Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Антимикробные пептиды бактерий, основные свойства и классификация 14
1.2. Бактерии рода Bacillus - продуценты пептидов широкого спектра антимикробного действия 20
1.3. Методология получения бактериоцинов и бактериоцино-подобных соединений (БПС) 24
1.4. Примеры использования бактериоцинов и БПС 27
1.5. Заключение по обзору литературы 35
Собственные исследования и их обсуждение 37
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Используемые штаммы бактерий 37
2.2. Питательные среды и условия культивирования. 38
2.3. Накопление биомассы и концентрирование продукта 39
2.4. Микробиологические методы 40
2.5. Биохимические методы 41
2.6. Экспериментальные животные 43
2.7. Методика приготовления и нанесения антимикробных полимерных покрытий 44
2.8. Методы статистической обработки результатов 45
Результаты и обсуждение 46
ГЛАВА 3. Штаммы в. circulans и шодукция антимикробной субстанции 46
3.1. Описание штаммов-продуцентов антимикробных субстанций 46
3.2. Определение факторов, влияющих на синтез бактерицидных веществ, режимы культивирования
3.2.1. Продукция бактериоциноподобных веществ в зависимости от источника азота 49
3.2.2. Продукция бактериоциноподобных веществ в зависимости от источника углерода 51
ГЛАВА 4. Разработка способа получения бактерицина В. Circulans 55
4.1. Питательная среда 56
4.2. Глубинное культивирование штамма-продуцента 57
4.3. Разделение культуральной жидкости 59
4.4. Сравнение и выбор способа выделения БПС
4.4.1. Метод высаливания неорганическими солями 63
4.4.2. Адсорбция-десорбция на твердом носителе 64
4.4.3. Фазовая сепарация органическим растворителем
4.5. Приготовление экспериментальных образцов БПС 69
4.6. Очистка и идентификация компонентов препарата 72
ГЛАВА 5. Биологические и физико-химические свойства бактериоцина В. Circulans 74
5.1. Спектр антимикробного (деконтаминирующего) действия. 74
5.2. Физико-химические свойства: термоустойчивость, рН зависимость, устойчивость к протеолизу, молекулярный вес 78
5.3. Оценка безвредности бактериоцина 82
ГЛАВА 6. Примеры и рекомендации по практическому применению БПС 83
6.1. Лечебная эффективность на бройлерной птице 84
6.2. Обеззараживание лабильных биоматериалов. 85
6.3. Снижение контаминации вареных мясных колбас 87
Заключение 91
Выводы 93
Список использованной литературы 95
Список опубликованных работ по теме диссертации
Благодарности
- Методология получения бактериоцинов и бактериоцино-подобных соединений (БПС)
- Накопление биомассы и концентрирование продукта
- Определение факторов, влияющих на синтез бактерицидных веществ, режимы культивирования
- Сравнение и выбор способа выделения БПС
Введение к работе
Актуальность работы
За последние десятилетия в клиниках мира было выделено множество антибио-тико-резистентных микроорганизмов, которые создают проблемы в лечении ряда заболеваний инфекционной этиологии. Так, в 2011 году в Германии банальная кишечная инфекция, вызванная устойчивым к антибиотикам геморрагическим штаммом Е. coli 0104:Н4, унесла жизни более 50 человек, а несколько сотен человек остались инвалидами. В этой связи поиск новых средств антибактериального действия с меньшим, чем у антибиотиков, уровнем развития к ним микробной устойчивости, имеет как научное, так и практическое значение. В качестве таких средств биологического происхождения больший интерес представляют бактериоцины грамположительных бактерий, которые по своей природе являются низкомолекулярными пептидами и, по мнению большинства исследователей, не токсичны; и микроорганизмы к ним, как правило, не привыкают. Известны примеры практического использования наиболее известных бактериоцинов лактобактерий - низина и педиоцина - в качестве биоконсервантов пищевых продуктов и кормов. Вместе с тем, к бактериоцинам лактобактерий чувствительны только филогенетически родственные виды микроорганизмов, и только в отдельных случаях - грамотрицательные бактерии. Поэтому выделение новых бактериоцинов, способных более эффективно ингибировать развитие возбудителей острых кишечных инфекций, а также микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов, является актуальной задачей современной науки и ее прикладных направлений.
