Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Геологическая роль сульфатредуцирующих бактерий
1.1. Современные взгляды на сульфатредуцирующие микроорганизмы 15
1.2. Биогеохимические реакции цикла серы и углерода, осуществляемые СРБ 18
1.3. Осаждение карбонатов 20
1.4. Образование сульфидов металлов 22
1.4.1 Сульфиды железа 22
1.4.2 Образование сульфидов металлов отличных от железа
1.4.3 Биотехнологическое значение осаждения металлов СРБ
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследования 31
2.1. Краткая характеристика изученных экосистем 31
2.2. Методы отбора проб воды и осадков и их гидрохимическая характеристика 32
2.3. Методы определения восстановленных форм серы и кристаллических фаз осадков 34
2.4. Определение численности и исследование биоразнообразия микроорганизмов 44
2.5. Выделение, ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК 46
2.6. Схема постановки экспериментов в присутствии хрома, меди и нерастворимых соединений серы 48
Глава 3. Интенсивность сульфатредукции и образование сульфидов металлов в прибрежных осадках морей 51
3.1. Скорость процесса сульфатредукции и образование диагенетических сульфидов 52
3.2. Изотопный состав окисленных и восстановленных форм серы 62
3.3. Геохимическое значение диссимиляторной сульфатредукции в прибрежных мелководных осадках 67
Глава 4. Геологическая деятельность срб в отходах добычи и переработки металлов и связанных с ними экосистемах 71
4.1. Интенсивность сульфатредукции и образование сульфидов 79
4.2. Изотопный состав окисленных и восстановленных соединений серы
4.4. Распространение и разнообразие сульфатредуцирующих бактерий 80
4.3. Культивируемые СРБ 96
4.6. Роль СРБ в геохимических реакциях в отходах добывающей и металлургической промышленности 113
Глава 5. Устойчивость к ионам металлов и образование сульфидов металлов культурами СРБ 116
5.1. Выделение и изучение чистых культур СРБ устойчивых к меди 116
5.2. Механизмы устойчивости к меди у СРБ 119
5.3. Кинетика роста и образование сульфидов меди чистыми культурами СРВ 125
5.4. Образование H2S и осаждение Cr(VI) чистыми культурами СРВ 133
5.5. Геохимическое и биотехнологическое значение осаждения меди, хрома и других металлов СРВ 139
Глава 6. Использование нерастворимых соединений серы в качестве акцептора электронов
6.1. Восстановление нерастворимых соединений серы чистыми культурами СРВ 145
6.2. Использование нерастворимых сульфатов природными популяциями 156
6.3. Геохимическое значение использования нерастворимых соединений серы 157
Заключение 163
Выводы 169
Список литературы 171
- Современные взгляды на сульфатредуцирующие микроорганизмы
- Методы отбора проб воды и осадков и их гидрохимическая характеристика
- Скорость процесса сульфатредукции и образование диагенетических сульфидов
- Интенсивность сульфатредукции и образование сульфидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Большое значение диссимиляторного восстановления сульфатов в процессах образования минералов хорошо известно исследователям, а работы Г. А. Надсона (1903) по образованию карбоната кальция на сероводородных озерах и Б. Л. Исаченко (1912) по наблюдению сульфидов железа внутри клеток сульфатвосстанавливающих бактерий стоят у истоков возникновения геологической микробиологии наряду с работами X. Эренберга (1838) и С. Н. Виноградского (1887, 1888). Исследования последних двух десятилетий привели к существенной корректировке наших знаний о сульфатредуцирующих бактериях (СРБ). Толерантность к кислороду (Krekeler et al., 1997; Minz et al., 1999; Schramm et al., 1999; Matsui et al., 2004) и возможность его использования в качестве конечного акцептора электронов (Cypionka, 2000), ранняя (3.47 млрд. лет назад) эволюция сульфатного дыхания (Shen et al., 2001; Shen and Buick, 2004), его вероятное монофилетическое происхождение (Wagner et al., 1998; Stahl et al., 2002) и распространение внутри различных доменов через горизонтальный перенос генов (Klein et al., 2001; Zverlov et al., 2005), а также активность СРБ в широком диапазоне температур и кислотности среды, предполагают более широкие возможности сульфатредукторов в сфере геохимических преобразований. Особое значение имеют геохимические реакции, приводящие к осаждению или растворению минералов, связанные с мобилизацией или выведением из круговорота соединений различных элементов.
