Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Краткая характеристика возбудителей колибактериоза 10
1.2. Современные представления о профилактике колибактериоза 15
1.3. Свойства бактериальных токсинов эшерихий 16
1.4. Клинико-диагностическое значение ферментемий 19
1.5. Биохимические показатели крови у птиц 24
Собственные исследования и их обсуждение 35
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Объекты исследования 35
2.2. Микробиологические методы исследования 36
2.3. Иммунизация и заражение цыплят 39
2.4. Методы исследования сыворотки крови цыплят 39
2.5. Биохимические методы исследования 42
2.6. Гематологические методы исследования 47
2.7. Методы статистического анализа результатов 48
Глава 3. Метаболические особенности цыплят разных кроссов 49
3.1. Возрастные изменения биохимических показателей сыворотки крови интактных цыплят разных кроссов 49
3.2. Изучение особенностей метаболизма цыплят разных кроссов и выявление наиболее информативных биохимических тестов 58
3.3. Морфологические исследования периферической крови цыплят кросса «Родонит-2» различного возраста 62
Глава 4. Оценка эффективности иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» бактериями Е. coli Б-5 66
4.1. Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов Е. coli №1, Е. со//№388 (02), Е. coli №389 (078) 66
4.2. Изучение токсинпродуцирующей способности штаммов Е. coli, вызывающих колибактериоз у птиц 66
4.3. Изучение антигенного сходства исследуемых штаммов Е. coli 71
4.4. Оценка состояния клеточного иммунитета у цыплят кросса «Родонит-2», иммунизированных против колибактериоза 77
4.5. Оценка состояния гуморального иммунитета у цыплят кросса «Родонит-2», иммунизированных против колибактериоза 83
4.6. Оценка состояния гуморального иммунитета у иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2», зараженных вирулентными штаммами Е. coli 90
4.7. Оценка состояния антитоксических свойств сыворотки крови иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2» 92
4.8. Оценка формирования иммунной памяти у иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2» 97
Глава 5 . Биохимические показатели крови у зараженных и иммунизированных против колибактериоза цыплят 99
5.1. Оценка биохимических показателей сыворотки крови цыплят кросса «Родонит-2» при формировании иммунитета к колибактериозу 99
5.2. Изучение биохимических параметров сыворотки крови иммунизированных цыплят при заражении вирулентными штаммами кишечной палочки 105
Глава 6. Изучение привесов и патоморфологических изменений у цыплят При экспериментальном заражении вирулентными штаммами Е. coli Ill
Заключение 115
Выводы 123
Список литературы 124
Приложения
- Краткая характеристика возбудителей колибактериоза
- Объекты исследования
- Возрастные изменения биохимических показателей сыворотки крови интактных цыплят разных кроссов
- Изучение токсинпродуцирующей способности штаммов Е. coli, вызывающих колибактериоз у птиц
Введение к работе
Актуальность темы. Колибактериоз встречается у многих видов сельскохозяйственных животных. Заболевание может протекать в острой, подост-рой и хронической форме и часто вызывается токсигенными штаммами Escherichia coli. Колибактериоз наносит значительный экономический ущерб птицеводству [11, 203]. У птиц, в отличие от млекопитающих, колибактериоз представляет собой типичную секундарную инфекцию, развивающуюся на фоне сниженного иммунитета, и часто протекает как конечная стадия других инфекционных заболеваний [97, 195].
Вирулентность штаммов Escherichia coli для цыплят значительно варьирует при параллельном заражении возбудителями других болезней, такими как вирус инфекционного бурсита VVIBDV, микоплазмы; необходимая для развития колибактериоза заражающая доза в этом случае может снижаться в тысячу раз и более [127, 154]. Чаще других вызывают колибактериоз у птиц штаммы Е. coli, принадлежащие к серовариантам Ol, 02, 035, 078, 0111 [11, 108]. Более 58% выделенных эпизоотических штаммов Е. coli не типируются коммерческими коли-сыворотками отечественного производства [15, 130]. Большинство современных вакцин против колибактериоза, выпускаемых медико-биологической промышленностью, являются инактивированными. Имеется много сообщений об успешном приготовлении и применении инактивирован-ных вакцин против колибактериоза птиц из серотипов Е. coli 02 и 078 [15, 71, 107]. Есть сообщения о применении живых вакцин на основе штамма Е. coli Б-5 для профилактики колибактериоза телят и поросят [74, 83, 84]. Вышеизложенное определяет актуальность исследования биологических характеристик штаммов Е. coli, как вызывающих колибактериоз у цыплят производственно значимых кроссов, так и способных формировать протективньтй иммунитет.
