацией сигнальных путей, мембранный ЭФР-Р кластеризуется в окаймленных ямках и интернализуется в эндосомы (Pastan, Willingham, 1981). В дальнейшем ЭФР-рецепторные комплексы могут рециклировать на плазматическую мембрану, либо транспортироваться в состазе зндосом в область пара-Гольджи, где затем деградируют в лизосомах (Beguinotet al., 1984, Sorkin et at., 1988). Первоначально считалось, что интернализация активированного рецептора ЭФР является механизмом, обеспечивающим снижение уровня сигнала, однако в последнее время появились работы, свидетельствующие об участии интернализованных рецепторов в активации таких сигнальных молекул, как фосфоинозитол-3-киназы и ERK1.2 (Vieira et al., 1996, Xue, lucocq, 1998). Таким образом, хотя и на единичных примерах, было продемонстрировано участие интернализованного рецептора в проведении сигнала. Хорошо установленным фактором является то, что рецептор-опосредованный эндоцитоз зависит от системы микротрубочек. В связи с этим, особый интерес приобретает проблема участия цитоскелета в процессе передачи сигнала в клетке. С другой стороны, в последние годы активно изучается феномен перестройки цитоскелета под действием факторов роста. Показана ассоциация многих сигнальных белков с элементами цитоскелета и активная роль цитоскелета в проведении клеточного сигнала (Ding et al., 1996, Keenan and Kelleher, 1998). Тем не менее, роль интернализованного рецептора факторов роста и роль цитоскелета, вносящих существенные изменения в классическую картину передачи сигнала под действием ростовых факторов, остается далекой от полного понимания. Парадоксально, но до настоящего недостаточно внимания уделяется изучению механизмов передачи сигнала, запускаемых рецепторами факторов роста выходящих за рамки STAT и Ras-путей передачи сигнала. Так, крайне мало известно о механизме регуляции активности такого ключевого фермента как фосфолипаза С..
Фосфолипаза Су1 (ФЛСуІ) - субстрат рецепторов факторов роста -является одним из ключевых участников передачи сигнала в клетках. Активированная ФЛСу1 осуществляет гидролиз фосфоинозитид(4,5)-бифосфата с образованием вторичных мессенджеров - фосфоинозитид(1,4,5)-трифосфата и диацилглицерина, которые, в свою очередь, вызывают выход ионов Са2+ из внутриклеточных депо и активируют протеинкиназу С (Berridge, 1993). Известно, что ФЛСу1 активируется при действии на клетку факторов роста, и в частности, ЭФР (Cockroft , Thomas, 1992.). Однако механизм этой активации до сих пор остается неясным. Так .например показано, что в отсутствие стимуляции ростовыми факторами, клетки содержат пул активной ФЛСу1, вполне достаточный для гидролиза значительного количества фосфоинозитид(4,5)-6ифосфата и запуска дальнейших каскадов передачи сигнала (Rhee, 1991). Таким образом можно предположить существование дополнительных механизмов, участвующих в регуляции активности данного фермента.
Крайне мало на сегодняшний день известно о механизмах передачи сигнала при помощи факторов роста на транскрипционные факторы семейства Sp1. Данные транскрипционные факторы имея в составе молекулы ДНК-связывающий цинковый мотив обладают способностью активировать широкий спектр генов содержащих GC-богатые промоторы (Kadonaga et al., 1987). На настоящий момент охарактеризовано несколько протеинкиназ модулирующих активность данного семейства транскрипционных факторов, а также показана
рОЛЬ Б ЭТОМ Процессе w-ГЛиКОЗИЛИрОБЗп'ИЯ ^іЗГі., r\liuiOVV , icj/). і зк например,
описано участие в активации Sp1 для протеинкиназы С (РКС), а так же ДНК-зависимой протеинкиназы (Pal et al., 1998, Chun et al., 1998). He так давно была продемонстрирована активация транскрипционного фактора Sp1 под действием ЭФР, однако вопрос о механизмах проведения сигнала с рецептора ЭФР на Sp1 до настоящего времени остается открытым (Ford et al., 1997). Таким образом, необходимо признать, что несмотря на значительные успехи в данной области, сложившаяся картина передачи митогенного сигнала с
рецепторов ростовых факторов на клеточный геном далека от завершения и имеет в своем составе ряд белых пятен.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось, изучение возможных механизмов, регулирующих проведение клеточного сигнала под действием ЭФР на примере ФЛСу1 и транскрипционного фактора Sp1.
В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:
-
Определить с какими элементами цитоскелета взаимодействует ФЛСу1 в клетках А-431.
-
Выяснить возможность активации ФЛСу1 интернализованным рецептором ЭФР.
-
Изучить механизмы активации транскрипционного фактора Sp1 при действии ЭФР.
-
Охарактеризовать протеинкиназу, участвующую в активации транскрипционного фактора Sp1.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Фосфолипаза Су1 под действием ЭФР ассоциируется с интернализованным рецептором ЭФР в составе эндосом и перераспределяется вместе с ним в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза.
-
ФЛСуі ко-локализуется с цитокератиновыми промежуточными филаментами.
-
ЭФР-зависимая активация транскрипционного фактора Sp1 осуществляется при участии новой серин/треониновой протеинкиназы.
Научная новизна работы
Изучена внутриклеточная локализация и перераспределение под действием ЭФР фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 в клетках А-
431. Впервые показана ассоциация ФЛСуІ с промежуточными филаментами цитокератиновой природы.
Продемонстрирована возможность активации ФЛСу1, а также других цитоплазматических сигнальных молекул при помощи интернализованного ЭФР-Р.
Изучена динамика активации транскрипционного фактора Sp1 под действием ЭФР. Показано, что проведение митогенного сигнала, запускаемого рецептором ЭФР, и приводящее к активации Sp1 осуществляется с участием Ras- пути передачи сигнала.
Выявлена новая серин-треониновая киназа осуществляющая активацию транскрипционного фактора Sp1. Показано, что ERK и ERK-родственные киназы не участвуют в фосфорилировании Sp1. Осуществлена частичная очистка "Sp1 киназы" и охарактеризованы ее свойства.
Теоретическое и практическое значение работы
Полученные данные о возможности запуска каскадов передачи сигнала в клетке не только с участием мембранного, но и интернализованного рецептора ЭФР существенно расширяют и дополняют общую картину передачи сигнала, регулирующего клеточную пролиферацию.
Полученные данные об ассоциации ФЛСу1 не только с актиновыми микрофиламентами, но и цитокератиновыми промежуточными филаментами расширяют традиционные представления о функции цитоскелета, и в особенности о роли промежуточных филзментоэ, которым, до сих пор, предписывалась лишь опорная функция в клетке.
Данные, полученные в ходе изучения механизмов активации транскрипционного фактора Sp1 важны для понимания механизмов, регулирующих клеточную пролиферацию в ответ на действие ЭФР.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Материалы диссертации были изложены на Международном конгрессе по молекулярной и клеточной биологии (Брайтон, Великобритания, 1997), Ежегодном конгрессе Американской Гастроинтерологической Ассоциации (Орландо, США, 1999), на 18-ом ежегодном симпозиуме по клеточной и молекулярной биологии (Анн Арбор, США, 1998), на научных семинарах медицинского института Ховард Хьюз (Анн Арбор, США, 1998), на семинарах лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН, а также научных семинарах университета Мичигана (Анн Арбор США,).
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 15" Z публикации и списка публикаций по теме диссертации. Работа изложена на ili страницах машинописного текста и иллюстрирована 2 ^ рисунками.
