Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы.
Биосенсоры – современное состояние, тенденции развития и использование в мониторинге загрязнения.водных экосистем
Использование биосенсоров для детекции загрязнения природных вод
Тенденции развития биосенсорных технологий
Биосенсоры на основе светящихся бактерий
Характеристика люцифераз
Основы методологии детекции токсических веществ при помощи бактериальных lux-сенсоров Эффект-специфичные lux-штаммы (широкоспецифичные)
Вещество-специфичные штаммы (узкоспецифичные)
Общая характеристика родников г. Ростова-на-Дону Характеристика загрязнения Нижнего Дона
Материалы и методы исследований
Материалы исследований
Бактериальные штаммы
Питательные среды
Химические вещества
Образцы воды, донных отложений, атмосферного воздуха, атмосферных осадков, почв, тканей животных и растений
Методы исследований
Выделение природных биолюминесцентных бактерий
Идентификация выделенных штаммов биолюминесцентных бактерий
Идентификация биолюминесцентных штаммов до рода
Идентификация биолюминесцентных бактерий до вида
Измерение биолюминесцентного «ответа» lux-биосенсоров на действие индукторов - стандартных мутагенов и токсикантов. Измерение биолюминесцентного «ответа» суспензии lux-биосенсоров различной плотности на действие индукторов - стандартных мутагенов и токсикантов Измерение биолюминесцентного «ответа» lux-биосенсоров на действие природных проб водных экосистем Определение индекса токсичности Определение индекса усиления люминесценции биосенсоров с индуцируемыми промоторами Приготовление экстрактов проб донных отложений, воздушных фильтров, тканей животных и растений Определение микробиологических показателей Определение ПАУ Определение ПХБ Определение свинца, кадмия, цинка, меди, ванадия, хрома, никеля, мышьяка и бария Определение ртути .
Определение нефтепродуктов .
Статистическая обработка и достоверность результатов
Выделение штаммов биолюминесцентных бактерий из воды азовского и черного морей, их идентификация и определение чувствительности к действию токсических факторов
Побор питательных сред для светящихся бактерий и их выделение из морской воды Идентификация выделенных штаммов по диагностическим свойствам
Определение интенсивности биолюминесценции выделенных светящихся бактерий
Морфологические и биохимические свойства выделенных биолюминесцентных бактерий Оценка чувствительности выделенных штаммов светящихся биолюминесцентных бактерий к действию токсических факторов химического происхождения .
Оценка чувствительности биолюминесцентных штаммов, выделенных в 2006 г. из воды зовского и Черного морей
Оценка чувствительности биолюминесцентных штаммов, выделенных в 2009 г. из воды Черного моря
Оценка токсичности донных отложений Азовского моря с помощью аборигенных биолюминесцентных бактерий
Vibrio aquamarinus sp. nov., люминесцентная бактерия, выделенная из воды черного моря принципы формирования батареи бактериальных lux-биосенсоров, определение чувствительности биосенсорных штаммов к стандартным контрольным веществам, подбор оптимальной плотности суспензии биолюминесцентных штаммов
Принципы формирования батареи бактериальных lux-биосенсоров
Определение чувствительности биосенсорных штаммов к стандартным контрольным веществам, подбор оптимальной плотности суспензии биолюминесцентных штаммов CLASS Экотоксикологическая оценка качества воды родников г. ростова-на-дону при помощи биолюминесцентных сенсоров CLASS
Оценка экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров, 2009 г
Оценка экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров, 2010 г
Оценка экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров, октябрь 2011 г
Исследование содержания приоритетных токсикантов в воде родников г. Ростова-на-Дону, октябрь 2011 г
Исследование санитарно-микробиологических показателей в воде родников г. Ростова-на-Дону, октябрь–ноябрь 2011 г
Оценка экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров, ноябрь 2011 г
Оценка экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров, 2012 г
Исследование санитарно-микробиологических показателей в воде родников г. Ростова-на-Дону, март 2012 г
Итоги тестирования экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров в течение 2009-2012 гг
Сопоставление данных генетико-токсикологического анализа с содержанием различных ксенобиотиков в воде родников г. Ростова-на-Дону при помощи корреляционного анализа
Оценка экотоксикологических параметров донных отложений нижнего дона при помощи биолюминесцентных сенсоров (2001–2007, 2011 ГГ.)
