Содержание к диссертации
Введение
1 Сульфидогенные бактерии и образование сульфидов металлов 10
1.1 Сульфидогенные бактерии 10
1.1.1 Физиология сульфидогонных бактерий 10
1.1.2 Распространение сульфидогенных бактерий 12
1.1.3 Геохимическая деятельность сульфидогенных бактерий 15
1.2 Образование биогенных сульфидов металлов 18
1.2.1 Образование сульфидов металлов чистыми культурами бактерий 18
1.2.2 Образование сульфидов металлов в природных экосистемах 20
1.3 Роль сульфатредукции в осаждении тяжелых металлов в кислых шахтных дренажах 22
1.4 Использование микроорганизмов для осаждения металлов в технологических схемах 25
2 Объекты и методы исследования 32
2.1 Объекты исследования 32
2.1.1 Характеристика изученных экосистем загрязненных тяжелыми металлами 32
2.1.2 Накопительные культуры 36
2.1.3 Характеристика штаммов сульфидогенных бактерий, использованных в экспериментах 37
2.2 Методы исследований 38
2.2.1 Отбор проб и определение концентрации ионов металлов в осадках хвостохранилищ 38
2.2.2 Определение скорости сульфатредукции и накопления разноактивной метки в сульфидах металлов 39
2.2.3 Культивирование сульфидогенных бактерий 41
2.2.4 Культивирование Desulfovibrio sp. А2 в непрерывной культуре 42
2.2.5 Микроскопирование сульфидогенных бактерий 42
2.2.5.1 Фазово-контрастная микроскопия 42
2.2.5.2 Трансмиссионная электронная микроскопия 43
2.2.6 Получение и изучение сульфидов металлов, образованных сульфидогенными бактериями 43
2.2.7 Молекулярные методы 44
2.2.7.1 Выделение ДНК и амплификация гена 16S рРНК 44
2.2.7.2 Полимеразная цепная реакция 45
2.2.7.3 Денатурирующий градиентный гель-электрофорез и филогенетический анализ 45
3 Образование сульфидов металлов природными популяциями сульфидогенов в отходах горнодобывающей промышленности 47
3.1 Физико-химическая характеристика осадков хвостохранилищ 47
3.2 Характеристика доминирующих филотипов в осадках хвостохранилищ 56
3.3 Образование кислотонерастворимых сульфидов в отходах хвостохранилищ 62
4 Образование сульфидов меди и железа сульфидогенами 65
4.1 Образование сульфидов металлов в периодической культуре 65
4.1.1 Минералогический, электронно-микроскопический и элементный анализ осадков, полученных при инкубации химических контролей без инокулята 65
4.1.2 Образования сульфидов металлов накопительными культурами сульфидогенов 67
4.1.3 Образование сульфидов меди и железа чистыми культурами рода Desulfovibrio 74
4.1.4 Образование сульфидов меди и железа чистой культурой рода Desulfomicrobium 84
4.1.5 Образование сульфидов меди и железа чистыми культурами рода Desulfosporosinus 87
4.1.6 Образование сульфидов меди и железа чистыми культурами рода Tissierela 94
4.2 Образование сульфидов меди в биопленках сульфидогенными бактериями 99
4.3 Образование сульфидов металлов в непрерывной культуре 104
5 Обсуждение полученных результатов 110
Заключение 116
Выводы 118
Список использованных источников и литературы 119
- Геохимическая деятельность сульфидогенных бактерий
- Физико-химическая характеристика осадков хвостохранилищ
- Образование сульфидов меди и железа чистыми культурами рода Desulfovibrio
- Образование сульфидов металлов в непрерывной культуре
Введение к работе
Актуальность темы. Загрязнение тяжелыми металлами различных экосистем представляет одну из наиболее серьезных экологических проблем современного общества. В производственных циклах добывающих и выплавляющих металлы предприятий образуются большие количества отходов и стоков, содержащих высокие концентрации растворенных тяжелых металлов или/и сульфата. Примерами таких отходов являются кислые шахтные дренажи (КШД) (Johnson, Hallberg, 2003), сточные воды предприятий по обогащению металлических руд (Barnes et.al., 1991), сточные воды кожевенных заводов (Shin et.al.,1997), фильтраты гипсовых отвалов (Deswaef et.al., 1996). Наиболее распространенные загрязнители в этих экосистемах -Cu, Zn, Cd, As, Ni, и Fe. Их концентрация варьирует от 10-6 до 102 г/л (Huisman, 2006). В частности, среднее количество меди, поступающее в почвы составляет 35 кг/км2 в год. По оценкам 19300 км рек и примерно 72000 Га озер и резервуаров в мире нанесен серьезный ущерб КШД (Johnson, 2005). Сходную проблему представляет шлак от металлургических предприятий, который размещается в хвостохранилищах и на свалках и содержит высокие концентрации (потенциально ценных) тяжелых металлов.