Перспективными источниками антимикробных соединений пептидной природы считаются некоторые виды аэробных спорообразующих бацилл. Представители этих видов являются продуцентами полимиксиновой группы антибиотиков - бацитрацина, бути-розина, грамицидина С, полимиксина и др. Названные антибиотики востребованы до настоящего времени благодаря своей высокой эффективности против грамотрицательных бактерий, однако их применение ограничено в связи с различными побочными эффектами на организм человека. А не так давно было обнаружено, что некоторые штаммы Paeniba-cillus polymyxa и Bacillus circulans способны продуцировать бактериоцины и бактериоци-ноподобные соединения (БПС) пептидной природы, обладающие антимикробным действием [Puiri et al, 1998; Svetoch, Stern et al, 2005; Stern, Svetoch et al, 2006; He et al, 2007]. По своему строению и спектру антимикробного действия эти соединения, как показано [Abriouel et al, 2011], близки к бактериоцинам классов I и Па лактобактерий по принятой классификации [Klaenhammer, 1998], но дополнительно действуют и на грамотрицательные микроорганизмы.
Наибольший интерес представляет вид В. circulans, поскольку в 2001 году у штамма NRRL В-30644 (депонирован в музее ARS USA) впервые был выявлен антимикробный пептид (бактериоцин 1580), который ингибировал сальмонеллы и кампилобактерии. Представители этого вида практически безвредны, широко используются в биоиндустрии в качестве продуцентов ферментов, сурфактантов, полисахаридов, препаратов для мацерации кормов, бактериальных удобрений. Было высказано предположение о том, что они могут оказаться источниками новых бактериоцинов. Нами были выделены из окружающей среды и депонированы в коллекции микроорганизмов «ГКПМ - Оболенск» новые
бактериоциногенные штаммы В. circulans с широким спектром антимикробного действия. Потребность медицины, ветеринарии и пищевой промышленности в новых более эффективных средствах сдерживания вредных микроорганизмов явилась основанием для более глубокого изучения антимикробных веществ, продуцируемых штаммами В. circulans и для разработки лабораторной технологии их получения.
Цель исследования
Выбрать наиболее антагонистически активные и продуктивные штаммы Bacillus circulans, разработать лабораторную технологию получения бактериоциноподобных соединений, изучить их биологические и физико-химические свойства, определить возможные сферы применения.
Основные задачи исследования
Найти и выбрать по результатам сравнительных исследований антагонистически активные штаммы В. circulans с практически значимыми выходами по действующему началу бактериоциноподобных соединений.
Определить компонентный состав питательных сред и параметры культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивающих существенный выход бактериоциноподобных соединений.
Найти и отработать способ эффективного извлечения бактериоциноподобных соединений из культуральной жидкости продуцентов, способ сравнительной оценки антимикробной активности.
Получить на основе отобранного штамма В. circulans и разработанного способа выделения экспериментальные образцы бактериоциноподобного соединения для изучения его основных свойств.
Определить с использованием представительного набора индикаторных штаммов различных видов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов качественные и количественные показатели антимикробной активности экспериментальных образцов бактериоциноподобного соединения штамма В. circulans СК 2ч.
Изучить с использованием методов электрофореза и жидкостной хроматографии физико-химические и биохимические свойства экспериментальных образцов бактериоциноподобных соединений В. circulans.
Исследовать in vivo антимикробное действие экспериментальных образцов бактериоциноподобных соединений в опытах на цыплятах и оценить степень безвредности для белых мышей.
Разработать экспериментальные образцы, содержащие бактериоциноподоб-ные соединения, и определить возможные области их практического применения.
Научная новизна работы
Выделены, идентифицированы и охарактеризованы новые антагонистически активные бактериоциногенные штаммы В. circulans, подавляющие рост различных видов грамположительных и грамотрицательных патогенных и условно патогенных бактерий, в том числе - штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.
Выявлена зависимость синтеза бактериоциноподобного соединения (БПС) от природы источника азота, энергетической ценности питательной среды и параметров глубинного культивирования продуцента.
Установлено, что временные параметры синтеза БПС В. circulans, спектр антимикробного действия, а также его молекулярная масса отличаются от других антимикробных соединений, продуцируемых данным микроорганизмом.