Оценка генотоксичности донных отложений Нижнего Дона, 2001-2007, 2011 гг
Оценка экотоксикологических параметров донных отложений Нижнего Дона, 2011 г
Определение содержания приоритетных токсикантов в донных отложениях Нижнего Дона в октябре 2011 г
Сопоставление данных генетико-токсикологического анализа с содержанием различных ксенобиотиков в донных отложениях Нижнего Дона
Перспективы использования бактериальных lux-биосенсоров для оценки токсичности различных компонентов окружающей среды – почвы, воздуха, тканей животных и растений
Исследование динамики загрязнения воздуха г. Ростова-на-Дону генотоксичными веществами c использованием биолюминесцентных сенсоров (2001-2010 гг.) Оценка качества атмосферных осадков г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров (2010-2011 гг.) Исследование токсичности дождевой воды г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров (2010-2011 гг.)
Детекция токсичных веществ в пробах снежных осадков г. Ростова-на-Дону (2010-2011 гг.) Детекция токсичных веществ в представителях бриофлоры, лихенофлоры и микофлоры, отобранных в г. Ростове-на-Дону в 2009-2010 гг
Оценка токсичности почв городов Ростовской области при помощи бактериальных lux-бисенсоров (2010 г.)
Детекция токсичных веществ с помощью lux-биосенсоров в экстрактах печени скворцов обыкновенных (Sturnus vulgaris), отобранных в пос. Волочаевский Орловского района Ростовской области в апреле 2010 г
Заключение.
Анализ принципов и перспектив применения батареи на основе бактериальных lux-сенсоров в сочетании с химическими аналитическими методами для оценки токсичности водных экосистем
Выводы
Список использованной
Литературы .
- Тенденции развития биосенсорных технологий
- Образцы воды, донных отложений, атмосферного воздуха, атмосферных осадков, почв, тканей животных и растений
- Определение интенсивности биолюминесценции выделенных светящихся бактерий
- Оценка экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров, 2010 г
Введение к работе
Актуальность исследования
Интерес к мониторингу токсичности воды в связи с масштабным загрязнением гидросферы в последние годы значительно возрос. Сведения по аккумуляции токсических веществ в водных экосистемах имеют определяющее значение для прогноза их развития и состояния биоресурсного потенциала. Также эта информация немаловажна в плане оценки появления негативных последствий для человека. В связи с этим систематическому контролю качества окружающей среды необходимо уделять особое внимание.
Традиционным подходом при проведении экологического мониторинга водной среды является использование методов химического анализа для оценки количественного содержания токсических веществ. Однако химический анализ не учитывает их интегрального токсикологического эффекта на биологические объекты. Для решения проблемы необходимо применение биологических методов анализа. Сочетание химических аналитических методов совместно с биотестированием в единую комплексную платформу мониторинга позволит в значительной степени повысить эффективность оценки качества водных экосистем.
Одним из наиболее перспективных методов, используемых при проведении мониторинга окружающей среды, является анализ с использованием биосенсоров (Daniel et al., 2008; Palchetti et al., 2008), в том числе на основе биолюминесцентных бактерий (Woutersen et al., 2011; Elad, Belkin, 2013; Zhang et al., 2013). Биолюминесцентные сенсоры, в которых в качестве репортеров используются гены бактериальных люцифераз, могут занять ключевую роль в биотестировании токсичности окружающей среды. С этой целью необходимо разработать концепцию использования биолюминесцентных бактерий в экотоксикологическом мониторинге водных экосистем. Должны быть проанализированы основные принципы формирования батарей lux-биосенсоров; учтены преимущества и недостатки биолюминесцентного тестирования; рассмотрены перспективы, включающие способы повышения его эффективности и технологичности.
Внедрение в практику экологического мониторинга невозможно без анализа результатов, полученных при использовании lux-биосенсоров для тестирования природных проб. Учитывая факт, что первоочередная проблема, которая возникает в результате антропогенного прессинга, - проблема качества воды, особый интерес представляет контроль с использованием биосенсоров водных объектов. К наиболее значительным водным объектам по объему и хозяйственной важности в Ростовской области относится р. Дон. Вода р. Дон – основной источник питьевой воды населения Ростовской области. Кроме донской воды, значительной ценностью обладает вода ростовских родников.