Сульфидогенные микроорганизмы обладают способностью связывать металлы в нерастворимые сульфиды и являются основными агентами, обеспечивающими естественную очистку природных и техногенных экосистем. Образующие сероводород организмы могут быть использованы в биотехнологиях очистки от металлов сточных вод и отходов горнодобывающей и металлообрабатывающей промышленности. Существует два основных пути образования H2S прокариотами – диссимиляционное и ассимиляционное восстановление сульфата. В процессе диссимиляционной сульфатредукции электроны от органических соединений/водорода переносятся на конечный акцептор – сульфат. Этот процесс приводит к запасанию энергии клетками сульфидогенных микроорганизмов, в том числе и сульфатредуцирующих прокариот (СРП), и образованию значительных количеств H2S. В процессе ассимиляционной сульфатредукции SO4 восстанавливается сульфидогенными бактериями в биосинтетических путях образования серосодержащих аминокислот. Впоследствии сбраживание органических соединений приводит к высвобождению восстановленной серы в форме сероводорода сульфидогенными бактериями (СГБ).
Несмотря на то, что процессы образования сульфидов металлов в природных и техногенных экосистемах вызывают пристальное внимание исследователей, их минералогический и химический состав химический состав остается малоисследованным. Основное внимание до сих пор было направлено на изучение образования диагенетического сульфида железа, пирита, в осадках Мирового океана. Образование сульфидов металлов отличных от железа остается малоизученным. Отчасти причиной этому является невозможность проведения экспериментов с чистыми культурами сульфидогенов из-за токсичности ионов тяжелых металлов (Ehrlich, 2003). Выделение чистых культур сульфидогенов устойчивых к ионам меди (Karnachuk et al., 2003; Карначук, 2006; Герасимчук и др., 2009) позволило провести в нашем исследовании изучение сульфидов Cu и Fe на новых модельных организмах.
Другой экосистемой, где образование сульфидов может иметь большое значение является кишечник человека и животных. Ранние исследования рассматривают образование H2S СРП с позиций цитотоксического действия на клетки организма человека (Macfarlane et al., 2007). До сих пор в научной литературе не обсуждалось возможное связывание металлов в сульфиды и переведение их в бионедоступную форму под действием биогенного сероводорода.
Таким образом, изучение образования сульфидов Cu и Fe сульфидогенными микроорганизмами имеет большое значение для понимания процессов самоочищения в природных экосистемах, важно для совершенствования биогеотехнологий и имеет приложение к пониманию функционирования микробиома человека.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении образования биогенных сульфидов меди и железа в природных экосистемах, а также в накопительных и чистых культурах устойчивых к металлам СРП и СГБ, выделенных из различных экосистем. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Определить скорости образования восстановленных форм серы, включая кристаллические сульфиды Cu и Fe, в экспериментах по восстановлению 35SO2-4 в отходах добычи сульфидных руд.
-
Изучить биоразнообразие, определить распространение доминирующих филотипов Bacteria в отходах добычи сульфидных руд и исследовать влияние физико-химических факторов, связанных с добычей металлов, на распространение микроорганизмов.
-
Изучить физико-химический и минералогический состав сульфидов Cu и Fe, образующихся в накопительных культурах СГБ полученных из различных экосистем, в том числе из желудочно-кишечного тракта человека.
-
Изучить физико-химический и минералогический состав сульфидов меди и железа, образующихся в чистых культурах СГБ, принадлежащих к различным филогенетическим группам и осуществляющих диссимиляционную/ассимиляционную сульфатредукцию.
-
Оценить роль сульфидогенных бактерий в образовании сульфидов меди и железа.