Обнаружено, что некоторые штаммы В. circulans продуцируют два бактериоциноподобных соединения разных типов: (1) выделяющееся в культуральную жидкость и ин-гибирующее грамотрицательные микроорганизмы; и (2) накапливающееся на поверхности клеток и активное в большей степени против грамположительных бактерий.
Теоретическая ценность и практическая значимость работы
Создана коллекция антагонистически активных штаммов В. circulans, пригодных для использования в качестве источника новых бактериоцинов и бактериоциноподобных соединений.
Установлена зависимость синтеза бактерицидного вещества В. circulans от энергетической ценности и доступности компонентов питательной среды, что может быть вкладом в теорию и практику управляемого синтеза бактериоцинов на основе перспективных видов сапрофитных бактерий.
Разработан способ глубинного культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивающий малозатратное выделение БПС из культуральной жидкости В. circulans, который может быть использован для обнаружения и получения в препаративных количествах новых биологически активных веществ антимикробного действия, в том числе и бактериоцинов, синтезируемых другими видами микроорганизмов.
Получен экспериментальный образец БПС, изучены его свойства, определен спектр областей возможного использования.
Разработаны «Методические рекомендации по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов» - учрежденческий уровень внедрения.
Разработан лабораторный регламент получения бактериоцина с обеззараживающими свойствами [ЛР 78095326-100-2011] - федеральный уровень внедрения. Основные положения, выносимые на защиту
Новые штаммы В. circulans, которые являются продуцентами бактериоциноподобных веществ, подавляют рост и развитие широкого спектра бактериальных патогенов.
Выход и активность бактериоциноподобного соединения В. circulans зависят от природы источника азота, вида и концентрации углерода в питательной среде, а также параметров глубинного культивирования.
Бактериоциноподобное соединение штамма В. circulans Ск2ч представляет собой термостабильное, рН устойчивое, протеин-содержащее соединение с молекулярной массой около 6 кДа, ингибирующее рост ряда грамотрицательных и грамположительных патогенов бактериальной природы.
4. Бактерициноподобное соединение штамма В. circulans Ск2ч может быть ис-
пользовано в качестве добавки в корм цыплят - для контроля числа бактериальных патогенов в кишечнике, а также в составе полимерных пленок - для хранения продуктов, обеспечивающего снижение микробной контаминации.
Работа выполнена в отделе биологических технологий ФБУН ГНЦ ПМБ Роспот-ребнадзора в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации 2009 - 2013 годы» (Государственные контракты № 122-Д от 11.06.2009 г. и № 55-Д от 22.07.2011 г.).
Личный вклад соискателя
Автором лично выполнена вся экспериментальная работа по выбору штамма-продуцента, выделению и очистке БПС, изучению свойств экспериментального образца, а также интерпретация полученных данных. Автор внес значительный вклад в составление «Методических рекомендаций по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов», а также в разработку Лабораторного регламента на получение бактериоцина с обеззараживающими свойствами.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на: 1-ой Оболенской школе-конференции «Биологическая безопасность в современном мире» [Оболенск, 2009], II научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Биобезопасность в современном мире» [Оболенск, 2010], III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» [Оболенск, 2011].
Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 публикациях, в том числе в 3 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Методология получения бактериоцинов и бактериоцино-подобных соединений (БПС)
Не так давно группа исследователей под руководством доктора Неса обосновала необходимость пересмотра существующей схемы классификации бактериоцинов [82]. Было предложено переименовать класс III бактериоци-нов, так как сюда были включены протеины с ферментативной активностью, вызывающей деградацию клеточной стенки. Эта группа антимикробных соединений, по их мнению, в дальнейшем должна упоминаться как бактериолизины. В класс IV следует включать циклические бактериоцины, так как у этих пептидов ковалентно связаны «голова» и «хвост» (N- и С- концы). Теперь в класс IV включен АС-48 - один из наиболее изученных циклических бактериоцинов с активностью не только против различных грамположитель-ных, но и некоторых грамотрицательных бактерий [51].