Практическое использование тест-системы на основе батареи lux-биосенсоров даст возможность проводить комплексную экспресс-оценку токсичности компонентов водных экосистем, использовать полученные данные для идентификации вида и источника загрязнения, способствуя тем самым эффективности природоохранных мероприятий.
Цель работы: Разработать концепцию использования природных и генно-инженерных биосенсоров на основе светящихся бактерий в мониторинге токсичности водных экосистем и оценить экотоксикологические характеристики водоемов Азово-Донского бассейна с помощью сформированной батареи биолюминесцентных тестов.
Задачи исследования:
-
Разработать концепцию использования биолюминесцентных бактерий в мониторинге токсичности водных экосистем на основе анализа принципов и перспектив применения бактериальных lux-сенсоров в сочетании с химическими аналитическими методами для оценки токсичности водных экосистем.
-
Сформировать батарею биолюминесцентных тестов и оптимизировать протоколы исследования с целью повышения чувствительности к токсикантам различной природы.
-
Выделить, идентифицировать биолюминесцентные бактерии из воды Черного и Азовского морей с целью отбора штаммов, наиболее чувствительных к действию различных токсикантов.
-
Определить таксономическое положение люминесцентного штамма VNB-15 на основе полифазного таксономического подхода, включающего морфологические, культуральные, физиологические, биохимические свойства, хемотаксономическую характеристику и филогенетический анализ.
-
Оценить токсичность воды родников г. Ростова-на-Дону с помощью репрезентативного набора биотестов. Сопоставить показатели токсичности, полученные с помощью lux-биосенсоров, и результаты химического анализа приоритетных поллютантов в родниках г. Ростова-на-Дону.
-
Оценить токсичность донных отложений участков Нижнего Дона с помощью репрезентативного набора биотестов. Сопоставить показатели токсичности, полученные с помощью lux-биосенсоров, и результаты химического анализа приоритетных поллютантов в донных отложениях Нижнего Дона.
Научная новизна
Разработана научная концепция использования биосенсоров на основе биолюминесцентных бактерий в мониторинге токсичности водных экосистем.
Впервые апробирована на приоритетных токсикантах и природных образцах воды родников г. Ростова-на-Дону и донных отложений Нижнего Дона батарея экспресс-тестов на основе биолюминесцентных бактерий, со временем ответа, не превышающим 2 часа, позволяющая определять интегральную токсичность, генотоксичность, прооксидантную активность, а также оценивать присутствие ртути и мышьяка, и веществ, вызывающих повреждение белков и мембран.
Выделен новый вид биолюминесцентных бактерий рода Vibrio из воды Черного моря. Штамму присвоено название Vibrio aquamarinus sp. nov. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (Vibrio aquamarinus VKPM B-11245) и в Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур (Vibrio aquamarinus DSM 26054).
Три штамма биолюминесцентных бактерий, выделенных из воды Черного моря, предложены в качестве новых тест-культур для тестирования токсичности компонентов окружающей среды (Сазыкина, Цыбульский, 2008; 2009; Цыбульский, Сазыкина, 2010; Сазыкин и др., 2013-в).
Впервые получены результаты по токсичности, генотоксичности, проооксидантной активности, присутствию ртути и мышьяка и веществ, повреждающих белки и мембраны, в воде 23 родников г. Ростова-на-Дону в период с 2009 по 2012 гг. (Сазыкина и др., 2010-а, в; 2011-а, б; 2013-а).
Новизной отличаются исследования генотоксичности экстрактов донных отложений Нижнего Дона в разные сезоны 2003–2007 гг. и 2011 г. (Сазыкина и др., 2012-а). Впервые с помощью батареи биолюминесцентных тестов получены результаты по токсичности, проооксидантной активности, присутствию ртути и мышьяка, а также веществ, вызывающих повреждение белков и мембран, в донных отложениях Нижнего Дона в 2011 г. (Сазыкина и др., 2009-в; Сазыкина и др., 2010-в; 2011-б).