Научная новизна работы. Впервые показано образование кристаллического сульфида меди, халькопирита (CuFeS2), чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий. Впервые детально изучено образование сульфидов меди представителями филума Firmicutes, включая диссимиляционных сульфатредукторов, Desulfosporosinus spp. и сульфидогенных бактерий, образующих H2S при разложении органических субстратов. Образование кристаллических фосфатов железа (вивианита) до настоящего времени не было известно для представителей из микробиома человека.
Впервые проведен подробный анализ элементного состава и минералогии осадков, образуемых чистыми культурами сульфидогенных бактерий, устойчивых к ионам меди и культивируемых в биопленках и биореакторе в условиях непрерывного культивирования. Исследование сопровождалось контролем образования частиц осадка с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.
Личный вклад соискателя. Автор осуществлял отбор проб хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области и определял скорости сульфатредукции. Выращивание чистых культур сульфидогенных бактерий в периодической и непрерывной культуре с ионами металлов автором проводилось самостоятельно. Изучение химического и минерального состава осадков хвостохранилищ и осадков, образованных СРП и СГП проводилось совместно с сотрудниками Центра коллективного пользования ТГУ. Изучение разнообразия микроорганизмов с помощью ДГГЭ-анализа проводилось совместно со студентами учебно-научной лаборатории биотехнологии и биоинженерии ТГУ. Формулирование целей, задач и обсуждение полученных результатов проводилось совместно с научным руководителем.
Практическая значимость работы. Показано, что процессы образования устойчивых к окислению кристаллических сульфидов Cu и Fe за счет активности СРП протекают в кислых и окисленных осадках хвостохранилищ добычи золота. Процессы микробной сульфатредукции могут представлять один из основных механизмов самоочистки этих экосистем. Данные по влиянию условий культивирования на соотношение химического и минералогического состава сульфидов Cu и Fe могут быть использованы при разработке биогеотехнологических процессов очистки стоков, загрязненных металлами. Запатентован процесс получения чистого ковеллита из стоков, содержащих ионы металлов с использованием устойчивого к Cu Desulfovibrio sp. А2.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на V молодежной школе-конференции c международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 26-27 октября 2009); III Международной конференции по экологической, промышленной и прикладной микробиологии «BioMicroWorld 2009» (Лиссабон, Португалия, 2-4 декабря 2009); 8 Международном конгрессе «Extermophiles» (Понта Дельгада, Азоры, Португалия, 12-16 сентября 2010); VI молодежной школе-конференции c международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25-27 октября 2010); 7 Международном совещании по меди «Copper in Biology» (Алгьеро, Сардиния, Италия, 16-20 октября 2010); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ – Улаанбаатар, 5-16 сентября 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, включая 4 публикаций в изданиях, рекомендованных ВАК, 18 других статей и материалов конференций и 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей объекты исследования, материалы и методы и результаты исследования с обсуждением, заключением, выводом и списком литературы. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и включают 60 рисунков и 30 таблиц.
Место выполнения работы. Работа была выполнена в учебно-научной лаборатории биотехнологии и биоинженерии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета под руководством д.б.н., профессора О. В. Карначук. Определение скорости сульфатредукции в осадках хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области проведено во время стажировки в рамках гранта РФФИ по программе «Мобильность молодых ученых» в Лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва (ИНМИ РАН) под руководством к.б.н. И. И. Русанова и д.б.н. Н. В. Пименова.
Исследование образования сульфидов меди и железа СРП и СГП поддержано грантами Министерства образования и науки РФ по программе ФЦП №П336 от 07.05.2010, №11.519.11.2004 от 18.08.2011, №11.519.11.2011 от 30.08.2011.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. профессору О.В. Карначук, а также д.б.н. Н.В. Пименову, к.б.н. И.И. Русанову и к.б.н. А.Л. Герасимчук за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Искренне признательна Д. Бэнксу за определение концентрации металлов, катионов и анионов в пробах воды хвостохранилищ. Автор приносит благодарность всем соавторам, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.
Геохимическая деятельность сульфидогенных бактерий
Сульфидогенные бактерии - преимущественно облигатные анаэробные бактерии. Геохимическая роль сульфидогенных бактерий чрезвычайно велика, поскольку благодаря их деятельности инертное соединение - сульфат в анаэробной зоне в больших масштабах вовлекается в биологический круговорот серы. В дополнение к своей очевидной значимости в цикле серы, СГБ являются важными регуляторами различных процессов в заболоченных почвах, включая разложение органического вещества, биодеградацию хлорированных ароматических загрязнений в анаэробных почвах и осадках, и метилирование ртути (Castro et al., 1999).