Считается, что система классификации бактериоцинов бацилл должна отличаться от классификации бактериоцинов лактобактерий, даже при наличии у них весьма сходных особенностей. В недавно предложенной классификации бактериоцинов бацилл [25] имеются некоторые общие черты с усовершенствованной классификацией бактериоцинов для лактобактерий [82]. Согласно этой классификации класс I - это посттрансляционно модифицированные пептиды (соответствует классу I бактериоцинов), который делится на подкласс 1.1 — отдельные пептиды, элонгированные лантибиотиками (субти-лин, эрицин S, эрицин А), субкласс 1.2. другие отдельные пептидные ланти-биотики (субланцин 168, мерсацидин, пиенобациллин), 1.3. двупептидные лантибиотики (галодурацин, лихеницидин), субкласс I .4. другие посттрансляционно модифицированные пептиды (субтилозин А). Класс II немодифи-цированные пептиды (соответствует классу II по Несу, 2007), который делится на субкласс II. 1. - педиоцинподобные пептиды (коагулин и бактериоцины SRCAM 37, SRCAM 602, SRCAM 1580), подкласс П.2. турицинподобные пептиды (турицин Н и др.), а также подкласс П.З. другие линейные пептиды (цереин 7а, цереин 7в, лихенин, турицин 439). И, наконец, класс III включает большие протеины (это соответствует классу III - ( 30 кДа), теплолабильные бактериоцины) с фосфолипазной активностью, такие как мегацин А-216 и А-19213, продуцируемые штаммами Bacillus megaterium.
Многие среднеразмерные полипептиды (10 - 30 кДа) и ряд других антимикробных пептидов бацилл еще большего размера из-за отсутствия данных по сиквенированию генов и протеинов еще не включены в эту классификационную схему [3]. Тем не менее, они описываются в соответствующей литературе как категория BLIS, введенная в обиход доктором Тагом.
Несмотря на то, что к сегодняшнему дню известны сотни полностью охарактеризованных бактериоцинов, но только один из них - низин реально востребован в практике и производится для продажи. Этот бактериоцин класса I известен еще с 1927 года: его молекула содержит 34 аминокислотных остатка, среди которых присутствуют редкие аминокислоты - лантио-нин, метиллантионин, дегидроаланин и дегидробутирин. Изначально он был использован в производстве сыров, так как обладал сильным ингибирующим действием в отношении листерий и клостридий, микроорганизмов, часто вызывающих порчу продовольствия.
Отнесение низина к категории GRAS и имеющееся разрешение практического использования в качестве безвредного биопрезерванта послужило стимулом для роста числа исследований в направлении поиска других сфер его применения. Достаточно быстро были обнаружены и слабые стороны низина. Прежде всего стало известно, что спектр его действия ограничивается только грамположительными бактериями и что низин проявляет максимум активности лишь в зоне кислых рН, тогда как в области физиологических значений рН имеет лишь небольшую активность. Для низина характерно проявление гемолитичности, что делает проблематичным его использование в медицинских целях. Отмечается, что парентеральное предъявление низина может дать серьезный местный эффект в виде лизиса эритроцитов и разрушения лизосом, особенно если давать его в высоких концентрациях. Предполагается, что даже если парентеральное лечение не вызывает выраженного местного эффекта, то может иметь место образование антител, которые ста новятся причиной развития аллергических реакций в случае повторного парентерального применения. Поэтому основной причиной против системного применения низина в медицине является и то, что большинство жидкостей организма имеют нейтральный показатель рН (для сыворотки 7,4), при котором низин не стабилен [79].
Повысить эффективность низина в отношении грамотрицательных патогенов пытаются путем комбинирования его с антибиотиком рамопланин (ramoplanin), модулирующим синтез пептидогликана у метициллин-резистентных Staphylococcus aureus и ванкомицин-резистентных энтерококков [31; 38]. Известны попытки химической модификации низина для повышения его устойчивости к протеолитическим ферментам, сдвига активности в сторону нейтральных рН, а также придания ему с помощью химических добавок (детергентов, солей, физической обработки) способности работать против патогенов грамотрицательной природы [93; 101].