В возникновении колибактериоза, развитии и исходе заболевания резистентность организма играет важнейшую роль [19, 159]. В этой связи изучение реактивности организма птиц приобретает актуальность для понимания патоге-
неза заболевания и механизмов формирования к нему эффективного иммунитета [103]. Для адекватной оценки физиологического состояния организма ин-тактных, зараженных и иммунизированных цыплят необходима разработка методических подходов к определению показателей, наиболее информативно отражающих метаболические изменения в организме.
Цель работы состояла в сравнительном анализе свойств вирулентных штаммов Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), Е. соН №1 и оценке механизмов формирования устойчивости к ним организма цыплят при введении бактерий штамма Е. coli Б-5.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительный анализ морфологических, культуральных,
биохимических и серологических свойств вирулентных штаммов Е. coli № 388
(02), Е. coli №389 (078), Е. coli №1, их антигенного сходства и способности
продуцировать токсины.
2. Определить наиболее оптимальный возраст для проведения иммуниза
ции птиц против колибактериоза с учетом особенностей метаболических про
цессов в организме цыплят.
Проанализировать бактерицидную активность и токсиннейтрали-зующую способность сыворотки крови цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных штаммом Е. coli Б-5.
Оценить способность сыворотки крови цыплят, иммунизированных штаммом Е. coli Б-5 образовывать in vitro иммунокомплексы с антигенами различных вирулентных культур эшерихий.
Изучить метаболические изменения в организме иммунизированных цыплят при заражении различными вирулентными культурами Е. coli и отобрать наиболее информативные показатели, характеризующие устойчивость цыплят к колибактериозу.
Научная новизна. Выявлено, что различия изученных вирулентных для птиц штаммов Е. coli связаны не только с их липополисахаридом и мембранными белками, но и со способностью продуцировать токсины. Впервые показа-
но влияние иммунизации цыплят бактериями штамма Е. coli Б-5 на способность их сыворотки крови нейтрали зовывать токсический материал вирулентных штаммов различных серогрупп Е. coli и образовывать in vitro иммунные комплексы с антигенами этих штаммов. Проведено комплексное исследование метаболических и иммунологических процессов в организме цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» при формировании устойчивости к колибактериозу. Обоснован оптимальный возраст цыплят кросса «Родонит-2» для проведения иммунизации против колибактериоза по широкому спектру биохимических, гематологических и иммунологических показателей. Проведен сравнительный анализ метаболических изменений по показателям белкового, углеводного и липидно-го обменов в организме цыплят, иммунизированных и инфицированных вирулентными штаммами Е. coli. Показано снижение значений индекса ферменте-мии у интактных цыплят и его дозозависимое увеличение у иммунизированных после заражения смесью вирулентных штаммов.
Практическая значимость работы. Полученные данные обосновывают возможность использования бактерий авирулентного штамма Е. coli Б-5 для иммунизации цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» с целью создания эффективного антитоксического иммунитета против колибактериоза. Доказано положительное влияние иммунизации на основные производственные показатели у птиц (среднесуточные привесы). Отобран комплекс наиболее информативных микробиологических и биохимических показателей, свидетельствующих о формировании иммунитета против колибактериоза цыплят, который может быть рекомендован к использованию в промышленном птицеводстве.
Материалы диссертации используются в научно-практической работе ГНУ Саратовской НИВС Россельхозакадемии и при чтении лекций на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».
Основные положения, выносимые на защиту
При введении бактерий штамма Е. coli Б-5 у цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» формируется эффективный антитоксический иммунитет к изученным вирулентным штаммам Е. coli №388 (02), Е. coli №388 (078), Е. coli №1. Иммунизация цыплят наиболее эффективна в возрасте 22 дней.