Образование сульфидов железа и, прежде всего, пирита, в результате микробной сульфатредукции в современных осадках Мирового океана определяют как важнейший биогеохимический процесс выведения серы из ее глобального круговорота (Иванов, 1983; Ehrlich, 1996). Большое значение этот процесс имеет в высокопродуктивных экосистемах прибрежных осадков, получающих значительное количество биогенов и реакционноспособного железа, наряду с терригенным органическим веществом. Хотя образование сульфидов было описано в осадках прибрежных маршей (Howarth, 1979; Howarth and Giblin, 1983; Howarth and Merkel, 1984), детальное изучение образования различных восстановленных форм серы в мелководных морских осадках, подверженных активному антропогенному влиянию, ко времени начала наших исследований не проводилось. Осадки северо-западного шельфа Черного моря, получающего более 75% всего речного стока и отличающегося высоким содержанием автохтонного и аллохтонного органического вещества и железа, являются одним из ярких примеров таких экосистем.
Наряду с морскими осадками, характеризующимися высоким содержанием сульфата, существуют наземные экосистемы, где высокое содержание SO4" может обеспечивать активные процессы сульфатредукции и сульфидообразования. Это зоны гипергенеза сульфидных руд и многочисленные места хранения отходов добычи и переработки металлов. Активные окислительные процессы являются причиной высокой концентраций ионов SO4 " и различных форм железа. Окисление сульфидных минералов серуокисляющими микроорганизмами традиционно рассматривают как основной биогеохимический процесс в этих экосистемах, где преобладают окисленные условия и часто низкие значения рН среды (Иванов, Каравайко, 2004). Новые данные о физиологии СРБ предполагают, что эта группа бактерий может принимать участие в образовании вторичных сульфидов в экосистемах, характеризующихся высоким содержанием S042", несмотря на окисленные и кислые условия среды. Хотя отдельные сообщения о присутствии значительной популяции СРБ в окисленных зонах хвостохранилищ добычи металлов (Fortin et al., 1996; 2000) были известны из литературы, их активность, распространение и разнообразие оставались малоизученными. Современные методы молекулярной экологии, позволяют достоверно описать микробное сообщество, включая культивируемые и
7 некультивируемые микроорганизмы, осуществляющие диссимиляторное восстановление сульфатов.
Исследование образования сульфидов в условиях повышенной концентрации ионов металлов, отличных от железа, имеет большое прикладное значение для создания современных биотехнологий очистки от металлов. Существенный недостаток наших знаний в области устойчивости СРБ к катионам тяжелых металлов ограничивает их использование в биотехнологиях (Johnson, 2000; Sani et al. 2001; Vails, de Lorenzo, 2002). К моменту начала наших исследований СРБ, способные развиваться в условиях концентраций, превышающих сотню мг/л ионов Cu(II) и других металлов, были неизвестны. Существовало мнение, что СРБ не могут играть значительной роли в образовании сульфидов, отличных от железа, в силу высокой токсичности ионов металлов для микроорганизмов (Davidson et al., 1962; Ehrlich, 1996).
Так как сульфаты обладают значительно большей растворимостью и составляют большой резервуар в природе, то внимание исследователей, изучающих процессы микробной сульфатредукции, было в основном направлено на исследование восстановления растворимых сульфатов. Однако некоторые экосистемы могут содержать большие количества нерастворимых сульфатов/сульфитов. Следует отметить, что здесь и далее мы используем химическую классификацию, следуя которой, нерастворимыми называют соединения, если их количество, переходящее в раствор, составляет менее 0.01 г вещества на 100 г воды. Примером являются сульфаты бария в морских осадках (особенно в зонах гидротерм и холодных сипов), сульфаты радия, распространенные в отходах урановых рудников, или сульфиты кальция, которые образуются в больших количествах в промышленности при улавливании S02 и часто захораниваются вместе с бытовыми отходами. Возможность участия СРБ в восстановлении нерастворимых сульфатов/сульфитов не получила детального рассмотрения. Однако,
8 учитывая масштабы образования этих соединений, их возможное восстановление может вносить вклад в потоки серы в природе.
Цель и задачи исследования. В связи с отмеченными малоизученными вопросами в нашем знании о геологической активности СРБ, цель настоящей работы состояла в изучении реакций цикла серы и металлов, осуществляемых СРБ и связанных с образованием и растворением минералов. Следующие задачи были сформулированы для достижения поставленной цели:
Изучить особенности процесса образования сульфидов железа и пирита в осадках мелководных шельфовых зон, характеризующихся высокими скоростями микробной сульфатредукции.
Исследовать распространение и активность СРБ в экосистемах, связанных с добычей и переработкой сульфидных минералов.
Определить состав микробного сообщества, диссимиляторно восстанавливающего сульфаты, включая культивируемые и некультивируемые формы в экосистемах, связанных с добычей и переработкой сульфидных минералов.