Представленные примеры свидетельствуют, с одной стороны, о перспективности использования низина для элиминации бактерий с поверхностей лабильных биоматериалов, в качестве биоконсерванта продовольствия и кормов, с другой - имеются достаточно много типовых особенностей, ограничивающих сферу его применения. Возможно, такого рода ограничения могут быть характерными и в отношении других бактериоцинов класса I - II по Кляенхаммеру, которые, как отмечалось, эффективны лишь в отношении грамположительных бактерий. Отсюда понятно внимание исследователей к другим видам бактериальных продуцентов, которые могли бы производить более эффективные антимикробные соединения. Например, недавно сообщалось [44], что бактериоцины, обнаруженые у молочнокислых бактерий Lactococcus lactis 53 и Streptococcus thermophilus А, а также у некоторых представителей рода Bacillus, являясь протеинами, дополнительно содержат липидный компонент (липопептид), что придает им свойства сурфактантов [44].
Накопление биомассы и концентрирование продукта
Исследуемые штаммы высевали на чашки с питательным (Nutrient Agar М001, HiMedia, Индия), ГРМ-агаром (ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия), либо крахмальным агаром (Starch agar, Ref. 1-283, Scharlau, EC) и культивировали при 29-30 С в течение двух суток. Для получения посевных материалов одиночные типовые колонии выбранных штаммов суспендировали в пробирках с изотоническим раствором хлористого натрия — (рН 7,0-7,2). Клеточными суспензиями в количестве не менее 1 % засевали качалочные (750 мл) колбы со 100 мл питательной среды. Инкубацию посевов осуществляли на качалке (28-30С, 130-150 об/мин).
Выбор среды культивирования осуществляли на основе питательной среды следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; калия фосфат 2-зам. 3-вод. - 3,0; натрия хлорид - 1,0; калия хлорид - 1,0 и магния сульфат -0,005.
На первом этапе исследований к основе питательной среды добавляли по отдельности (по 0,3-0,5 %) различные источники аминного азота - виннокислый аммоний, сульфат аммония, хлористый и щавелевокислый аммоний, а также гидролизаты казеина (солянокислый - СГК), рыбной муки (панкреатический - ПГРМ) и глутамат натрия (рН сред составляла 7,3-7,5 ед.). Во все варианты сред добавляли 0,5 % глюкозы. Контролем был коммерческий ГРМ-бульон (ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия).
На втором этапе исследований к питательной основе с выбранным по результатам первого этапа источником азота дополнительно вводили кроме глюкозы и другие источники углерода - различные моно-, ди-, три-, олиго- и полисахариды.
Питательную среду для ферментера автоклавировали при 1 атм в течение 60 мин. Растворы дрожжевого экстракта, глюкозы и магния сульфата автоклавировали отдельно от основного объема питательной среды при 0,5 атм в течении 40 мин. Объем добавленного посевного материала составлял 10 %. Глубинное культивирование в ферментере проводили при 29-30 С в течение 48 ч. Скорость аэрации меняли от 1,0 до 2,0 л/мин в зависимость от потребности культуры продуцента.
Культивирование штаммов-продуцентов проводили в термостатах ТС-80 М (Россия), качалках NBS (New Brunswick Scientific, США) и Certomat BS-1 (США), ферментерах АКА-210 (Россия), Bioflo 110 NBS (США). Для разде ления компонентов КЖ использовали центрифугу J2-21 Beckmann (Германия), микро- и ультрафильтрационные установки на полых волокнах (Россия). Концентрирование целевых продуктов проводили на вакуум-выпарной установке Laborota 4000 Heidolph (Германия), при температуре 60 С и вакууме (0,1 ати). Для обезвоживания биоматериалов применяли лиофилизатор Virtis BT-4k (США). Для стерилизации питательных сред, растворов и других жидкостей использовали установку стерилизующей фильтрации АСФ-011 (Россия) и автоклав ВК-75 (Россия). Из контрольно-измерительных приборов, не являющихся частью оборудования, в технологии использованы рН-метры, весы, термометры (Россия), анализатор влажности MF-50 (Moisture Analyzer, Japan) и центрифуга MiniSpin (Eppendorf AG 22232, Германия).
Идентификация изолятов. После первичной оценки морфо-культуральных признаков, давшим основание считать выделенные изоляты представителям рода Bacillus, дальнейшую их видовую принадлежность определяли с помощью стандартизованной системы биохимических тестов API 50 СНВ фирмы BioMerieux (Франция) и программного обеспечения API по версии 4.0. В случае спорной идентификации для уточнения вида бацилл привлекали дополнительные тесты, описанные в литературе [75; 81].