Деятельность сульфидогенных бактерий особенно заметна в иле на дне прудов и ручьев, в болотах и вдоль побережья моря. Так как концентрация сульфата в морской воде относительно высока, восстановление сульфата - важный фактор минерализации органического вещества на морских отмелях. Признаками такой минерализации служит запах H2S и черный как смоль ил, в котором протекает этот процесс. Черный цвет ила обусловлен присутствием в нем больших количеств сульфида двухвалентного железа. Некоторые береговые области, где накопление органического вещества ведет к особенно интенсивному восстановлению сульфата, практически безжизненны из-за токсического действия H2S (Lamers et al., 2001).
СГБ принадлежит основная роль в образовании лечебных грязей и медицинских вод (Исаченко, 1951; Заварзин, 1972). В тропических морях в результате сульфатредукции и последующей реакции между сульфидом кальция и углекислотой происходит отложение мела (Исаченко, 1951; Bavendamm, 1932):
CaS04+8H=4H20+CaS CaS+C02+H20=CaC03+H2S
СГБ считаются ответственными за высокое содержание сероводорода в глубинных слоях Черного моря (глубже 200 м). СГБ устойчивы к действию H2S, который может накапливаться до 2 г/л, подавляя развитие других микроорганизмов. Накапливающийся в этих условиях сероводород соединяется с гидратом окиси железа, который окрашивает в черный цвет лечебные грязи и придает черную окраску илу на дне водоемов.
Известны данные по содержанию H2S в воде Чёрного моря. Показано распределение сероводорода в поле глубины, солености, потенциальной температуры и потенциальной плотности. Обращено внимание на постоянство концентраций H2S в придонном ( 1700-1800 м) однородном по солености и потенциальной температуре слое. Определены градиенты H2S на границе однородного придонного слоя с верхней стратифицированной толщей и показано, что поток H2S, также как поток солей и тепла, направлен снизу вверх. Выявленное соотношение CK/H2S близкое к 2 (стехиометрический коэффициент уравнения сульфатредукции) означает, что бактериальная сульфатредукция является практически единственным механизмом минерализации органического вещества в анаэробных водах моря.
Сульфидогенные бактерии обнаружены в пластовых водах и нефти пермских и каменноугольных отложений с активным водообменом. Попадая вместе с закачиваемой водой в нефтяные пласты, сульфидогенные бактерии могут развиваться и проявлять свою деятельность по превращению сульфатов в сероводород. На промыслах Восточного Техаса в результате закачки в пласты воды, содержащей сульфаты и восстанавливающие их бактерии, добываемая вместе с нефтью вода из эксплуатационных скважин оказалась сероводородной. Из-за сероводорода стальные образцы в пластовой воде подвергаются разрушению в 11-13 раз быстрее, чем в стерилизованной пластовой воде. Сероводород усиливает коррозию нефтяного оборудования, ухудшает товарное качество добываемых нефти и газа и создает дополнительные технологические сложности при очистке и переработке этих продуктов. Эти бактерии способны закупоривать поры пласта, не только за счет слизи, но и за счет осаждения сульфида железа, образуемого в результате взаимодействия сероводорода с ионами железа. Этот процесс резко снижает объем добычи нефти (Marshall and Renner, 1995).
С сульфидогенными бактериями связывают образование сероводорода в почвах и лечебных грязях. В почвах деятельность сульфидогенных бактерий приводит к содообразованию. В определенных условиях, благоприятствующих накоплению соды, может произойти содовое засоление почвы. Массовое развитие сульфидогенных бактерий, например, в почвах рисовых плантаций приводит к усилению восстановительных процессов, переводящих многие питательные вещества в доступную для корней риса форму (Marshall and Renner, 1995).
СГБ играют важную роль в биогеохимическом цикле сульфата, металлов и углерода благодаря анаэробному окислению низкомолекулярных тяжелых органических соединений, которые связаны с редукцией сульфатов и нерастворимой структурой сульфидов металлов (Karnachuk et. al., 2003).