Выделить СРБ устойчивые к катионам металлов, изучить их физиологию, возможные механизмы устойчивости к металлам и реакции осаждения металлов.
Изучить реакции использования нерастворимых сульфатов и сульфитов в качестве акцептора электронов чистыми культурами и природными популяциями СРБ и определить возможность образования минералов в качестве конечных продуктов этих реакций.
Научная новизна работы. Результаты исследования расширяют представления о процессах диагенетического пиритообразования в шельфовых зонах Мирового океана и описывают особенности микробной сульфатредукции в мелководных морских экосистемах в условиях
9 антропогенного стресса. Показана зависимость скорости образования пирита от суммарной скорости микробной сульфатредукции и окислительно-восстановительных условий среды в осадках, характеризующихся относительно высокими концентрациями реакционноспособного железа.
Впервые проведены комплексные исследования процессов микробной сульфатредукции в различных экосистемах, содержащих отходы добычи и переработки металлов. Эти исследования включали: 1) измерение скорости процесса с радиоактивной меткой; 2) изучение состава стабильных изотопов серы окисленных и восстановленных соединений; 3) аналитическое определение форм серы и других соединений; 4) определение численности культивируемых и некультивируемых СРБ традиционными и молекулярно- экологическими методами; 5) выделение чистых культур СРБ. Различными методами впервые показано, что вторичные сульфиды могут образовываться за счет деятельности СРБ не только в зоне вторичного сульфидного обогащения, характеризующейся анаэробными условиями, но и в окисленной зоне коры выветривания сульфидных месторождений и экосистем, связанных с хранением отходов добычи и переработки металлов. Охарактеризовано филогенетическое разнообразие СРБ в отходах добычи и переработки металлов. Впервые выделены в чистую культуру и охарактеризованы СРБ устойчивые к ионам двухвалентной меди и шестивалентного хрома. Показано, что устойчивость к меди у СРБ может определяться двумя механизмами - образованием сульфидов меди и активным энергозависимым транспортом меди из клетки.
Последовательности, родственные генам рсоА и pcoR были ПЦР-амплифицированы из изолятов СРБ, устойчивых к меди. Выделение штаммов СРБ, способных к росту при высоких концентрациях меди позволило впервые провести исследование образования сульфидов меди с использованием методов рентгено-фазового и рентгено-флуоресцентного анализов и продемонстрировать возможность образования кристаллических
10 сульфидов меди - ковеллита, халькоцита и халькопирита чистыми культурами СРБ.
Впервые показана способность использовать ханнебахит (CaS03) в качестве конечного акцептора электронов, и исследованы закономерности восстановления других нерастворимых соединений серы чистыми культурами СРБ.
Практическая значимость работы._ Обнаруженные закономерности протекания процесса микробной сульфатредукции в прибрежных осадках могут быть использованы для моделирования антропогенного влияния на мелководные шельфовые зоны Мирового океана, и в частности, для прогнозирования гидрохимической ситуации на северо-западном шельфе Черного моря.
Выявленные закономерности образования сульфидов в экосистемах, связанных с добычей и переработкой металлов, важны для создания технологий по очистке этих экосистем, таких как искусственные ветланды, активные зоны сульфатредукции и реакционные барьеры. Определенные скорости пиритообразования в коре выветривания рудных месторождений могут быть использованы при оценке естественных процессов аттенюации металлов.
Штаммы СРБ толерантные к ионам металлов могут быть использованы для изучения механизмов устойчивости и создания на их основе новых технологий осаждения меди, хрома и других металлов. Преимуществом биогенного осаждения в виде сульфидов является их низкая (по сравнению с образующимися при химической очистке гидроксидами) растворимость и возможность использования традиционных методов гидрометаллургии для извлечения металлов. Возможность переработки отходов сульфидов металлов, образуемых в схемах очистки сточных вод, основанных на сульфатредукции, приобретает особое значение с введением в ряде Европейских стран законодательства, запрещающего образование твердых отходов (например, гидроксидов металлов) при очистке сточных вод (van Houten et al., 2006). Определение основных кристаллических фаз сульфидов меди, образуемых чистыми культурами СРБ, может быть использовано при разработке методов рециклирования меди, осажденной в сульфатредукционных условиях. Важной особенностью некоторых из устойчивых изолятов является их активный рост на дисахаридах и полимерах, которые могут быть использованы как альтернативный субстрат спиртам (этанолу и метанолу), используемым в настоящее время в ряде промышленных схем для технологий осаждения металлов СРБ. Сведения о механизмах, определяющих устойчивость к меди у Desulfovibrio spp. и Desulfomicrobium sp. BL, могут быть использованы в дальнейшем при конструировании генно-инженерно модифицированных СРБ, устойчивых к меди.