Впервые в воде родников г. Ростова-на Дону (2011 г.) проведено определение содержания ряда приоритетных токсикантов: ртути, полиароматических углеводородов (ПАУ), индивидуальных конгенеров полихлорированных бифенилов (ПХБ). Показано наличие в пробах канцерогенных ПАУ.
Впервые проведено сопоставление показателей токсичности донных отложений р. Дон, полученных при помощи батареи биолюминесцентных тестов, с данными химического анализа по содержанию группы приоритетных токсикантов.
Впервые проведено сопоставление показателей токсичности и генотоксичности воды родников г. Ростова-на-Дону, полученных при помощи батареи биолюминесцентных тестов, с данными химического анализа по содержанию в воде группы приоритетных токсикантов.
Для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды разработаны две новые питательные среды, состав которых запатентован (Сазыкина и др., 2009-а, б).
Теоретическая значимость работы
Разработана научная концепция использования бактериальных lux-биосенсоров в мониторинге токсичности водных экосистем, позволяющая повысить его эффективность.
Исследование выделенного из воды Черного моря штамма биолюминесцентных бактерий Vibrio aquamarinus VKPM B-11245 (Vibrio aquamarinus DSM 26054), относящегося к новому виду в роде Vibrio, позволило расширить знания о разнообразии биолюминесцентных бактерий рода Vibrio. Штамм может быть использован в фундаментальных исследованиях.
Результаты мониторинга токсичности воды родников г. Ростова-на-Дону с 2009 по 2012 гг. свидетельствуют о системном характере загрязнения этих водоемов. Особую опасность несет загрязнение воды исследованных родников г. Ростова-на-Дону генотоксикантами. Выявленные факты являются основанием для разработки комплексной программы улучшения качества воды городских водоемов г. Ростова-на-Дону, неотъемлемой частью которой должно быть внедрение в практику системы биомониторинга токсичности. Определение количественных параметров загрязнения токсичными веществами родниковой воды позволит проводить направленный поиск источников загрязнения – предприятий, бытовых стоков, мусорных свалок, элементов городского хозяйства, которые несут основную ответственность за рост токсикологического прессинга городской среды.
Результаты мониторинга донных отложений Нижнего Дона в течение 2003–2007 гг. и в 2011 г. позволили зарегистрировать периоды времени, на которые пришелся максимум загрязнения генотоксичными веществами. Выявлен хронический характер загрязнения генотоксикантами ряда исследованных районов.
Разработан проект методических рекомендаций «Оценка токсичности компонентов экосистем на основе использования батареи бактериальных lux-биосенсоров».
Материалы работы используются в лекциях на кафедре генетики Южного федерального университета в спецкурсах: «Экологическая генетика», «Экотоксикология», «Мутагены окружающей среды».
В результате проведенных исследований зарегистрированы 6 патентов на изобретения и 4 базы данных, которые используются при проведении экотоксикологического мониторинга окружающей среды.
Практическая значимость работы
Сформирована батарея экспресс-тестов на основе биолюминесцентных бактерий, со временем ответа, не превышающим 2 часа, позволяющая определять интегральную токсичность, генотоксичность, прооксидантную активность проб воды, а также оценивать присутствие в них ртути, мышьяка и веществ, вызывающих повреждение белков и мембран. Данный набор биолюминесцентных тест-систем может быть применен для решения широкого спектра экотоксикологических задач. В настоящее время батарея биолюминесцентных тестов используется для мониторинга токсичности воды, донных отложений и гидробионтов Азово-Донского бассейна, почвы, животных, растений, воздуха и атмосферных осадков Ростовской области, сточных вод г. Ростова-на-Дону и г. Мюнхена, а также для скрининга биологической активности природных и синтетических соединений.
Три выделенных из морской воды штамма биолюминесцентных бактерий (в частности, штамм Vibrio aquamarinus VKPM B-11245) обладают высокой чувствительностью к действию приоритетных токсикантов, что дает возможность их непосредственного применения в биотестировании токсичности водных экосистем, а также использования lux-оперонов данных микроорганизмов при дальнейшем конструировании бактериальных люминесцентных сенсоров.
