Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика пурпурных бактерий 10
1.1. Место пурпурных бактерий среди фототрофных микроорганизмов 10
1.2. Особенности строения и метаболизма пурпурных бактерий, 11
1.3. Экология пурпурных бактерий 17
Глава 2. Роль кислорода в жизни микроорганизмов 23
2.1. Механизмы детоксикации молекулярного кислорода 23
2.2. Фотооксидазная активность пурпурных бактерий 29
Глава 3. Экологическая значимость соединений теллура и селена 37
3.1. Теллурнт и его влияние на микроорганизмы 37
3.2. Влияние селенита на микроорганизмы 45
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Материалы и методы исследования 51
4.1. Объекты исследования 51
4.2. Культивирование бактерий 51
4.3. Методы измерения 53
Глава 5. Результаты и обсуждение 59
5,1. Влияние доноров электронов на рост пурпурных бактерий в анаэробных условиях на свету 59
5.1.1, Влияние малата на фототрофный рост пурпурных бактерий 59
5.1.2. Влияние сукцината и малоната нарост пурпурных бактерий 66
5.2. Влияние акцепторов электронов на фототрофный рост пурпурных бактерии 73
5.2.1. Влияние фумарата на рост пурпурных бактерий 73
5.2.2. Влияние теллурита на рост пурпурных бактерий 77
5.2.3. Влияние селенита натрия на рост пурпурных бактерий .82
5.3. Влияние теллурита на генерацию мембранного потенциала клеточных хроматофоров Rhodospirillum rubriun 86
5.4. Модельные пигментсодсржащие системы 91
5.5. Влияние бихромата калия и некоторых тяжелых металлов на рост пурпурных бактерий 98
5.5.1. Влияние бихромата калия на рост пурпурных бактерий 98
5,5.2, Влияние тяжелых металлов на фототрофных рост пурпурных актерий 102
5.5.3. Устойчивость пурпурных бактерий к некоторым соединениям тяжелых маталлов и металлоидов 111
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 114
ВЫВОДЫ 118
ЛИТЕРАТУРА 120
- Место пурпурных бактерий среди фототрофных микроорганизмов
- Механизмы детоксикации молекулярного кислорода
- Теллурнт и его влияние на микроорганизмы
Введение к работе
Актуальность темы.
Водные экосистемы, занимая центральное место в жизнеобеспечении человечества и функционировании биосферы, во многом определяют устойчивость и очищение се от загрязняющих веществ. Самоочищение воды есть совокупность природных процессов направленных на уменьшение содержания в ней загрязняющих веществ, которое, прежде всего, обусловлено, способностью микроорганизмов разлагать и обезвреживать широкий спектр природных и синтетических соединений.
Важным звеном в цепи питания многих водных систем являются фотосинтезирующне микроорганизмы, в частности пурпурные бактерии. Они обитают во многих водоемах и, благодаря особенностям метаболизма, способны расти как в анаэробных, микроаэрофильных, так и в аэробных зонах, а в качестве источника углерода и доноров электронов могут использовать не только неорганические, но и органические вещества.
Достаточно большое количество промышленных объектов в городах Урала привело к загрязнению воздуха и поверхностных вод. В связи с этим актуальна проблема переработки и утилизации промышленных отходов, среди которых много токсичных (Экологическое состояние ..., 2004). Одним из источников загрязнения водоемов, приводящих к ухудшению качества воды и нарушающих условия обитания в них гидробиоитов, являются сточные воды, содержащие разбавленные растворы тяжелых металлов (Квасников и др., 1993), а также токсичные соединения теллура и селена. Известно, что они могут оказывать в различных концентрациях токсическое действие как на клетки эукариот, так и на клетки прокариот.
Установлено, что микроорганизмы обладают способностью аккумулировать токсичные вещества в своих клетках и превращать их в нетоксичные соединения. Биологическая очистка позволяет снизить концентрации вредных веществ до норм предельно допустимых концентраций, а так же является экономически и экологически более
б эффективной, чем широко распространенные физико-химические методы (Дмитриенко и др., 2003).