Полученные выводы и закономерности восстановления ханнебахита (CaS03) СРБ и образования нерастворимых продуктов важны в процессе менеджмента отходов предприятий, сжигающих ископаемое топливо и улавливающих SO2 на скрубберах. Нерастворимые отходы промышленности, содержащие ханнебахит, могут быть использованы для контроля парниковых газов в местах захоронения бытовых и промышленных отходов (через переключение конечных этапов разложения органического вещества с метаногенеза на сульфатредукцию) и в качестве субстрата роста для СРБ при осаждении металлов в системах с низким содержанием SO42".
Отдельные этапы работы были поддержаны проектами Департамента Образования США (Title IV), ИНТАС (01-2333), ИНТАС (01-0737), 6-й Рамочной программой (BioMineE contract 500329), ФАО РФ (РНП 2.1.1.7338).
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены в виде устных и стендовых докладов на Российских и международных конференциях, включая: Международное рабочее
12 совещание SCOPE/UNEP «Биогеохимические циклы углерода и серы в озерах и водохранилищах» (Иркутск, 1988), 9-й и 17-й Международные симпозиумы по биогеохимии окружающей среды (Москва, 1989; Джексон Хол, США, 2005), Съезд Британского геологического общества (Ноттингем, Великобритания, 2001), Ш-е Международное совещание «Геохимия биосферы» (Новороссийск 2001), Международные симпозиумы по биогидрометаллургии (Оуро Прето, Бразилия, 2001; Афины, Греция, 2003), 1 и 2-ю Международные конференции по Арктической микробиологии (Рованиеми, Финляндия, 2004; Инсбрук, Австрия, 2006), 1-ю Международную конференцию по экологической, промышленной и прикладной микробиологии (Бадахос, Испания, 2005), 105-й съезд Американского микробиологического общества (Атланта, США, 2005), 11-й Симпозиум по Экологии Микроорганизмов (Вена, Австрия, 2006).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 47 печатных работах, включая 26 экспериментальных работ, 4 главы в монографиях и 17 тезисов конференций.
Место проведения работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, были получены автором за время работы в лабораториях биогеохимии ИБФМ АН СССР (1982-1985), микробной биогеохимии ИНМИ АН СССР (1985-1987), группе рудной микробиологии ИНМИ АН АрмССР (1988-1991), Томском государственном университете (1992 - 2006). Отдельные этапы работ были проведены в Институте биотехнологии и биоинженерии, Технологического университета Тампере и на Кафедре микробиологии университета штата Огайо.
Автор искренне признателен коллегам и соавторам Д. Бэнксу, М. Б. Вайнштейну, Дж. Виллиамс, Г. И. Гоготовой, Е. В. Дейнеко, А. X. Каксонен, К. Карлстрем, А. Ю. Леин, Э. Б. Линдстрему, Ю. М. Миллеру, Б. Б. Намсараеву, Д. Никомрат, В. П. Парначеву, Н. В. Пименову, И. И. Русанову,
13 К. Сасаки, Д. А. Старынину, В. А. Шакола, Е. А. Филипенко, Б. Френгстаду, Д. Хобману, С. К. Юсупову, а также студентам и аспирантам кафедр Физиологии растений и биотехнологии и Экологического менеджмента Томского государственного университета А. Герасимчук, А. Демянчук, А. Давыдову, Д. Ивасенко, А. Казаченок, С. Курочкиной, Т. Рычковой, О. Сухановой и Ю. Франк совместно с которыми были получены результаты этого исследования.
Искренняя благодарность Е. А. Бонч-Осмоловской, В. Ф. Гальченко, В. М. Горленко, С. Н. Дедыш и Т. Н. Назиной за помощь в формулировании положений автореферата диссертации.
Автор благодарит Группу Норильский Никель за предоставленную возможность и помощь в отборе проб.
Искренне признательна А. М. Адаму, Э. Г. Африкяну, В. И. Гридневой, Р. А. Карначук, Г. М. Маркосяну, Я. А. Пухакка и О. X. Туовинену за помощь в организации и проведении исследований.
Автор в неоплатном долгу перед М. В. Ивановым, который направлял, помогал и консультировал на протяжении всего периода исследований.
Основные защищаемые положения.
В мелководных шельфовых осадках окраинных и внутренних морей протекает высокоинтенсивный процесс микробной сульфатредукции, сопровождающийся образованием диагенетических сульфидов железа. В условиях высоких концентраций реакционноспособного железа скорость образования пирита зависит от суммарной интенсивности процесса восстановления сульфата и окислительно-восстановительных условий среды.