Разработан состав двух новых питательных сред, использование которых позволяет выделить максимальное количество биолюминесцентных бактерий из морской воды.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Использование батареи бактериальных lux-сенсоров перспективно для проведения комплексного экотоксикологического скрининга и позволяет отобрать для детального анализа другими методами пробы, загрязненные токсичными веществами. Исключение «чистых» проб из перечня анализируемых повышает эффективность проведения исследования.
-
Сформирован комплекс экспресс-тестов на основе биолюминесцентных бактерий, со временем ответа, не превышающим 2 часа, позволяющий определять интегральную токсичность, генотоксичность, прооксидантную активность в пробах водных экосистем, а также оценивать присутствие в них ртути, мышьяка и веществ, вызывающих повреждение белков и мембран. Оптимальная батарея биолюминесцентных тестов позволяет оценить спектр токсического действия загрязняющих веществ при проведении экологического мониторинга водных экосистем.
-
Три штамма биолюминесцентных бактерий, выделенных из воды Черного моря, обладают высокой чувствительностью к действию различных токсикантов и перспективны для исследования токсичности проб окружающей среды.
-
Биолюминесцентный штамм VNB-15, выделенный из воды Черного моря, отнесен к новому виду рода Vibrio на основании результатов полифазного таксономического подхода, включающего морфологические, культуральные, физиологические, биохимические свойства, хемотаксономическую характеристику и филогенетический анализ.
-
Загрязнение воды родников г. Ростова-на-Дону в 2009–2012 гг. токсичными веществами, в том числе способными повреждать генетический аппарат и вызывать прооксидантные эффекты, носит масштабный характер. Корреляционный анализ результатов, полученных с помощью биолюминесцентных сенсоров и показателей химического анализа, выявил участие полиароматических углеводородов в развитии прооксидантного эффекта и генотоксичности воды родников г. Ростова-на-Дону.
-
Для исследованных участков Нижнего Дона в 2003–2007 и 2011 гг. характерно стабильное загрязнение генотоксическими веществами. Корреляционный анализ результатов, полученных в 2011 г. с помощью биолюминесцентных сенсоров и показателей химического анализа, выявил, что источниками генотоксичности донных отложений Нижнего Дона служат нефтепродукты, отдельные ПАУ (фенантрен, флуорантен, пирен, хризен, бенз(k)флуорантен, бенз(a)пирен), ванадий, никель и ртуть.
Апробация работы. Результаты диссертации доложены на второй Международной научной конференции «Биотехнология – охране окружающей среды» (МГУ, 2004); III-й научно-практической конференции «Экологические проблемы. Взгляд в будущее» (4-7 сентября 2006 г., СОЛ «Лиманчик»); конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ РОССИИ» «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (г. Краснодар, 2006, 2007); Международной конференции «Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов юга России» (3-5 октября 2007 г., г. Астрахань); Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной медицины к превентивной и интегративной медицине» (Судак – Крым, Украина, 19–30 сентября 2008 г.); Международной научной конференции «Современные основы формирования сырьевых ресурсов Азово-Черноморского бассейна в условиях изменения климата и антропогенного воздействия» (15–18 декабря 2008 г., г. Ростов-на-Дону); 4-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (г. Саратов, 2009); III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», (г. Ростов-на-Дону, 1–4 октября 2009 г.); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (26-30 октября 2009 г., Пущино-Тула); Международной конференции «Антропогенная трансформация природной среды» (18–21 октября 2010 г., г. Пермь); 4-й Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (г. Томск, 22 февраля–4 марта, 2011); 5-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (г. Саратов, 12–14 апреля 2011 г.); Семнадцатой Всероссийской научной конференции студентов-физиков и молодых ученых (25 марта–1 апреля 2011 г., г. Екатеринбург); IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», г. Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г.; Международной конференции «Биология – наука XXI века» (г. Москва, 24 мая 2012 г.); I Международном биологическом конгрессе Кыргызстана (24–26 сентября 2012 г., г. Бишкек), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.) и Ученых Советах НИИ биологии ЮФУ.