Фототрофные прокариоты представляют особый интерес, поскольку, благодаря особенностям своей жизнедеятельности, занимают значительное место в природе по участию в круговороте веществ. При благоприятных условиях биомасса этих микроорганизмов, в частности пурпурных бактерий, достигает значительной величины.
В работах Мура и Каплана показано, что клетки пурпурных бактерий способны к утилизации теллурита и других редкоземельных металлов (Moore, Kaplan, 1992, 1994). Важность изучения пурпурных бактерий определяется ролью, которую они играют в природной среде, а также возможностью использования человеком их особенностей для создания более безвредных для окружающей среды технологий. Поэтому для повышения эффективности биотехнологических процессов необходимо проведение разносторонних исследований по физиологии фотосинтезирующих бактерий.
В связи с этим основной целью данной работы явилось изучение роли фотоокспдазной реакции в восстановлении оксианионов теллурита, селенита и других анионов клетками пурпурных бактерий.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
Выяснить влияние некоторых органических кислот на рост несерных пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas pahistris и серной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira shaposhnikovii в анаэробных условиях на свету.
Изучить воздействие ионов теллурита и селенита на рост серных и несерных пурпурных бактерий.
Изучить роль фотоокспдазной реакции в восстановлении теллурита на модельных пигмент-содержащнх системах.
4. Изучить влияние бихромата и ряда тяжелых металлов на фототрофиый рост пурпурных бактерии и выяснить их
устойчивость к данным соединениям.
Научна» новизна и і фактическое значение.
Установлено, что восстановление теллурита и оксианионов других соединений протекает по механизму фотооксидазной реакции при участии электрон-транспортной цепи.
Впервые показано, что восстановление теллурита и селенита протекает в модельной системе содержащей хлорофилл а, встроенный в мицеллы детергента тритона Х-100 и восстановленный аскорбатом. Исследования на пигмент-содержащих системах подтверждают вывод о том, что восстановление теллурита и селенита протекает при участии фотооксидазной реакции.
Процесс восстановления теллурита и селенита до их элементного состояния можно считать экологически важным, поскольку восстановление их сопровождается превращением данных соединений до менее токсичных форм. В этой связи данный процесс может быть использован для очистки водоемов от токсичных форм теллура и селена.
Полученные результаты позволили нам подтвердить, что по механизму фотооксидазной реакции могут восстанавливаться, а также обезвреживаться и оксианионы других элементов, имеющих редокс-потенциал близкий к кислороду.
Основные положении, выносимые на защиту:
1. Клетки пурпурных бактерий родов Rhodospirillum, Rhodobactcr, Rhodopseudomonas и Ectodiiorhodospira, благодаря наличию фотооксидазной активности, наряду с системой дыхания обладают дополнительным механизмом резистентности к кислороду, а также к окспанионам теллура и
s селена, имеющих редокс-потенциал +827 мВ и +875 мВ соответственно, близкий к кислороду (+820 мВ).
2. Процессы детокснкации/восстановлсния теллурита и селенита по механизму фотооксидазнои реакции могут протекать как в нативных клетках, так и в модельных системах, содержащих хлорофилл о, встроенный в мицеллы детергента Тритона Х-100 в водном растворе аскорбата. В клетках пурпурных бактерий восстановление теллурита происходит, вероятно, по следующей схеме:
аскорбат — бактериохлорофилл а —* ТеОз "—* Те
I Sc032--> Se
Организация исследования.
Диссертационная работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов биологического факультета Пермского государственного университета. Диссертационная работа является продолжением исследований, которые проводились по изучению роли фотооксидазнои активности пурпурных бактерий.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю профессору В.Г. Ремешшкову, а также преподавателям кафедры физиологии растений и микроорганизмов за ценные указания и замечания при выполнении диссертационной работы.
Апробация работы и публикации.
В 2005г. материалы работы докладывались на расширенном заседании кафедры физиологии растений и микроорганизмов биологического факультета Пермского государственного университета.