Устойчивость организма цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5, связана со способностью сыворотки крови нейтрализовать токсический материал вирулентных штаммов различных серогрупп Е. coli и образовывать in vitro иммунные комплексы с различными антигенами этих штаммов.
3. Определение индекса ферментемии, отражающего взаимосвязь фер
ментов аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, креатинкиназы,
лактатдегидрогеназы и отношение активности катаболических процессов цен
тральной зоны к анаболическим процессам периферической зоны метаболизма,
позволяет судить о метаболических изменениях в организме иммунизирован
ных и инфицированных Е. coli цыплят.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Юбилейной конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006); VII Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»» (Новочеркасск, 2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Краткая характеристика возбудителей колибактериоза
Термином колибактериоз обозначается группа бактериальных инфекционных болезней с фекально-оральным и аэрогенным механизмом передачи возбудителя. Заболевание сопровождается общей интоксикацией организма и дисфункцией кишечника [40]. Колибактериоз вызывают диареегенные штаммы кишечной палочки Echerichia coli (семейство Enterobacteriaceae) [50]. Согласно международной классификации кишечных бактерий [70], род Escherichia представлен одним видом Е. coli, который подразделяется на сероферментативные типы. Клетки Е. coli представляют собой грациликутные палочки длиной 1-4 мкм и толщиной 0,4-0,6 мкм [51]. Под влиянием внешних факторов эшерихии могут трансформироваться в нитевидные формы длиной до 8-10 мкм. Спор не образуют. Относятся к перитрихам, однако некоторые штаммы являются атри-хами. Под действием различных антибиотиков Е. coli переходит в L-форму, представленную сферическими элементами различной величины (5-20 мкм). Серотипы, изолированные от здоровых животных, не способны образовывать капсулу. Серотипы, изолированные от больных животных, могут быть как кап-сулообразующими (08, 09, О101), так и некапсулообразующими [109].
Клетки кишечной палочки красятся любыми анилиновыми красителями. Е. coli обладает ресничками, пилями, фимбриями. Реснички выполняют функцию рецепторов, посредством которых происходит абсорбция на бактериальной клетке РНК-содержащих фагов и осуществляется проникновение РНК бактериофага в микробную клетку. Через F-пили в процессе конъюгации происходит передача генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту. Фимбрии обладают адгезивными свойствами. С их помощью эшерихии прикрепляются к энтероцитам кишечника.
По отношению к потребности в кислороде Е. coli — аэроб или факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста культуры кишечной палочки составляет 37,5С, хотя расти она может в температурных пределах 15-45С. Оптимум рН=7,0, но культивировать Е. coli можно и при значительных колебаниях реакции среды. Выращивают Е. coli как на обычных (МПБ, МПА), так и на дифференциально-диагностических средах (Эндо, Левина) [70]. На МПА S-формы образуют округлые, слегка выпуклые, непрозрачные колонии с ровными краями. R-форма представлена сухими, плоскими, плотно прилегающими к среде колониями с неровными краями. Кишечная палочка не требовательна к питательной среде и способна размножаться даже в изотоническом растворе хлорида натрия [47].
Одним из ведущих дифференциальных признаков кишечной палочки, отличающих ее от бактерий других родов семейства Enter obacteriacea, является способность сбраживать лактозу с образованием кислоты и выделением газа [197]. При сбраживании углеводов образуется пировиноградная кислота, последовательно превращающаяся в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Глюкоза, лактоза, маннит сбраживаются с образованием кислоты и газа. Сахароза и дульцит ферментируются непостоянно [28].
У штаммов данного вида выявлено более 170 различных соматических (О) и 50 жгутиковых (Н) антигенов, а также капсульные (К) антигены [116]. Поверхностные антигены провоцируют типоспецифический антительный ответ, глубинные - видоспецифический [59]. Диареегенные штаммы кишечной палочки сохраняют жизнеспособность в молоке до 34 дней, при 60С гибнут через 10 минут, под струей кипятка — мгновенно, а в 1% растворе хлорамина, 1-2% растворе хлорной извести, 1% растворе фенола, 3% растворе лизола-через 15-30 минут.