В экосистемах, связанных с отходами добычи и производства металлов, сульфатредуцирующие микроорганизмы ответственны за образование вторичных аутигенных сульфидов. Этот факт подтверждается измеренными скоростями сульфатредукции, анализом стабильных изотопов окисленных и
14 восстановленных соединений серы и присутствием многочисленного сообщества СРБ.
В исследованных экосистемах отходов добычи и переработки металлов преобладают СРБ родов Desulfobulbus и Desulfovibrio, осуществляющие неполное окисление органических соединений. Методами, основанными на культивировании, обнаружены разнообразные спорообразующие Firmicutes, включая новых представителей рода Clostridium, способных к диссимиляторной сульфатредукции.
В природных экосистемах существуют СРБ, устойчивые к высокому содержанию ионов меди (II) и хрома (VI). Сульфатредукторы, растущие при высокой концентрации ионов Си , способны образовывать сульфиды меди: ковеллит, халькоцит и халькопирит.
СРБ способны использовать нерастворимые сульфаты - барит и англезит, и нерастворимый сульфит, ханнебахит, в качестве конечного акцептора электронов. При восстановлении англезита может образовываться вторичный сульфид, галенит.
1. ГЕОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
Современные взгляды на сульфатредуцирующие микроорганизмы
Способность к получению энергии за счет диссимиляторного восстановления сульфата имеет полифилетическое распространение среди микроорганизмов и обнаружена у представителей двух доменов жизни. Описание сульфатредуцирующих организмов, принадлежащих к домену Archaea (Stetter et al., 1987; Stetter, 1988; Itoh et el., 1999) и новым ветвям, филогенетически удаленным от традиционных сульфатредуцирующих бактерий внутри домена Bacteria (Mori et al., 2003; Sass et al., 2004; Kaksonen et al., 2006), приводит к постепенному замещению понятия «сульфатредуцирующие бактерии» (СРБ) на «сульфатредуцирующие прокариоты» (СРП). Способность к диссимиляторной сульфатредукции в настоящее время обнаружена среди представителей семи различных филогенетических линий микроорганизмов. В соответствии с последним выпуском определителя Bergey s Manual of Systematic Bacteriology это пять отделов домена Bacteria: 1) несколько порядков (Desulfobacteriales, Syntrophobacteriales, Desulfovibrionales) класса Deltaproteobacteria отдела Proteobacteria 2) роды Desulfotomaculum и Desulfosporosinus семейства Peptococcaceae и некоторые другие виды и роды отдела Firmicutes; 3) род Thermodesulfovibrio отдела Nitrospira; 4) отдел Thermodesulfobacteria, и 5) семейство Thermodesulfobiaceae, включающее единственного представителя Thermodesulfobium narugense (Garrity et al, 2004). Немногочисленные известные СРП, попадающие в домен Archaea, относятся к роду Archaeoglobus отдела Euryarchaeota и роду Caldivirga с единственным представителем С. maquilingensis отдела Crenarchaeota. Надо отметить, что большинство выделенных и валидно описанных видов СРП принадлежит к классу Deltaproteobacteria.
Несмотря на широкое распространение сульфатредукции в различных филогенетических ветвях, исследования последовательностей генов ключевого фермента, диссимиляторной (би)сульфитредуктазы (dsrAB) свидетельствуют в пользу монофилетического происхождения этого типа метаболизма (Wagner et al., 1998; Stahl et al., 2002). Современные биохимические и молекулярные данные позволяют предположить эволюционно раннее происхождение фермента, возможно до расхождения доменов, его последующую диверсификацию в разные филогенетические ветви, а также влияние на эволюционную историю событий латерального переноса генов (Klein et al., 2001; Stahl et al., 2002; Zverlov et al., 2005; Wagner et al., 2005). Геохимические данные изотопного состава баритов и микрокристаллов пирита в месторождении Норе Пол (North Pole) в Австралии подтверждают раннее происхождение микробной сульфатредукции, датируя его 3.47 млрд. лет назад (Shen et al., 2001; Shen and Buick, 2004).
В последние два десятилетия существенно изменились наши представления о физиологии СРБ. Узкий круг органических соединений, традиционно рассматриваемый в качестве возможных доноров электрона для восстановления сульфата, расширился более чем до сотни органических субстратов, включая углеводороды, различные ароматические соединения и ксенобиотики (обзор см. Rabus et al., 2000). Ряд возможных акцепторов электронов, отличных от сульфата, распространяется не только на различные соединения серы и нитрат, но включает многие металлы, кислород и хлорсодержащие ароматические соединения.