Материалы диссертации были представлены: на X Всероссийской научно-практической конференции «Экология: проблемы и пути решения» г. Пермь (25-27 апреля, 2002); на 2ой Международной научно-практической
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно-технический прогресс», г.Пермь (14-16 ноября, 2003); на XI Всероссийской научно-практической конференции «Экология: проблемы и пути решения» г.Пермь (22-24 апреля, 2004); на 8-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущшю (17-21 мая, 2004); на 9-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущшю (18-22 апреля, 2005).
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 135 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описания объектов и методов исследований и обсуждение результатов исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 152 наименования. Работа иллюстрирована при помощи 4 таблиц и 30 рисунков.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Место пурпурных бактерий среди фототрофных микроорганизмов
Автотрофные прокариоты представлены большим числом микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам. Многие из них играют важную роль в ряде глобальных циклов, происходящих в биосфере (Кондратьева и др., 1996).
В зависимости от характера фотосинтеза, состава пигментов и других особенностей фототрофные прокариоты подразделяются на ряд групп. Согласно классификации Берджи фототрофные бактерии находятся в десятой группе первой основной категории бактерий (Определитель бактерий Берджи, 1997). Цианобактерии и прохлорофиты осуществляют оксигенный тип фотосинтеза, который протекает с выделением молекулярного кислорода. Они объединены в класс Oxyphotobactcria. Особое место среди фототрофов занимают галобактерии, относящиеся к классу Archaeobacteria. Это единственные микроорганизмы, у которых фотосинтез происходит при участии пигментов иной природы, чем хлорофиллы. Кроме того, они имеют ряд других особенностей (Кондратьева и др., 1989).
Пурпурные и зеленые бактерии осуществляют аноксигенный тип фотосинтеза (протекающий без выделения молекулярного кислорода), включены в класс Anoxyphotobacteria в виде порядков Rhodospirillales и Chlorobiales. Однако в новом определителе Берджи все пурпурные бактерии включены в новый класс «Proieobactcria», который также содержит их хемотрофных «родственников». Серные пурпурные бактерии входят в Филлу «Gammaproteobacteria» в составе двух семейств Eciothiorhodospiraceae и Chromatiaceae. Пурпурные несерные бактерии подразделяются на две Филлы: «/ilphaprotcobactcria» и «Betaproteobacteria». Зеленые серобактерии входят в состав Филлы «Chlorobt», класс Chlorobia, порядок Chlorobiales, семейство Chlorobiaceae (Горленко, 2004).
Механизмы детоксикации молекулярного кислорода
Кислород является широко распространенным элементом в природе, доля его в современной атмосфере составляет 21%. Кроме того, кислород является неотъемлемой частью молекул воды, органических и неорганических соединений, находясь в так называемом связанном состоянии. Образование и поддержание современного уровня кислорода зависит от жизнедеятельности растительных организмов, однако, в процессе накопления молекулярного кислорода ведущая роль все же принадлежала микроорганизмам.
Молекулярный кислород выступил мощным эволюционным фактором на уровне как прокариотическоП, так и эукарпотической организации, так как по мере накопления он становится постоянным компонентом внешней среды. Это определило два возможных варианта взаимодействия прокариот с молекулярным кислородом. Одни из существовавших анаэробных форм «ушли» в места обитания, где кислород практически отсутствует, и тем самым сохранили «облик бескислородной эпохи». Другие были вынуждены пойти по пути приспособления к «кислородным» условиям. Это означает, что они формировали новые метаболические реакции, служащие в первую очередь для нейтрализации отрицательного действия молекулярного кислорода (Гусев, Минеева, 1992).
Наиболее простой ответной реакцией на кислород, у ныне существующих организмов является вытеснение 02 из среды культивирования (внешняя защита) газообразными продуктами. Такой способностью обладают многие анаэробные бактерии, которые осуществляют процесс брожения и получают энергию в результате субстратного фосфорилпроваїїпя. В данном примере отсутствует элемент взаимодействия клетки с кислородом. Всю же совокупность реакций взаимодействия клетки с кислородом можно свести к двум типам: в первом случае происходит прямое включение Ог в биомолекулы клетки, а во втором он выступает в качестве конечного акцептора электронов.