Источником возбудителя при заражении являются больные животные и носители, причем первые имеют более высокую эпидемиологическую значимость, чем вторые [231]. Продолжительность периода заразительности источника инфекции зависит от свойств конкретного штамма возбудителя. При ко-либактериозе, вызываемом штаммами кишечной палочки, относящимися к А группам ЕТЕС и ЕНЕС, больные животные заразны только в первые дни заболевания; если же возбудитель относится к группам EIEC и ЕРЕС, период зара 12 зительности может составлять до трех недель. Носители инфекции, сами оставаясь клинически здоровыми, способны выделять возбудитель в окружающую среду месяцами. У млекопитающих основной механизм передачи возбудителя фекально-оральный; животные заражаются через инфицированные корма и воду. У птиц первое место по значимости занимает аэрогенный путь заражения, второе — алиментарный. Характерна высокая естественная восприимчивость животных к возбудителю, наиболее выраженная среди новорожденных и ослабленного молодняка. Продолжительность инкубационного периода варьирует от 1 до 10 дней, но обычно не превышает 3-х дней [46].
Заболевание может протекать в острой (септической), подострой и хронической форме. При острой форме колибактериоза отмечаются потеря аппетита, сонливость, угнетение, отставание в росте, диарея, жажда. Свидетельством поражения цыплят колибактериозом в острой форме является резкое увеличение среднесуточной смертности. Погибает до 70% поголовья и более. Для подострой и хронической формы заболевания характерны резкое снижение среднесуточных привесов и оперяемости молодняка. Смертность при хронической и подострой формах колибактериоза обычно не превышает 10%, но выбраковка тушек может достигать 15%. При преимущественном поражении респираторного тракта цыплята чихают, хрипят; для поражения желудочно-кишечного тракта характерна длительная диарея. Может развиваться панофтальмит, сопровождающийся полной или частичной потерей зрения.
Колибактериоз встречается как в виде локальной, так и в виде системной инфекции. У птиц, в отличие от млекопитающих, колибактериоз представляет собой типичную секундарную инфекцию, развивающуюся на фоне сниженного иммунитета. С другой стороны, у птиц эшерихиоз является оппортунистической инфекцией, которой принадлежит большая роль в развитии вторичных инфекций.- Колибактериоз наносит значительный экономический ущерб птицеводству [203]. Колибактериоз птиц часто протекает как конечная стадия других инфекционных заболеваний. Вирулентность кишечных палочек значительно варьирует при параллельном заражении цыплят возбудителями других болезней, такими как вирусы болезни Ньюкасла (в том числе вакцинные штаммы) и инфекционного бурсита, микоплазмы. Необходимая для развития колибакте-риоза заражающая доза в этом случае может снижаться в 1000 и более раз, что косвенно доказывает значение первичного патологического процесса, вызванного другими возбудителями, в возникновении и развитии эпизоотии колибак-териоза [15]. У птиц, достигших 5-месячного возраста, острая форма колибак-териоза практически не встречается. В этом возрасте болезнь сопровождается развитием овариитов, сальпингитов, желточных перитонитов, а также снижением или полным прекращением яйцекладки [114].
Объекты исследования
В эксперименте было задействовано 300 цыплят, в том числе цыплят-бройлеров кросса «ROSS-308» - 100 голов и цыплят яйценоского кросса «Ро-донит-2» - 200 голов. Использовали штаммы Escherichia coli Б-5 [18], Е. coli №388 (02) и Е. coli № 389 (078) (ФГУ ВИЭВ), а также полевой изолят Е. coli №1, выделенный из костного мозга павшего цыпленка с признаками колибактериоза. Штаммы Е. coli были получены из Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ). Эти штаммы характеризовались LD5o — 125 млн. м.к. Культура Е. coli №1, согласно паспорту, не типировалась отечественным набором коли-сывороток, была токсигенна в эдематозном тесте на белых мышах, продуцировала р-гемолизин; клетки этого штамма не обладали подвижностью. Штамм Е. coli Б-5 депонирован в ФГУ ВГНКИ (справка о депонировании № 1807/15 от 10.10.02).