Конкурсная поддержка работы. Автор как исполнитель участвовала в работе по грантам, поддержанным РФФИ (№ 06-04-96803 «Разработка и апробация тест-системы оценки токсичности компонентов экосистем морских водоемов на основе биолюминесцентных аборигенных бактерий», № 08-04-99108-р_офи «Разработка и апробация тест-системы оценки токсичности компонентов экосистем морских водоемов на основе флуориметрии аборигенных микроводорослей»), по гранту Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-2449.2014.4). В качестве руководителя автор принимала участие в работе по грантам, поддержанным Министерством образования и науки РФ в рамках АВЦП (№ 2.1.1/5028 «Мониторинг загрязнения окружающей среды при помощи бактериальных lux-биосенсоров»); в рамках ФЦП (№ 14.A18.21.0851 «Исследование экотоксикологических параметров и бактериального загрязнения сточных вод г. Ростова-на-Дону и г. Мюнхена»); по проекту 4.5835.2011 «Исследование механизмов действия негативных антропогенных и экстремальных факторов среды с помощью клеточных биосенсоров»; по проекту, выполняемому в рамках проектной части внутреннего гранта ЮФУ № 213.01.-07.2014/12ПЧВГ «Мониторинг и изучение влияния поллютантов, провоцирующих возникновение и передачу бактериальных детерминант резистентности, в биотопах Азово-Черноморского бассейна, подверженных антропогенному прессингу».
Личный вклад автора. Основу диссертации составляют результаты, полученные автором в 2003–2012 гг. Автор принимала личное участие на всех этапах работы, а именно: формулировка проблемы, постановка целей и задач, планирование и проведение экспериментов. По результатам исследований автором или научным коллективом с участием автора опубликованы научные работы, где проанализированы и определены основные результаты диссертации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 102 работы (43,2 п. л.), из которых – 30 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ (среди них 10 - в базе данных «Scopus», 9 - в базе данных «Web of Science»), 2 монографии, 1 глава в коллективной монографии, 6 патентов на изобретение, 4 базы данных.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 358 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 134 источника отечественных и 318 зарубежных авторов.
Автор выражает глубокую признательность за помощь в работе сотрудникам лаборатории промышленных микроорганизмов НИИ биологии ЮФУ, к.б.н., с.н.с. НИИ биологии ЮФУ Сазыкину И.С., д.б.н., в.н.с. ФГУП «ГосНИИГенетика» Манухову И.В., к.б.н., зав. лабораторией ФГУП «АзНИИРХ» Цыбульскому И.Е., специалистам ФГУП «АзНИИРХ», специалистам РГУНиГ имени И.М. Губкина. Особую благодарность за научные консультации и неоценимую моральную поддержку автор выражает д.б.н., проф. ФГУП «АзНИИРХ» Корниенко Г.Г.
Тенденции развития биосенсорных технологий
В качестве альтернативы штаммам на основе E. coli Elasri and Miller (1998) разработали штамм RM4440 на основе Pseudomonas aeruginosa. Штамм Pseudomonas aeruginosa был выбран как естественный обитатель воды и почв. Таким образом, он должен был быть более надежным и мобильным для on-line мониторинга воды по сравнению с E. coli. Штамм RM4440 с recА и luxCDABE генами подвергали воздействию ультрафиолетового излучения. О пределе обнаружения не упоминалось, но задержка ответа составляла около 30 мин. Но главным недостатком P. aeruginosa для использования его в мониторинге окружающей среды является то, что это условно-патогенный штамм.
Hwang с коллегами (2008) сконструировали штамм BBT NrdA на основе lux-штамма E. coli, у которого в качестве промотора выступает nrdA ген. Ген nrdA не регулируется посредством SOS-ответа. Штамм был испытан с четырьмя ДНК-повреждающими агентами (налидиксовая кислота, MMC, MNNG и 4-нитрохинолин N-оксид). Также штамм был испытан с 4 фенольными соединениями и с 4 окислителями, но индукция люминесценции была зарегистрирована только с перекисью водорода.
Было сконструировано большое количество штаммов для детекции повреждения ДНК, но наиболее чувствительными среди них оказались recA-штаммы, а именно DPD2797 и DPD3063).