К первой группе реакций, вероятно, следует отнести биосинтез каротиноидов. Каротнноиды обнаружены как у фототрофных, так и хемотрофных микроорганизмов и обеспечивают устойчивость клеток к солнечной радиации. Наряду с этой функцией, биосинтез каротиноидов мог выполнять и функцию кислородной защиты в результате образования кислородсодержащих каротиноидов. Установлено, что состав каротиноидов фототрофных бактерий существенным образом зависит от содержания в среде кислорода. При аэрации среды в клетках пурпурной бактерии R. sphaeroides синтезируются каротшюнды, содержащие кето группы, а в анаэробных условиях они синтезируют сфероиден (Кондратьева и др., 1989). Целью таких изменений может служить создание анаэробных условий, необходимых для протекания фотосинтеза аноксигенного типа, который характерен для пурпурных и зеленых бактерий. Из этого следует, что защитная функция каротиноидов, проявляющаяся в детоксикащш кислорода в результате его встраивания в структуру их молекул, является общим признаком микроорганизмов, а не только фотосинтетиков, у которых каротиноиды выполняют еще одну функцию, принимая участие в передаче энергии электронного возбуждения на фотосинтетические реакционные
Ко второй группе механизмов кислородной защиты, следует отнести окислительные реакции, в которых кислород выполняет роль акцептора электронов. Различают три механизма:
1. «Флавшювое дыхание», т.е. реакции прямого переноса электронов на кислород при участии флавопротендов, что приводит к восстановлению кислорода. В зависимости от количества принятых электронов при восстановлении кислорода образуется анион супероксидного радикала, перекись водорода и вода. Схематично этот механизм может быть представлен следующей схемой:
Данный тип реакций идет без запасания энергии в виде АТФ.
2. Биолюминесценция - свечение живых организмов, обусловленное ферментативным окислением особых веществ - люциферинов, под действием фермента люциферазы. Она встречается не только у бактерий, но и у грибов, растений и животных. У каждой группы организмов биолюминесценция имеет свои особенности, но во всех случаях идет прямое и энергичное окисление субстрата с использованием молекулярного кислорода, сопровождающееся свечением.
Исследования, проведенные на Phoiobacterium belozerskii, показали, что увеличение концентрации кислорода в среде стимулирует свечение и уменьшает скорость роста бактериальной культуры. Это объясняется тем, что свечение, требующее больших энергетических затрат, тесно связано с системой дыхания и находится с ней в конкуренции за окисляемый субстрат. Поскольку в биолюминесценции принимает участие флавнновын участок дыхательной цепи, то отток электронов с флавопротеида на кислород снижает эффективность функционирования системы дыхания, что и проявляется в уменьшении скорости роста данных бактерий из-за нехватки энергии (Чумакова, Гительзон, 1975). Взаимодействие системы дыхания и биолюминесценции можно представить следующим образом (Чумакова, Гительзон, 1975).
Теллурнт и его влияние на микроорганизмы
Высокие концентрации соединений теллура обнаруживаются в почве и воде около мест сброса сточных вод от промышленных предприятии (Yurkov et al., 1996). Теллур в основном используется в полупроводниковой технике, в приборостроении, в химической и металлургической промышленности.
Благодаря тому, что теллур легко плавится, из него получают полупроводниковые пленки, необходимые и микроэлектронике (Баешов и др., 1989).
Вследствие высокой реакционной способности оксианионы теллура представляют опасность для живых организмов, присутствуя в среде их обитания даже в малых концентрациях. Металлический привкус воды ощущается при содержании теллура 0.04 мг/л. Теллурит и тетрагидроортотеллурат натрия в концентрации 0.5 мг/л (в пересчете нателлур) из-за бактерицидного действия на микрофлору задерживают процессы самоочищения водоемов. В концентрации 0.1 мг/л теллурит не оказывает вредного действия па санитарный режим водоемов. Среднее содержание теллурита в водах бассейнов рек Москвы и Вазузы составляет 1,1 мкг/л, в подземных подах - 0.7 мкг/л (Вредные химические вещества..., 1989).