Проверка на антагонистическую активность. Первичный скрининг антагонистически активных изолятов бацилл проводили методом нанесения образцов клеточной массы в виде агаровых блоков или пятен (spotest) на поверхность свежезасеянного индикаторными штаммами питательного агара. Оценку величины антимикробной активности выделенных образцов бактерицидных веществ в основном проводили путем нанесения разведений (по 10 мкл) на свежие газоны тест-культур, которую выражали в арбитражных единицах (АЕ/мл). Для получения более точной характеристики КЖ по уровню антагонистической активности супернатанты концентрировали упариванием при температуре 105 С, а преципитаты разводили в воде в 10 раз.
Определение молекулярной массы антимикробного соединения на элек-трофореграммах проводили непосредственно на ПААГ. После окраски и отмывки образцы геля помещали в стерильные чашки Петри и заливали агаровой суспензией тест-штамма микроорганизма, имеющей температуру не выше 45 С. После инкубации чашек в термостате при температуре 37 С в течение 18-20 часов, регистрировали расположение зоны подавления роста тест-культуры и определяли ее соответствие молекулярным массам коммерческих маркеров.
Определение МПК. Определение минимальной подавляющей концентрации в отношении тест-культур проводили методом серийных разведений препарата (от 128 до 0,06 мкг/мл) в жидких питательных средах (по 1 мл), соответствующим их ростовым потребностям. Результаты учитывали после инкубации планшет при 37 С в течение 24 часов, отмечая изменение оптической плотности сред по отношению к контрольной пробе без препарата.
Определение факторов, влияющих на синтез бактерицидных веществ, режимы культивирования
В процессе выполнения исследований было замечено, что успех в получении антагонистически активных КЖ штаммов В. circulans зависел не только от состава питательных сред, условий культивирования, но и качества подготовки штаммов-продуцентов. Невнимательность при пассировании штаммов часто является причиной попадания в посевы весьма схожих по внешнему виду колоний близкородственных бацилл (B.subtilis, B.cereus, B.macerans и др.), которые не находятся в антагонистических взаимоотношениях. При культивировании в жидких средах с целью получения посевных материалов для засева ферментеров посторонние бациллы могут часто опережать рост штаммов В. circulans, что приводит к браку в работе.
По этой причине перед использованием штамм В. circulans Ск2ч (выбран как наиболее активный) для наработки экспериментальных образцов препаратов БПС каждый раз проверяли на соответствие паспортным данным и, прежде всего, на способность клеточной массы, взятой из типовых колоний, подавлять рост Гр(-). Из этих антагонистически активных колоний готовили посевной материал путем засева качал очных колб со 100 мл питательной среды (табл. 7). Далее суточную бульонную культуру продуцента также проверяли на антимикробную активность и только после этого использования для инокуляции ферментера. В период паузы, отводимой на тестирование антимикробной активности (3-4 ч), отобранную пробу КЖ (обычно 1,0-1,5 мл) после освобождения от клеток при помощи центрифугирования, концентрирования высушиванием и регидратации (100 мкл), а также соответствующей подготовки, подвергали трицин-ДСН-ПААГ электрофорезу (см. раздел 2.5) с целью выявления белковой полосы с молекулярной массой 6-7 кДа.
Выращивание культуры штамма В.circulans СК2ч в ферментере с рабочим объемом 7 л проводили с использованием питательной среды, указанной в разделе 4.1 (табл. 7). Уровень продукции БПС проверяли через каждые 3-4 ч роста путем нанесения отобранной пробы КЖ (по 10-20 мкл) на поверхность газона свежезасеянного тестовой культурой E.coli М17. Антимикробная активность в КЖ появляется, как правило, после 16 ч роста, и возрастает во времени, что заметно по увеличению диаметра зоны ингибирования индикаторной культуры. После стабилизации антимикробной активности культивирование продуцента прекращают.