Данный штамм стойко продуцирует термолабильный токсин, обусловливающий его антигенные свойства. Ранее была показана возможность использования этого штамма для создания экспериментальной вакцины против колибак-териоза поросят и телят [18, 83, 84]. Устойчивость поросят и телят первых дней жизни к колибактериозу достигалась при вакцинировании за счет активизации антитоксического иммунитета, а также увеличения степени завершенности фагоцитоза. Установлено, что иммунизация экспериментальных животных живыми клетками штамма Е. coli Б-5 приводила к увеличению фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении бактерий как гомологичного штамма Е. coli Б-5, так и гетерологичного штамма Е. coli А-5 [18]. Показано, что экспериментальная вакцина на основе штамма Е. coli Б-5 обеспечивает антитоксическую защиту. Микробиологические методы исследования Изучение морфологии клеток и колоний различных штаммов Е. coli, их культуральных, тинкториальных, биохимических и серологических свойств
проводили в соответствии с общепринятыми в микробиологических исследованиях методами [18, 22]. Микробиологические исследования включали также определение параметров фагоцитоза, бактерицидной активности сыворотки крови, содержания иммунокомплексов, изучение антигенного сходства штаммов методами обратной радиальной иммунодиффузии и твердофазного имму-нодота с антителами, меченными коллоидным золотом, определение некоторых свойств бактериальных токсинов. Всего проведено 2200 исследований.
Определение продукции токсинов проводили по усовершенствованной нами методике. Достоверным указанием на выработку бактериальным штаммом термолабильного токсина служит увеличение способности тромбоцитов к агрегации в ответ на добавление к стабилизированной крови кролика нативной культуральной жидкости при отсутствии такой реакции в случае этой же куль туральной жидкости, предварительно прогретой в течение 30 минут при 56С. В общепринятой методике результат оценивается по количеству свободно лежащих, не агрегированных тромбоцитов в определенном количестве квадратов сетки Горяева [61, 96]. При наличии в культуральной жидкости термолабильного токсина, различие между прогретой и не прогретой пробами может достигать нескольких сотен процентов [82]. Однако общепринятый метод подсчета количества не агрегированных тромбоцитов в камере Горяева трудоемок и связан с повышенной нагрузкой на зрение.
Нами предложено определять наличие термолабильного токсина по среднему радиусу частиц в обогащенной тромбоцитами плазме крови, с использованием агрегометра. Фактически вопрос о выработке тем или иным штаммом термолабильного токсина в нашей модификации методики сводится к тому, содержится ли в нативной и/или прогретой культуральной жидкости индуктор агрегации тромбоцитов. При этом целесообразно использовать агрегометр, что позволяет избежать применения микроскопа.
Кровь у кролика отбирали из ушной вены в силиконированные пробирки с 3,8% раствором натрия лимоннокислого трехзамещенного до конечной концентрации антикоагулянта 0,38%. Культуральные жидкости штаммов вносили в пробирки со стабилизированной кровью в соотношении 1:2. Определение агрегации тромбоцитов проводили двумя способами: а) подсчетом количества отдельно лежащих тромбоцитов в 5 больших квадратах сетки Горяева и б) определением изменения радиуса частиц в обогащенной тромбоцитами плазме крови на агрегометре Aggregation analyser 220LA. Отрицательным контролем служила кровь с физиологическим раствором, положительным - кровь с 0,1 ммоль раствором АДФ.
Для выявления антигенного сходства штаммов Е. coli применяли тест обратной радиальной иммунодиффузии [16] . Принцип метода: диффузия антител в гель, содержащий соответствующие антигены, приводит к образованию зон преципитации. Готовили 1% агарозу на буферном растворе Дюльбекко. К порциям остывшей до 42С агарозы добавляли антиген (ЛПС соответствующе го штамма) в серии разведений и разливали в чашки Петри. В лунки диаметром 4 мм вносили 20 мкл сыворотки крови иммунизированных животных. Диффузию вели в течение суток во влажной камере. Подсушенную агарозу заливали раствором кумасси бриллиантового синего в 20% уксусной кислоте и 50% метаноле, затем отмывали от не связавшегося красителя 20% раствором уксусной кислоты в 50% этаноле. Результат учитывался как квадрат радиуса окрашенной зоны преципитации вокруг лунки.