Теллурит (ТеОз ) является токсичным для многих организмов (Taylor et al., 1988, 1999), как прокариот, так и эукариот, и используется в ряде селективных бактериологических сред и дифференциальных тестов (Smith, 1974). Предполагается, что токсичность теллурита является следствием таких его свойств как сильная окислительная способность (Lloyd-Jones et al., 1994, Turner etal., 1995).
Механизм токсичности теллурита не ясен, но он приписывается взаимодействию с SH-группами, особенно с SH-группами NAD-дегидрогеназ. Если микроорганизмы способны расти в присутствии теллурита, то теллурит восстанавливается до черного элементарного теллура (Smith, 1974). При этом черные отложения локализуются внутри клетки и часто ассоциированы с внутренней мембраной бактерий (Taylor et al., 1988, 1999). Несколько кристаллов теллура иногда появляются в цитоплазме каждого штамма Escherichia coli, однако, была очевидна тенденция локализации кристаллов около цитоплазматической мембраны (Lloyd-Jones etal, 1994).
Откладываясь в клетках, теллурит окрашивает культуры бактерий в черный цвет. Огложения элементного теллура, вероятно, означают детокспкацию теллурита (Smith, 1974). Растворимые в жидкостях организма теллуриты и ортотеллураты обладают в десятки раз более выраженными токсическими свойствами и повреждающим эффектом, чем элементный теллур и оксид теллура (IV) (Вредные химические вещества ,.,, 1989). Так же было установлено, что теллурит натрия (Na2TeOj) приводит к большему пнгибированшо роста Oyptococcus albklus, чем теллурат натрия (NaiTeO. ), хотя оба соединения в клетках восстанавливались до элементарного теллура (Brown, Smith, 1978). На организм млекопитающих и человека теллур оказывает действие, во многом сходное с эффектами мышьяка и селена. Теллур является преимущественно тиоловым ядом, вызывает острые и хронические отравления с поражением нервной системы, крови, желудочно-кишечного тракта, почек и органов дыхания, обмена веществ. Высокие дозы теллура, принятые внутрь, приводят к интенсивному образованию липофусцина в мозге, которое связывают с эффектом перекисного окисления липидов. Теллур и его соединения оказывают повреждающее действие на течение окислительных процессов в митохондриях млекопитающих: специфическое ингибирование окисления НАД-зависимых субстратов в интактных митохондриях печени и почек крыс — пирувата, а-кетоглутарата, глутамата, но не сукцината, а-глицерофосфата, аскорбата (Вредные химические вещества ..., 1989).
Количество восстановленного теллурита зависит от вида микроорганизма и от источника углерода, а высокий уровень устойчивости к тсллуриту (HLR) коррелирует с его восстановлением до элементного теллура. Однако, виды Roscococcus tluosalfatophihis и Erythromicrob mm ezovicum, выращенные на минеральной среде с ацетатом, также демонстрируют повышенную устойчивость к ионам теллурита ТеОз " (МИК К2ТеОз до 1200 мкт мл"), но теряют способность восстанавливать теллурпт. Эти результаты подразумевают, что восстановление теллурита не является необходимым для приобретения устойчивости к тсллуриту (Yurkov ct al., 1996).
Когда дрожжи Saccharomyces cercvisiae и Rhodotorula inucilaginosa растут в присутствии теллурита калия (К2ТеОД продукт восстановления откладывается главным образом на специальных частях эндоплазматической сети, формируя область около 500 им в диаметре. Необходимо заметить, что в экспериментах с дрожжами Saccharomyces pombe теллурит в концентрации 10"3 М увеличивал время генерации и уменьшал жизнеспособность клеток, а длину клеток увеличивал в три раза (Smith, 1974). Теллурит калия (K TeOj) является токсичным для большинства грамотри нательных бактерии в концентрации около 1 мкг/ліл. Низкий уровень устойчивости к нонам теллурита (Те032 ) установлен и для некоторых грамположительных бактерии, таких как Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus (Moore, Kaplan, 1992, Yurkov et al., 1996).