СГБ, используя молекулярный водород в процессе метаболизма, препятствуют образованию водородной пленки, защищающей металлы от коррозии:
S04 + 4Н2 - S2" + 4Н20
Далее, уже без участия бактерий, образуются продукты коррозии - FeS и Fe(OH)2:
Fe2+ + S2" - FeS
3Fe2+ + 60FT -» 3Fe (OH)2
Показано, что не только СГБ, но и многие другие бактерии, обладающие гидрогеназами, способны осуществлять катодную деполяризацию и, тем самым, ускорять коррозионные процессы. Помимо катодной деполяризации СГБ ускоряют коррозию стали в результате образования сульфида железа. Последний, осаждаясь на поверхности металла, образует гальваническую пару сульфид железа - железо, в которой сульфид железа играет роль катода. СГБ заметно ускоряют коррозию алюминия, что также связано с деполяризацией катода (Thomas, 2002).
Физико-химическая характеристика осадков хвостохранилищ
Все исследованные осадки характеризовались низким рН и высоко окислительными условиями (таблица 5). В высачиваниях и осадках хвостохранилища «Комсомольский» зафиксированы наиболее кислые условия, с рН=1.75. В воде ветландов отмечено максимально высокое содержание сульфата, железо и многих других металлов, таких как мышьяк, алюминий, цинк, свинец, медь, никель, кадмий (таблица 6).
Как показал элементный анализ, сера, железо, мышьяк и медь наряду с кремнием составляли основную весовую долю исследованных осадков (рисунки 5, 7, 9, 10, таблицы 7, 8, 9). Рентгенофазовый анализ показал, что основными кристаллическими фазами осадков были силикаты (кварц, SiCh (плотность 2.649); тридимит, SiCb (плотность 2.26); кристаллический кремний; коэсит, SiO (плотность 2.93); силицид железа, FeSi2; моносилицид железа, FeSi; оксид кремния, SiO) и продукты окисления сульфидных руд (гематит, Fe20y, берналит, Fe(OH)3; оксид железа, РегОз; оксигидроксид железа, FeOOH) (рисунки 6, 8, 11, 12). Во всех пробах хвостохранилища «Комсомольский» (Том 15, Том 16, Том 17) и «Новый Берикуль» (Том 22) обнаружили сульфид железа - пирит, FeS2 (рисунки 8, 12). В осадке Том 14, отобранный из ручья содержащем массовые обрастания на руднике «Центральный», выявили разнообразные продукты окисления мышьяка и меди, такие как клодетит (клаудетит, AS2O3) и куприт (СигО) (рисунок 6). В этой пробе не было зафиксировано ни сульфидов меди, ни сульфидов железа. В двух пробах хвостохранилища «Берикуль» был обнаружен халькоцит, C112S, - дефицитный по сере сульфид меди (рисунок 11).
Были получены ПЦР-продукты с праймерами на фрагменты гена 16S рРНК с использованием в качестве матрицы суммарной ДНК из проб всех исследованных хвостохранилищ. ДГГЭ-анализ продуктов амплификации выявил различные профили на гене (рисунок 13). Анализ успешно секвенированных ДГГЭ-филотипов из геля выявил присутствие в микробных сообществах представителей Beta-, Gamma- и Deltaproteobacteria, а также Actinobacteria, Acidobacteria, Nitrospirae и Firmicutes (рисунок 14). Кроме бактериальных филотипов были обнаружены 2 эукариотических филотипа в образцах хвостохранилища «Центральный». Ближайшими родственниками эукариотических филотипов были гены 16S рРНК хлоропластов мхов и зеленых водорослей, а именно, генам Syntrichia ruralis с гомологией 97% и Chlorella saccharophila с гомологией 99%. Успешно секвенированные филотипы из ДГГЭ-геля представлены в таблице 10. Среди бактериальных филотипов доминировали традиционные для кислых местообитаний, родственники Fe, S-окислителей Leptospirillum ferrooxidans (Том 19, Том 20), Ferromicrobium acidophilum (Том 20) и различные Sulfobacillus (Том 17, Том 19) (рисунок 15).