Для изучения антигенного сходства исследуемых штаммов использовали также метод твердофазного иммунодота с антителами, меченными коллоидным золотом. Мембрану PVDF деионизировали метанолом. На нее наносили антиген (ЛПС или внешнюю мембрана) в серии двукратных разведений. ЛПС выделяли методом горячей водно-фенольной экстракции. Мембрану подсушивали и обрабатывали 2% молоком для исключения неспецифического связывания антител с мембраной PVDF. Затем наносили иммунную сыворотку, содержащую меченые коллоидным золотом антитела [24-26, 229]. Положительным результатом считали наличие стойкой розовой окраски в месте нанесения антигена.
Возрастные изменения биохимических показателей сыворотки крови интактных цыплят разных кроссов
При сравнительном анализе был отмечен очень высокий индекс де Ритиса в сыворотке крови цыплят кросса «Родонит-2», формирующийся за счет как более высокой по сравнению с цыплятами-бройлерами активности ACT, так и более низкой активности АЛТ. Это свидетельствовало о более высокой активности катаболических процессов у цыплят кросса «Родонит-2» по сравнению с цыплятами-бройлерами благодаря более интенсивному вовлечению субстратов в реакции цикла трикарбоновых кислот. В то же время, активность связанной с анаболическими процессами периферической зоны метаболизма, в частности, глюкозо-аланинового шунта, у цыплят кросса «Родонит-2» была ниже, чем у цыплят-бройлеров, на что указывают более высокие значения активности АЛТ в сыворотке крови последних.
Активность ЛДГ, являюш,ейся НАД-зависимым ферментом конечной реакции гликолиза, в сыворотке крови цыплят кросса «Родонит-2» была более чем в 2 раза ниже, чем у цыплят-бройлеров (р 0,05), что в совокупности с высоким индексом де Ритиса указывает на высокую интенсивность катаболических процессов. Благодаря своему коферменту ЛДГ влияет на мембранный потенциал клеток и, в частности, на связывание гемоглобина с кислородом в эритроцитах (активность ЛДГ в эритроцитах значительно выше, чем в сыворотке крови).ЛДГ поставляет пируват для окислительно-восстановительных реакций цикла трикарбоновых кислот, а также для образования апанина и аспарагино-вой кислоты с помощью ACT и АЛТ. При нестабильных метаболических ситуациях уровень пирувата менее подвержен колебаниям, чем уровень лактата, что отражает большее значение пирувата в обмене веществ.
Лактат служит буферным метаболическим тупиком, нивелирующим резкие колебания концентрации пирувата. Более низкая по сравнению с цыплятами-бройлерами активность ЛДГ говорит о повышении рН за счет уменьшения образования молочной кислоты, что, в свою очередь, служит указанием на смещение влево химического равновесия в обратимой реакции «креатин + АТФ = креатинфосфат + АДФ». В креатинфосфате, в пересчете на 1 моль, аккумули руется в полтора раза больше энергии, чем в АТФ [13, 68]. Повышенный распад креатинфосфата с образованием АТФ также свидетельствует об уменьшении суммарной энергии, аккумулированной в макроэргических связях, и о преобладании катаболических процессов над анаболическими. С этим согласуется и более низкая активность ЛДГ, позволяющая предположить меньшую интенсивность биохимических реакций гликолиза у цыплят кросса «Родонит-2».
Что касается липидного обмена, концентрация общего холестерина у цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» была несколько выше (р 0,05), но индекс атерогенности - значительно ниже (р 0,05), чем у цыплят-бройлеров. Доля липопротеидов с высоким относительным содержанием белка (ЛПВП) в сыворотке крови была выше (р 0,05) по сравнению с цыплятами-бройлерами. Это указывает на более высокую интенсивность липидного обмена, т.к. ЛПВП осуществляют транспорт холестерина из различных органов и тканей, прежде всего, миокарда, в печень, где холестерин переводится в желчные кислоты и удаляется из организма. При этом уровень триглицеридов, как одной из основных транспортных форм липидов, у цыплят разных кроссов существенно не различался. Это косвенно указывает на большую интеграцию белкового и липидного обмена у цыплят кросса «Родонит-2» по сравнению с цыплятами-бройлерами.