Современные исследования в области экологии сульфатредукторов содержат многочисленные свидетельства их широкого распространения в окисленных условиях (Krekeler et al., 1997; Minz et al., 1999; Schramm et al., 1999; Stahl et al., 2002, Matsui et al., 2004). Многие виды СРБ способны к окислению различных органических субстратов с использованием кислорода в качестве акцептора электронов (Cypionka, 2000) и недавно была продемонстрирована возможность их участия в минерализации органических соединений за счет окисления кислородом в микробных матах (Jonkers et al., 2005). Микробное восстановление сульфата описано для окисленных условий (Jorgensen and Bak, 1991; Frund and Cohen, 1992). В результате, некоторые авторы предлагают рассматривать СРБ как микроаэрофилов (Marschall et al., 1993), вопреки традиционным взглядам на место и роль этих бактерий в экосистемах. Хотя до сих пор не известно о существовании асидофильных СРП, микробная сульфатредукция была обнаружена в местообитаниях с низким рН (обзор см. Blodau, 2006). Существование алкалофильных сульфатредукторов, относящихся к различным линиям внутри Deltaproteobacteria, хорошо документировано (Zhilina et al., 1997; Пикута и др., 1998; Заварзин и др., 1999; Пушева и др. 1999; Zhilina et al., 2005). Присутствие СРП и развитие процесса микробной сульфатредукции было показано как для условий высоких (Nakagawa et al., 2002; Baker et al., 2003; Nakagawa et al., 2004), так и низких температур (Isaksen and Teske, 1996; Knoblauch et al., 1999; Sahm et al., 1999; Ravenschlag et al., 2000; Wadham et al., 2004; Grabowski et al., 2005; Vandieken et al., 2006).
Методы отбора проб воды и осадков и их гидрохимическая характеристика
В наших работах (Karnachuk and Ivanov, 1992) и работах других авторов (обзор см. Skyring, 1987) показано, что шельфовые зоны Мирового океана, получающие большие количества органического вещества со стоком рек, характеризуются экстремально высокими скоростями бактериальной сульфатредукции. На долю шельфовых отложений по разным оценкам приходится от 50% до 90% всей диссимляторной сульфатредукции, протекающей в экосистемах Земли (Иванов, 1979; Jorgensen, 1982; Волков, Розанов, 1983). По расчетам Бернера (Berner, 1982) количество захораниваемого в приустьевых отложениях и осадках шельфа количество S-пирита оценивается 3.9 х 1013 г в год. Поэтому изучение образования диагенетических сульфидов в мелководных шельфовых зонах Мирового океана имеет особое значение.
Разработанный в лаборатории микробной биогеохимии под руководством М. В. Иванова метод изучения диагенетического преобразования сероводорода, образуемого СРБ, с использованием радиоактивно-меченной серы позволяет дать наиболее точную количественную оценку процесса в условиях максимально приближенных к in situ. Суть метода заключается в химическом разделении и последующем определении количества радиоактивной метки, введенной в форме SO4 не только в свободном сероводороде и кислоторастворимых моносульфидах
(HS" + FeS), но и других восстановленных формах серы - пирите, элементной и органической сере.
Высокое содержание аллохтонного и автохтонного органического вещества является определяющим фактором интенсивного процесса сульфатредукции в изученных нами прибрежных экосистемах. Так, из двух исследованных заливов Японского моря в донные отложения бухты Троица поступает больше органического вещества, чем в осадки залива Восток, что определяет более активное восстановление сульфата СРБ (рис. З.1.). Среди изученных осадков бухты Троица выделяются максимальные значения скорости сульфатредукции, полученные для иловых отложений в районе судоходного канала, загрязненного углеводородами нефти и другими органическими веществами, а в заливе Восток осадки в центре залива, где скапливается основная доля терригенного вещества (Карначук и др., 1990). Максимально высокие интенсивности сульфатредукции в альго-бактериальных матах бухты Кратерная связаны с высокими скоростями продукционных процессов. Суммарная продукция в пробе альго-бактериальных матов фотосинтетической и темновой ассимиляции СОг достигала 6 680 мг С кг"1 сут"1 (Старынин и др., 1989).