Он запускае(Davidov et al., 2000). Повреждение белков Механизм, препятствующий повреждению белков, был обнаружен у всех организмов. Это ответ на тепловой шок (heat-shock тся высокой температурой, вирусными инфекциями, воздействиями различных химических веществ, которые вступают в реакцию с белками, и аномальными белками, возникающими в результате других процессов. Van Dyk с соавт. (1994) использовали два промотора для получения lux-штаммов с целью обнаружения повреждения белков, а именно - grpE и dnaKp гены. Ген dnaK кодирует Hsp70 - белок теплового шока, который имеет важную клеточную функцию в фолдинге и ренатурации белка. Ген grpE кодирует Hsp60, который имеет функцию, аналогичную таковой Hsp70.
В целом оба промотора отвечают на одни и те же соединения, а именно - этанол, метанол, сульфат меди, фенолы и его производные, и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, но grpE оказался примерно в пять-десять раз чувствительнее. GrpE штамм также имел более высокий базовый уровень люминесценции, и поэтому он демонстрировал эффект «lights-off» при высоких концентрациях токсических веществ. При высоких концентрациях токсикантов усиливались как «lights on», так и «lights off» эффекты в клетках с tolC мутацией.
Повреждение клеточных мембран
Для соединений, которые вызывают повреждение клеточных мембран, используются бактерии, которые содержат ген fabA, присоединенный к lux-генам. Ген fabA кодирует белок-переносчик -гидроксидеканоил-ацилдегидратазу, и отвечает за образование двойных связей в жирных кислотах, которые используются в клеточной мембране. Ген fabA активируется при связывании с белком FadR. Процесс ингибируется длинноцепочечными ацил-КоА-тиоэфирами. В случае повреждения мембран будет происходить истощение жирных кислот, уровень длинноцепочечных ацил-КоА-тиоэфиров понизится, что приведет к индукции fabA.
Штамм DPD2540, содержащий fabA и luxCDABE, был использован в исследованиях Choi и Gu (1999) и был протестирован с несколькими соединениями. Как и ожидалось, fabA индуцировался такими повреждающими мембраны веществами, как этанол, фенол, церулинин. Более удивительным, однако, было то, что также DPD2540 ответил на присутствие ДНК-повреждающего агента MMC и окислителя Н2О2 (Choi, Gu, 1999). Причина этого в том, что, вероятно, эти агенты также способны вызвать повреждение мембраны в качестве вторичного эффекта. В этих случаях ответ откладывался с 60 мин для этанола, до 150 мин для MMC и H2O2. Сравнение нескольких fabA lux-штаммов было сделано Bechor с соавт. (2002). Сравнивались tolC мутант (DPD2543), fadR мутант (DPD2549), и штамм с генным слиянием fabA::lux, внедренным в хромосому (DPD1674). FadR мутант не дал почти никакого ответа, тем самым доказав, что люминесценця действительно индуцируется посредством fabA. TolC мутант (штамм DPD2543) был более чувствителен к большинству испытанных химических веществ, чем немутантный штамм (DPD2544). Но штамм DPD2543 был более чувствителен ко многим производным фенола, но не к самому фенолу. Вставка в хромосому привела к падению фонового свечения примерно в 100 раз. DPD1674 имел более высокий коэффициент индукции для этанола, по сравнению с DPD2544, но при этом он был несколько ниже, чем для фенола. Соединения, которые индуцируют люминесценцию штаммов fabA, включают спирты, фенол и его производные, галометаны, ароматические и моющие средства. При сравнение эффектов lux-штаммов fabA штаммы показали близкое сходство со штаммами, отвечающими на повреждение белков. Работа всех штаммов, которые предназначены для детекции повреждения мембран, были сконструированы на основе fabA промотора. Объем информации о чувствительности и специфичности штаммов ограничен.
Образцы воды, донных отложений, атмосферного воздуха, атмосферных осадков, почв, тканей животных и растений
Для роста нуждается в присутствии в среде от 0,5 до 5 % (оптимум 1-4 %) NaCl (w/v); pH 6,0-9,0 (оптимум 7,0-8,0) и температуре 10–35оС (оптимум 20–25оС). Факультативный анаэроб. На основании биохимических результатов, полученных на анализаторе Vitek 2 Compact 30 (BioMerieux) при помощи карт VITEK 2 GN (BioMerieux), а также при помощи других микротестов, штамм VNB-15 можно разграничить с другими видами Vibrio (таблица 13).