Последующее выделение грубого экстракта БПС проводили с использованием двух этапов ультрафильтрации. Фильтрацию первого этапа осуществляли через полое волокно с отсечением 100 кДа с получением на выходе фильтрата (пермеата) №1 и концентрата клеточной массы, где вместе с клетками присутствуют крупные молекулярные комплексы, включая и бактериоцины. На втором этапе фильтрат №1 пропускают через картридж с полыми волокнами с отсечение в 5 кДа. На выходе получают неактивный фильтрата №2 (не используется) и концентрат первого пермеата с удержанным бактериоцином. Клетки из концентрата после первой фильтрации удаляют центрифугированием, а содержащий молекулы бактериоцина супернатант объединяют с концентратом после второго этапа фильтрации.
Таким образом уменьшенный в десятки раз объем концентрата, содержащий молекулы БПС, позволяет существенно сократить количество реагентов, необходимых для последующей его очистки.
Для осуществления жидкофазной сепарации бактериоцина полученный концентрат вносят в керамическую или металлическую (из нержавеющей стали) емкость. Туда же при перемешивании наливают безводный органический растворитель дихлорметан (он же - хлористый метилен) в соотношении 1:1 (объем/объем). Емкость со смесью для получения устойчивой эмульсии помещают в смеситель TYP-LE-402 (Венгрия), где подвергают интенсиному перемешиванию в течение 10—15 мин. Образуется эмульсия светло-кремового цвета. Для ускоренного получения концентрованной эмульсии обратного типа (вода в масле), эмульсию переливали в стальные или стеклянные стаканы и центрифугировали в течение 15 мин. В стаканах после центифугирования четко наблюдались три фазы: верхняя — водная фаза, средняя - интерфаза и нижняя фаза - ДХМ. Концентрированую эмульсию в виде толстой интерфазной пленки извлекали в отдельную приемную емкость из стекла. Для разрушения эмульсии и выделения водной фракции, которая содержит БПС, ее переносят в круглодонную колбу и устанавливали в вакуумном роторном испарителе (Laborota, Германия). Температура упаривания (50-60 С) позволяла удалить ДХМ, который конденсируется в приемной емкости испарителя и может использоваться повторно. Полученную, концентрированную, жидкость, содержащую. БПС и примесные соединения, обладающие аффиностью к ДХМ, высушивали до постоянного веса в сухожаровом шкафу при температуре 80 С. Полученный сухой материал собирали, измельчали и далее использовали как сухой препаративный образец БПС.
Испытания препарата БПС штамма Ск2ч на основных тестовых объектах L.monocytogenes и Escherichia coli проводили следующим образом. 50 мг препарата растворяли в 1 мл дистиллированной воды, далее полученную суспензию разводили в серии двукратных разведений. Каждое из полученных разведений наносили по 10 мкл на поверхность свежезасеянных газонов тестовых культур Гр(-) и Гр (+) бактерий. За единицу активности принимали разведение, которое дает минимальную, но четко фиксируемую зону ингибирования. Полученное значение антагонистической активности выражали в арбитражных единицах на объем пробы (АЕ/мл), затем пересчитывали на количество сухого препарата в исходной пробе и выражали как АЕ/мг.
Сравнение и выбор способа выделения БПС
Нами была исследована антимикробная активность жидких образцов БПС в опытах с нативной кожей тушки коммерческого бройлера. Алгоритм обработки кожи бройлера заимствован из работы [50], в которой проводилась оценка деконтаминирующих свойств препарата Safe 0 Poultry Wash, предназначенного для использования в коммерческом производстве бройлерной птицы.
Образцы кожи были взяты от коммерческих бройлеров, хранившихся на холоду после забоя в течение 3-х суток. Кожу с помощью стального про-бойника нарезали на кружки площадью по 4,5 см" каждый и инфицировали смесью сальмонелл и кишечных палочек, взятых в концентрации 0,25 х 109КОЕ/мл каждого вида (разведения - по стандарту ГИСК Л.И. Тара-севича), и нанесенной в количестве 100 мкл на образец кожи. После инкубирования в течение 30 минут при комнатной температуре поверхность образцов кожи орошали жидкими препаратами БПС штаммом В.circulans Ск2ч, взятыми в количестве 100 мкл. Обработанные образцы после 1 мин экспозиции были поставлены вертикально для стекания капель в течение 3 мин, и затем они были перенесены в холодильник 3-5 С на 45 минут для предотвращения возможного роста бактерий. После завершения этого времени образцы энергично промывали стерильной дистиллированной водой в объеме 3 мл на каждый образец. Собранные промывные воды подвергали общепринятому микробиологическому исследованию на общее содержание аэробов. В табл. 16 представлены результаты влияния орошения препаратом БПС Ск2ч, на уровень микробной обсемененности в стадии финальной промывки кожи бройлера, инфицированной сальмонеллами и листериями.