Многие обнаруженные филотипы показывали высокую степень гомологии с последовательностями микроорганизмов, выделенных из экстремально кислых экосистем, связанных с кислыми шахтными дренажами (таблица 10). Однако, некоторые организмы, обнаруженные методом ПЦР-ДГГЭ были сильно удалены от известных культивируемых форм. В частности, два филотипа, из пробы Том 17 и Том 19 попадающие в класс Deltaproteobacteria не имели культивируемых родственников с гомологией гена 16S рРНК более 86%. Нужно подчеркнуть, что методы ПЦР-ДГГЭ можно проанализировать только фрагмент, составляющий только 1/3 полного гена. Это означает, что можно ожидать еще большего расхождения последовательностей гена обнаруженных нами организмов и их известных культивируемых родственников.
Образование сульфидов меди и железа чистыми культурами рода Desulfovibrio
Исследовали образование сульфидов, Desulfovibrio sp. А2 в экспериментах с различной продолжительностью в течение 8, 15 и 57 суток и при начальной концентрации ионов меди 250 мгСи/л. Средний размер частиц осадков, полученных при разных сроках культивирования, не изменялся и составлял от 10 до 100 мкм (рисунок 26). Основными обнаруженными элементами в осадках были S, Си, Fe и О. Также присутствовали небольшие количества Р, С1, С, К и Са, входящие в состав среды культивирования. О и С частично могли происходить из клея, фиксирующего образец при анализе. Атомное соотношение меди и серы, в осадках, полученных при культивировании штамма в течение 8 и 15 суток, составляло 1:1.3 и 1:1.2, что близко к сульфиду меди, ковеллиту (таблица 17). С увеличением срока культивирования увеличивалось количество железа в осадках.
Рентгенофазовый анализ показал, что продолжительность культивирования влияла на минералогический состав образующихся сульфидов меди. В экспериментах с краткосрочным культивированием единственной обнаруженной кристаллической фазой был ковеллит (рисунок 27). При более длительном культивировании (15 и 57 суток) наряду с ковеллитом присутствовал халькопирит. Таким образом, минералогический анализ подтвердил данные, полученные при элементном анализе о том, что соотношение Cu:S 1:1.2 и 1:1.3 соответствует кристаллическому сульфиду меди - ковеллиту.
При изучении ультраструктуры бактериальных клеток с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) была показана способность Desulfovibrio sp. А2 к образованию электронплотных наночастиц различной формы. Часть электронплотных частиц имела тонкую игольчатую форму (рисунок 28 А, Б). Обнаружены также частицы шаровидной формы, окружающие клетки (рисунок 28 В). Клетки, выращенные без ионов меди, не образовывали электронплотные частицы (рисунок 28 Г).
Образование сульфидов меди штаммом Desulfovibrio sp. R2 исследовали в экспериментах в течение 9 и 58 суток в присутствии меди в начальной концентрации 200 мгСи/л. Средний размер частиц осадка составлял 75 мкм, в то время как при долговременном культивировании (58 суток) частицы имели более крупные размеры, до 300 мкм (рисунок 29). Основными элементами, обнаруженными во всех осадках, были С, О, S, Fe и Си (таблица 18). Атомное соотношение меди и серы в осадке, образованном при культивировании в течение 9 суток, составляло 1.2:1, что близко к кристаллическому сульфиду меди, ковеллиту. Соотношение элементов при культивировании в течение 58 суток значительно изменялось. Атомная доля серы увеличилась в 2 раза, немного увеличилась атомная доля железа. Соотношение Cu:S в этих осадках составляло 1:1.8, а соотношение Cu:Fe:S было 1.5:1:2.7. Последнее соотношение близко по составу к кристаллическому сульфиду меди и железа, халькопириту.
Рентгенофазовый анализ подтвердил догадку об образовании ковеллита при кратковременном культивировании (9 суток) Desulfovibrio sp. R2, и образование халькопирита в качестве второй кристаллической фазы при длительном культивировании (58 суток) (рисунок 30).
С помощью трансмиссионной электронной микроскопии были изучены тонкие срезы клеток штамма Desulfovibrio sp. R2. Исследовали клетки, выращенные в присутствии меди в начальной концентрации 250 мгСи/л и контроля без меди. После 10 суток культивирования на клетках образовывались электронплотные частицы шаровидной формы. Частицы присутствовали как на молодых клетках, так и на поврежденных старых клетках и сферопластах (рисунок 31 Б, В). Также образовывались частицы в периплазматическом пространстве (рисунок 31 А). Анализ срезов контрольных клеток, выращенных без добавления меди, показал отсутствие электронплотных частиц на поверхности клеток или в периплазме (рисунок 31 Г).