Все изученные нами пробы мелководных осадков северо-западного шельфа Черного моря характеризовались высокими скоростями сульфатредукции. Содержание и распределение восстановленных форм серы по профилю осадков свидетельствовало об активизации процессов в период, не превышающий десяти лет до времени отбора проб в 1987 году (Иванов и др., 1992). Экосистема северо-западного шельфа Черного моря находится под влиянием выноса трех крупнейших рек, Днепра, Днестра и Дуная, составляющих 75% всего речного стока в Черное море (Виноградов и др., 1992). Большое количество биогенов, поступающих со стоком из сельскохозяйственных областей Украины, Болгарии и Румынии, в начале 70-х годов привело к резкому увеличению продуктивности фитопланктона и бактериопланктона (Zaitsev, 1993). Увеличение количества биомассы, образующейся не шельфе, с одновременным поступлением терригенного органического вещества привело к активизации деструкционных процессов и, в свою очередь, к эпизодическому истощению растворенного кислорода на мелководье, гипоксии и массовой гибели бентосных организмов. Максимальные интенсивности процесса сульфатредукции были обнаружены нами в иловых отложениях в приустьевых районах Днестра и Дуная (Иванов и др., 1992).
Скорость процесса сульфатредукции и образование диагенетических сульфидов
В целом, проведенное нами изучение различных сторон активности СРБ в мелководных прибрежных осадках показывает, что высокие скорости бактериальной сульфатредукции в этих экосистемах связаны со значительными концентрациями автохтонного и аллохтонного органического вещества. В связи с этим, процессы сульфидообразования испытывают существенное влияние антропогенного пресса как за счет поступления органических веществ из стоков, так и биогенов, стимулирующих продукционные процессы на шельфе. Ярким примером такого воздействия может служить гидрохимическая ситуация на северо-западном шельфе Черного моря. В период наших исследований в 1987 году экосистема получала максимальное количество органических загрязнителей и биогенов со стоком рек Дуная, Днестра и Днепра. На их долю приходится около 76% всего речного стока в Черное моря, в то время как площадь шельфа занимает только 17% от общей территории моря (Толмазин, 1985). Результатом увеличивающейся антропогенной нагрузки явилось изменение гидрохимической ситуации на шельфе в 80-е годы. В периоды температурной сезонной стратификации происходило истощение запасов кислорода и появление сероводорода в водной толще, что в свою очередь, вызывало заморные явления и массовую гибель бентосных животных (Зайцев, 1993). Проведенные нами исследования процессов сульфатредукции зафиксировали экстремально высокие скорости восстановления сульфатов в приустьевых районах (Иванов и др., 1992).
В пользу активизации процесса в небольшой промежуток времени, предварявший наши исследования, свидетельствовало несколько фактов, таких как (1) «нетипичное» для морских осадков максимальное накопление восстановленных соединений серы в верхних горизонтах; (2) присутствие раковинного материала в слоях подстилающих высокосульфидные верхние горизонты илов; (3) максимальные интенсивности сульфатредукции, сопровождающиеся резким снижением концентрации сульфата и увеличением величины изотопного фракционирования в верхних горизонтах иловых колонок.
Более поздние исследования сульфатредукции в приустьевых районах шельфа показали снижение скоростей сульфатредукции в 90-е годы (обзор см. Lein et al., 2002), что несомненно связанно со снижением поступления загрязнителей со стоком рек в результате экономической рецессии в большинстве стран бывшего Советского блока, контролирующих большую часть водосборной площади рек Дуная, Днестра и Днепра. Проведенные в 1997 году исследования распределения форм серы в приустьевых участках Днестра и Дуная показали, что максимальная интенсивность процесса сульфидообразования и наибольший градиент концентрации сульфата был приурочен не к верхним слоям осадков, а находился на глубине около 10 см (Wijsman et al., 2001). Авторы предполагают, что глубине 10-20 см находится ч активный слой, содержащий высокие концентрации лабильного углерода, характеризующийся максимальной сульфатредукцией и содержащий высокие концентрации КРС. В вышележащих слоях интенсивность восстановительных процессов была ниже и образовывались большие количества пирита. Есть все основания предполагать, что обнаруженный авторами в 1997 году слой осадков соответствует верхнему горизонту исследованных нами в 1987 колонок илов.
Необходимо отметить, что конечным результатом высокоинтенсивного процесса сульфатредукции было его связывание в пиритную фракцию. Анализ распределения восстановленных форм серы в осадках Черноморского шельфа показал, что наибольшие концентрации пирита овсстановленной интенсивности сульфатредукции. Осадки, характеризовавшиеся максимальными скоростями, содержали большее количество сульфидов во фракции КРС. Больший процент восстановленной серы в пирите
Современные данные о возможности окисления пирита МпОг в анаэробных условиях в морских осадках (Schippers, Jorgensen, 2001) предполагают, что образование сульфатредукционного пирита не означает окончательного захоронения его в осадках и возможен обратный процесс, мобилизующий окисленные формы серы из FeS2. Окисление пирита протекает с образованием промежуточных окисленных форм серы -тиосульфата, тритионата, тетратионата и пентатионата.