После орошения кожи препаратом БПС Ск2ч общее содержание аэробов снизилось со 100 до 51,9 %. Это подтверждают данные наших исследований о высокой активности БПС штамма В. circulans Ск2ч в отношении кишечных патогенов Гр(-) природы, например, эшерихий и сальмонелл. 6.3. Снижение контаминации вареных мясных колбас
Одной из проблем, связанных с порчей мясных продуктов является ос-лизнение, которое вызывается ростом психро-, мезо- и термофильных микроорганизмов [106]. Применяемые для борьбы с этим явлением химические реагенты (органические кислоты, соли, антиоксиданты и др.) равно как и антибиотики не в полной мере отвечают условиям, предъявляемым к качеству продуктов питания. [14; 63]. Нами предпринята попытка использовать супер-натанты, содержащие БПС, для борьбы с ослизнением реального коммерческого продукта (вареные сосиски) до и после включения их в состав защитной полимерной пленки.
Культивирование штаммов бацилл в разработанной нами питательной среде при температуре 29-30 С обеспечивало накопление в культуральной жидкости бактерицидного вещества (БЦВ) на уровне 100-200 АЕ/мл (рис. 10, А). Такой выход позволял непосредственно использовать бесклеточный су-пернатант для приготовления опытных образцов пленкоформирующего покрытия (рисунок 10, Б). Увеличеный диаметр зон ингибирования роста тест-штамма в растворе полимера по сравнению с исходным БЦВ объясняется объемами нанесенных проб: из-за вязкости полимера их брали в объеме 50 мкл (рисунок 10, Б). Сам же раствор полимера никакой активности в отношении тестового штамма Е. coli R3 не проявлял (рисунок 10, Б; Контр). Полимер оставался на поверхности изделий в виде тонкой пленки (рис. 11), которая упрочнялась по мере испарения влаги. Данные по спонтанной обсе-мененности хранившяхся проб показаны в табл. 17. Активности исходных супернатантов. Активности супернатантов с 10%
Из представленных в табл. 17 данных следует, что хранение образцов срезов сосисок в нативном виде, т.е. без нанесения на поверхность поливинилового покрытия с бактерицидным веществом (контроль 1), приводит к размножению на поверхности среза различных видов микроорганизмов, включая бациллы и дрожжи в больших количествах. Несколько снизился уровень микробной контаминации у образца, обработанного чистым раствором ПВС (контроль 2), но заметно уменьшилось число бациллярных форм. В тоже время использование БЦВ, продуцируемых штаммами В. circulans и Р. роїутуха, в составе защитных пленок на основе ПВС обеспечивает существенное (в сотни раз) снижение как общей микробной обсемененности сосисок в процессе хранения, так и разнообразия контаминантов. С поверхности срезов сосисок полностью исчезают, например бациллярные формы, которые являются ключевыми агентами порчи продуктов питания [22; 25]. Экспериментальные образцы различались лишь по количеству морфологически схожих кокковых форм контаминантов. Такая же картина наблюдалась и после 10 суток хранения второй партии проб. Проведенный органолептический контроль проб по окончании опыта выявил появление гнилостного запаха лишь у контрольных вариантов, один из которых хранился без полимерного покрытия, другой был покрыт пленкой без бактерицидного вещества.
Таким образом, нами была показана потенциальная возможность снижения скорости контаминации поверхности вареных мясных изделеий микроорганизмами при помощи полимерной пленки, содержащей бактериоцино-подобное соединение штамма В. circulans. Наблюдаемые эффекты являются следствием активности БПС, которая способна беспрепятственно диффундировать из полимерной пленки и оказывать ингибирующее действие в отношении ключевых бактерий, вызывающих порчу сосисок и подобного рода других продуктов из мяса.