Были получены микрофотографии наноразмерных частиц, образующихся после культивирования в осадке и внутри клеток Desulfovibrio sp. R2 (рисунок 32). Микродифракционный анализ этих частиц показал, что они были представлены кристаллическим сульфидом меди, ковеллитом (CuS) (рисунок 33).
Таким образом, минералогический анализ с большой долей вероятности предполагает что наночастицы зафиксированные нами на средах представлены ковеллитом.
В экспериментах по изучению сульфидов, образованных Desulfovibrio sp. А4 культивирование осуществляли 5, 7 и 15 суток и начальная концентрация ионов меди составляла 200 мг/л. Частицы осадков имели неправильную форму (рисунок 34). В экспериментах с непродолжительным культивированием средний размер частиц осадков колебался в пределах от 20 до 200 мкм. При культивировании 15 суток средний размер частиц осадков увеличился до 400 мкм. Элементный анализ показал, что при всех сроках культивирования основная масса осадка приходилась на Си, Fe и S (таблица 19). В некоторых вариантах опытов присутствовали также пики Р, О, Са, К и О. При кратковременном культивировании (5 и 7 суток) количество меди в осадках превышало количества серы, и соотношение атомного веса этих элементов составляло 1.38:1. При культивировании 15 суток соотношение атомов меди и серы составляло 1:1 (таблица 19), что соответствовало кристаллическому сульфиду меди, ковеллиту (CuS).
Рентгенофазовый анализ выявил присутствие кристаллических фаз в исследуемых осадках. При кратковременном культивировании (5 суток) образовывалась единственная кристаллическая фаза - ковеллит (CuS), а при культивировании в течение 15 суток наряду с ковеллитом присутствовал халькопирит (CuFeS) (рисунок 35).
Изучение ультраструктуры клеток Desulfovibrio sp. А4, культивируемых в течение 7 суток, показало, что клетки не образуют мелкие электронплотные частицы, а лишь незначительное количество клеток содержало на клеточной стенке крупные частицы шаровидной формы (рисунок 36 А). При исследовании клеток штамма, культивируемых в течение 18 суток, на поверхности клеток образовывались мелкие частицы, размером менее 100 нм (рисунок 36 В, Г). В качестве контроля бактерии выращивали без ионов меди и микроскопия ультратонких срезов не показала присутствие частиц аналогичных обнаруживаемых на клетках культивируемых в присутствии Си (рисунок 36 Б).
Образование сульфидов металлов в непрерывной культуре
Методом непрерывного культивирования выращивали чистую культуру Desulfovibrio sp. А2, которая отличается высокой устойчивостью к ионам меди (до 2.6 г/л) и образует наибольшее количество сероводорода (80 мг/л). Температуру культивирования контролировали в диапазоне 28 - 32С, рН 7 - 8.
Первые несколько суток Desulfovibrio sp. А2 культивировали в периодической культуре, для определения лаг-фазы и максимальных концентраций сероводорода и белка. По истечению первых суток культивирования штамма наблюдали образование небольших хлопьев и нитей в среде, образованных бактериями (рисунок 53).
Лаг-фаза составляла 24 часа, после чего концентрация клеток, белка и сероводорода стала резко увеличиваться. На третьи сутки культивирования (64 часа), когда концентрация клеток составляла 57.1х 10 кл/мл (больше половины клеток были неподвижными, что говорит о начале лизиса), а концентрация белка (226.8±8.47 мг/л) и сероводорода (237.5±15.4 мг/л) достигла максимума, включили проток среды. Скорость протока выдерживали на уровне 0.7 мл/мин. При этом количество клеток упало в 2 раза, концентрация сероводорода в 10 раз (24.5±1.12 мг/л), а белка- в 4 раза (55.7±6.5 мг/л), что соответствовало средним концентрациям при периодическом культивировании. По истечении 20 часов ростовые параметры культуры увеличились и составили 83.7±4.2 мг/л - сероводорода, 185.4±25 мг/л - белка и 55.4x106 кл/мл. После 138 часов культивирования Desulfovibrio sp. А2, для поддержания ОВП, среду продули 100% азотом.