Интенсивность сульфатредукции и образование сульфидов
До недавнего времени состав сульфатредуцирующего сообщества в местообитаниях, подверженных влиянию добывающего и перерабатывающего металлы комплекса, оставался неизученным, несмотря на то, что некоторые исследователи обнаруживали высокую численность СРБ в этих экосистемах (Wielinga et al., 1999; Fortin et al., 2000). Мы впервые провели исследование численности, сопровождаемое определением филогенетического состава культивируемых и некультивируемых СРБ, в отходах горно-добывающей и металлургической промышленности и ветландах, получающих дренажный материал из хвостохранилищ.
Общая численность СРБ, определяемая методом предельных разведений, в Норильских пробах изменялась в небольших пределах около 7 Х 10 клеток см" . В пробах, отобранных на Кольском полуострове, обнаружили значительные колебания количества СРБ от 2.5 МО4 (проба К11) до 2.5 10 (проба КЗ) клеток см". В большинстве случаев наибольшую численность СРБ обнаруживали при добавлении лактата и инкубировании серий разведений в условиях нейтральной среды и температуры +28С (рис. 4.9). Также часто высокую численность фиксировали при росте на глюкозе, этаноле и ацетате. Однако в пробах с кислыми условиями среды как, например, осадки пирротинохранилища в Норильске (проба Т9), на некоторых субстратах количество ацидофильных/ацидотолерантных СРБ превышало число клеток, обнаруживаемых в условиях нейтральной среды. СРБ, растущие на ацетате и бензоате, обнаруживали в значительном количестве в осадках ветланда, получающего дренажные воды из хвостохранилища (Т5), осадках хвостохранилища отходов гидрометаллургического получения меди (Т6) и осадках пирротинохранилища (Т9). Во. многих пробах численность, учитываемая при рН 3.5, была на один - три порядка ниже по сравнению с количеством СРБ, зафиксированным на нейтральной среде. Также численность, определенная при 4 С, была ниже таковой в мезофильных условиях. Бактерии росли значительно медленнее в условиях низкой температуры (+4 С) и иногда первые следы роста появлялись после пяти месяцев инкубации. Тем не менее, иногда численность, определяемая при +4 С, на один два порядка превышала количество СРБ, учитываемое в мезофильных условиях (пробы Т5, Т7, ТІ0 на среде с лактатом, ацетатом и бензоатом). Добавление металлов (Cu2+, Ni2+ и Со2+) снижало количество СРБ, учитываемых методом предельных разведений. В то же время достаточно большое количество СРБ (до 10 клеток см") могло выдерживать начальную концентрацию ионов меди 150 мг/л (рис. 4.10). Для большинства изученных проб прослеживалась известная для морских экосистем тенденция отсутствия корреляции численности бактерий, учитываемых на селективных средах, с интенсивностью процесса сульфатредукции, определяемой с радиоактивной меткой.
Численность СРБ, рассчитанная по количеству клеток, дающих положительный сигнал со специфическими для родов и групп СРБ
Был проведен филогенетический анализ культивируемых и некультивируемых СРБ в пробах осадков Норильской промышленной зоны и Кольского полуострова с использованием методов FISH и ПЦР-амплификации последовательностей 16S рРНК с последующим разделением методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (PCR-DGGE). Определение филогенетического положения СРБ в природных образцах методом FISH имеет преимущество над прямыми методами амплификации генов 16S рРНК и функциональных генов из общего пула ДНК. К настоящему времени разработаны специфические олигонуклеотидные зонды для основных филогенетических групп Грам-отрицательных мезофильных сульфатредукторов (Deltaproteobactreia), и недавно созданы зонды для различных представителей Грам-положительных Desulfotomaculum spp. (Firmicutes) (Hristova et al., 2000). В наших исследованиях при проведении FISH использовали 17 различных 16S рРНК олигонуклеотидных зондов специфичных для основных родов и филогенетических групп СРБ, относящихся к Deltaproteobacteria и зонд на Desulfotomaculum.
В таблице 4.2 представлена доля СРБ от общего числа клеток, окрашиваемых DAPI, которая гибридизовалась с род- и группо-специфическими олигонуклеотидными зондами в осадках трех станций на Кольском полуострове. Осадки К10 отобраны со дна ручья протекающего по шлакоотвалу плавильного цеха в г. Заполярный, проба К11 - осадки хвостохранилища на руднике Каула-Котсельваара (г. Заполярный) и К12 -осадки ветланда, расположенного в непосредственной близости к комбинату по переработке руды и производству цветных металлов в Мончегорске