Для адекватной оценки состояния липидного обмена необходима информация не только о содержании в сыворотке крови общего холестерина, но и о липидном профиле, т.е. концентрации липопротеидов высокой, низкой и очень низкой плотности [42]. Изучение липидного профиля дает возможность не только сделать вывод о наличии у животного дислипопротеинемии, но и типи-ровать ее.
Оценка липидного профиля совершенно невозможна без определения концентрации общих триглицеридов, но это очень лабильный показатель, на который влияет множество трудно учитываемых факторов (время, прошедшее от приема пищи до забора крови, состав пищи, состояние желудочно-кишечного тракта, физическая нагрузка и др.). Если в клинической практике медицинских исследований можно проконтролировать соблюдение пациентом необходимого режима перед забором крови для исследования липидного профиля, то в ветеринарии это зачастую затруднительно. В этой связи приобретает важное значение решение вопроса об эндогенном или экзогенном происхождении изменения содержания общих триглицеридов (ОТг) в сыворотке крови. Нами предложено при анализе на липидный профиль дополнительно к общепринятым параметрам определять в сыворотке крови животных содержание триглицеридов высокой плотности (Тг-ЛПВП) с последующим вычислением триглицеридового индекса (термин авторский) по формуле:
Изменение триглицеридового индекса является более достоверным свидетельством нарушения липидного обмена, чем повышение или понижение содержания общих триглицеридов. У цыплят-бройлеров в возрасте 14 дней и старше наблюдалось снижение содержания и сыворотке крови холестерина и триглицеридов. При этом индекс атерогенности понижался, а триглицеридовый индекс повышался. Это указывало на то, что снижение концентрации холестерина происходило главным образом за счет липопротеидов низкой плотности, а триглицеридов - за счет липопротеидов высокой плотности.
У цыплят-бройлеров кросса «ROSS-308» активность АЛТ в возрастном диапазоне от 4 до 14 дней достоверно не изменялась, но к 22-дневному возрасту увеличивалась в 2 раза (р 0,05). В то же время, в динамике активности ACT отмечено 2 пика - в возрасте 8 и в 22 дня (р 0,05). Для индекса де Ритиса был отмечен лишь один пик - в 8 дней (р 0,05). Это указывает на то, что интенсивность биохимических реакций центральной зоны метаболизма, связанная с направлением субстратов, в том числе аминокислот, в цикл Кребса, была наибольшей в возрасте 8 и 22 дня. При этом активность периферической зоны метаболизма резко возрастала к 22-му дню. Об этом свидетельствует динамика активности щелочной фосфатазы, которая до 14-дневного возраста оставалась на сравнительно низком уровне, а затем увеличивалась приблизительно в 10 раз. Параллельно в 2 раза возрастала концентрация глюкозы (р 0,05). Это позволяет предположить активизацию анаболического звена метаболизма, в частности, реакций глюкозо-аланинового шунта, к 22-дневному возрасту. Активность ЮС и ЛДГ после 8-дневного возраста неуклонно снижалась, что свидетельствовало об увеличении рН. уменьшении интенсивности реакций гликолиза и смещении равновесия в реакции «креатин + АТФ = креатинфосфат + АДФ» влево. Снижался и индекс ферментемии, что, в дополнение к вышеизложенному, подтверждало увеличение доли гликолиза в энергетическом обмене при одновременном усилении глюконеогенеза.
Изучение токсинпродуцирующей способности штаммов Е. coli, вызывающих колибактериоз у птиц
Первый вопрос, который предстояло решить, касался выбора возраста цыплят, в котором иммунизация была бы наиболее эффективной. Для этого были проведены гематологические исследования на 200 цыплятах кросса «Родонит-2» различного возраста. Результаты представлены в таблицах 8 и 9.