По истечении 22.5 часов появились хлопья черного цвета. После этого был установлен проток со скоростью 0.5 мл/мин. Когда концентрации белка и сероводорода увеличились в 4 раза, с 57.9±4.35 мг/л до 256.7±16.3 мг/л и с 37.1±2.28 мг/л до 161.8±19.9 мг/л, соответственно, скорость протока увеличили до 2.48 мл/мин.
Перед тем как поставить проток со средой, содержащей ионы меди в начальной концентрации 100 Си мг/л, старались поддерживать одну и ту же концентрацию сероводорода, белка и клеток с помощью регулирования скорости протока. Через несколько часов, после того как, был подключен проток (3 мл/мин) среды с 100 Си2+мг/л, концентрация белка, как и концентрация клеток, уменьшились с 310.3±8.8 до 212.2±6.8 мг/л и с 51x10 до 42x10 кл/мл, соответственно. При этом концентрация сероводорода практически не изменилась. Среда в ферментере сильно помутнела и стала черно-коричневой. Через сутки образовались крупные хлопья черного цвета (рисунок 54). Скорость протока снизили до 1 мл/мин.
После 3 часов культивирования бактерий в среде с 100 Си2+мг/л, количество сероводорода упало с 114.9±6.75 мг/л до 95.9±1.2 мг/л, а через 20 часов - до 63.1±24.3 мг/л. Также наблюдали уменьшение в 2 раза концентрации белка, с 212.2±6.8 мг/л до 125.5±9.2 мг/л (рисунок 55). После первых суток культивирования с ионами меди собрали осадок, образованный бактериями. В пробирке, отходящей к бутыли со сливом, был виден черный осадок, вероятно сульфид меди (рисунок 56). При культивировании с ионами меди каждые сутки собирали осадок, для дальнейшего изучения его элементного и минералогического состава.
После этого в бутыли с новой средой внесли медь в концентрации 200 мг/л. При этом концентрация сероводорода стала резко снижаться, а концентрация белка уменьшилась в 2 раза (снизилась с 58.3±5.30 мг/л до 24.6±3.19 мг/л). Культивирование в таком режиме проводили в течение 20 часов до окончания эксперимента. Концентрация белка при этом варьировала от 21.2±2.0 до 59.5±5.03, сероводорода отмечены незначительные количества (от 1.2±0.17 до 3.7±1.8). Число клеток снизилось вдвое с 45-бхЮ6 до 25.3х106 кл/мл (рисунок 55).
Анализ осадков, собранных при культивировании Desulfovibrio sp. А2 на среде с медью, показал, что в течение первых 5 суток размер частиц осадков варьировал от 50 до 100 мкм (рисунок 57), осадки, собранные после 8 суток культивирования содержали частицы размером от 100 до 350 мкм (рисунок 58). Во всех осадках присутствовали Си, S и О (таблица 28). Атомное соотношение меди и серы менялось в зависимости от суток культивирования и составляло 1:1.8 (1 сутки), 1:1.5 (2 сутки), 1:3.4 (3 сутки), 1:2 (4 сутки) и 1:1.5 (5 сутки). По соотношению меди к сере можно предположить присутствие сульфидов меди CuS и CuS2. По истечении вторых суток в осадке увеличивалось количество меди, на третьи сутки резко увеличилось количество серы, а затем стало постепенно спадать. По истечении 8 суток количество серы и меди сравнялось, как в осадке, так и в биопленке, образованной на стенках культурального сосуда. Атомное соотношение меди и серы в осадках, образованных на стенке и на дне колбы, составляло 1:1, что соответствует сульфиду меди ковеллиту (таблица 29).
Рентгенофазовый анализ позволил выявить наличие кристаллических сульфидов меди, образованных в процессе роста бактерий в биореакторе. В течение 5 суток культивирования в непрерывной культуре образовывались несколько кристаллических фаз: элементная сера, ковеллит (CuS), ярровит (CugSg (CU1.12S)), пирротин (Fe6Sy) и сульфат калия (КзЩБО г) (рисунок 59). По высоте и величине пиков можно сказать, что основными минералами были ковеллит и ярровит. Минерал сульфат калия происходят от микроэлементов и культуральной среды. В осадке, образованном штаммом Desulfovibrio sp. A2 в течение 8 суток, присутствовали только 3 минерала: ковеллит (CuS), ярровит (CugSg (Cui,i2S)) и элементная сера (рисунок 60). Видно, что основными пиками проявились ковеллит и ярровит.