При изучении лейкоформулы было показано, что относительное количество базофилов в крови цыплят кросса «Родонит-2» достигает максимума в возрасте 10-12 дней, затем несколько снижается и становится минимальным в возрасте 112 дней. Доля эозинофилов и гетерофилов, напротив, с возрастом увеличивается и лишь у цыплят старше 90 дней несколько снижается. Относи тельное содержание лимфоцитов наибольшее у цыплят кросса «Родонит-2» в возрасте моложе 10 и старше 110 дней. Что касается моноцитов, их количество оказалось максимальным в среднем возрасте, увеличиваясь к 30-35 дням и достигая минимума в возрасте 112 дней. Суммарное относительное количество гранулоцитов (базофилов, эозинофилов и гетерофилов) в крови цыплят кросса «Родонит-2» оказалось максимальным в возрасте 80-88 дней и минимальным в возрасте 112 дней.
Содержание фагоцитов (гетерофилов и моноцитов) в лейкоформуле было наибольшим у цыплят в возрасте 20-22 дня, а наименьшим — в возрасте 112 дней. Содержание фагоцитов в лейкоформуле цыплят в возрасте 80-88 дней было аналогичным таковому в возрасте 20-22 дня. Абсолютное количество фагоцитов также оказалось наибольшим у цыплят в возрасте 20-22 и 80-88 дней (10,26-Ю9 и 10,25-109 клеток на литр крови соответственно). Согласно литературным данным, цыплята старше 90 дней редко заболевают колибактериозом [69]. Возможно, это связано с высоким содержанием фагоцитов в крови.
Помимо лейкоформулы, определяли в крови цыплят кросса «Родонит-2» содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Уровень гемоглобина и эритроцитов оказался наиболее высоким у цыплят в возрасте 35-60 дней. Количество лейкоцитов было максимальным у цыплят в возрасте 21-22 дня и старше 80 дней. Содержание тромбоцитов было максимально в возрасте до 22 дней, минимально — в возрасте 35-60 дней.
Для оценки эффективности фагоцитарных реакций в организме большое значение имеет определение профиля лейкоформулы как qэaнyлoцитapнoгo или агранулоцитарного. В нашем исследовании лейкоцитарный профиль считался гранулоцитарным, если суммарное относительное количество гранулоцитов превышало 30 процентов.
Примечание: в скобках указано абсолютное количество клеток, в 109 кл/л Было установлено, что в возрасте 5 дней кровь цыплят имеет ярко выраженный агранулоцитарный характер, который уже в возрасте 10-12 дней начинает меняться на гранулоцитарный. В возрасте 20-35 дней профиль лейкофор-мулы становится выраженно гранулоцитарным, причем в возрасте 30-35 дней достигает своего максимума относительное содержание моноцитов. При этом общее содержание лейкоцитов у цыплят в возрасте 21-88 дней колеблется в довольно узких пределах 27,76-31,80-109 клеток/литр, что позволяет соотносить изменения процентной доли лейкоцитов определенной субпопуляции с абсолютным содержанием соответствующих клеток в крови.
Таким образом, установлено, что по составу форменных элементов крови наибольшая фагоцитарная активность проявляется в возрасте 22-35 дней. Следовательно, возраст 3 недели наиболее благоприятен для иммунизации.
Установлено, что в возрасте 35-60 дней концентрация гемоглобина и содержание эритроцитов достигали своего максимума, а содержание тромбоцитов — минимума. Это говорит о том, что к 35 дням у цыплят кровь, а, следовательно, и ткани, максимально насыщены кислородом за счет высокого уровня гемоглобина и оптимальных реологических свойств крови, что обеспечивает наиболее благоприятные условия для протекания кислородзависимых окислительных процессов [11]. Минимальное содержание тромбоцитов указывало на хорошие реологические характеристики и, следовательно, на максимально быстрое удаление из клеток и тканей продуктов обмена, прежде всего, углекислоты. Это согласуется с предположением, что эффективность фагоцитоза зависит от уровня насыщенности тканей кислородом [1, 57]. Принимая во внимание, что от момента иммунизации до возникновения достаточно высокой напряженности иммунитета требуется около двух недель [46], возраст 20-22 дня является наиболее предпочтительным для иммунизации.