По образованию индола положительный. Сероводород не образует. Желатин не гидролизует. Крахмал гидролизует. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) отрицательная.
Положительный по следующей ферментативной активности: Ala-Phe-Pro-Ариламидаза, -глюкозидаза, L-пролин-ариламидаза, амилаза, нитратредуктаза. Отрицательный по следующей ферментативной активности: L-пирролидон-ариламидаза, D-целлобиоза, -галактозидаза, -N-ацетил-глюкозаминидаза, глютамилариламидаза pNA, -глютамилтрансфераза, -ксилозидаза, -аланинариламидаза pNA, липаза, палатиназа, тирозинариламидаза, уреаза, -глюкозидаза, -N-ацетил-галактозаминидаза, -галактозидаза, фосфатаза, глицинариламидаза, орнитиндекарбоксилаза, лизиндекарбоксилаза, -глюкуронидаза, Glu-Gly-Arg-ариламидаза, дезаминаза фенилаланина, аргининдегидролаза, желатиназа. Катаболизирует такие углеводы, как D-глюкоза, D-мальтоза. Не утилизирует D-целлобиозу, арабинозу, D-маннозу, рамнозу, D-тагатозу, D-трегалозу, сахарозу, раффинозу, лактозу. Не утилизирует спирты адонитол, L-арабит, D-маннит, D-сорбит, инозит, дульцит, а также следующие соли: малонат, 5-кето-D-глюконат, L-лактат, сукцинат, L-малат, цитрат (натрия).
От близко родственных видов отличается утилизацией глюкозы, маннитола, инозитола, сорбитола, рамнозы и сахарозы, образованием лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, липазы, кислой фосфатазы, -глюкозидазы, -глюкозидазы, N-ацетил--глюкозаминидазы.
Не устойчив к О/129 (2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридин) вибриостатическому агенту. Результаты хемотаксономического анализа (проведен совместно со специалистами РГУНиГ имени И.М. Губкина, г. Москва), показали, что основной состав жирных кислот штамма представлен С16:1, значительное количество составляют C16:0, C18:19c, С14:0, C14:0 3-OH и C12:0 (таблица 14). Дыхательные хиноны состоят из Q8 и DMK8. Полярные липиды обоих штаммов представлены кардиолипином, фосфатидилэтаноламином, фосфатидилглицерином, фосфатидилсерином, фосфатидилинозитолом, и неизвестным полярным липидом с Rf1 0,00-0,25 и Rf2 0,6-0,7, который обнаруживается только при помощи фосфорно-молибденовой кислоты (рисунок 5 и таблица 14). Спектр люминесценции VNB-15 приходится на «синюю» область. Максимум спектра биолюминесценции составляет 478 нм (рисунок 6).
В жидкой среде штамм VNB-15 образует биопленку (рисунок 7). Электронные микрофотографии биопленок, полученных выращиванием клеток VNB-15 на поверхности жидкой питательной среды, представлены на рисунках 8–9.
Сканирующее электронно-микроскопическое исследование живой биопленки, состоящей из бактерий VNB-15, показало, что, в основном, структура биопленок универсальна и, независимо от состава, различается незначительно. Живая, полноценная биопленка состоит из клеток, окруженных матриксом, в виде различных образований, по форме напоминающих башни или грибы. Между микроколониями, состоящими из прикрепленных, «сидящих» клеток, проходят водные каналы и вода, циркулирующая по этим каналам, образует конвекционный поток. На рисунке 10 можно увидеть, как расположены вибрионы в матриксе биопленки – в виде очень плотной «паркетной» упаковки.
Результаты филогенетического анализа (проведен совместно со специалистами ФГУП «ГосНИИГенетика», г. Москва), основанного на сравнении последовательностей генов 16S rRNA, показали, что исследуемый штамм VNB-15 принадлежит роду Vibrio. Этот штамм показывает филогенетическую схожесть с рядом видов рода Vibrio: примерно 99,2 % с V. owensii (DY05Т), 99,1% с V. jasicida (TCFB 0772T), 99,1% с V. communis (R 40496T), 98,9% с V. sagamiensis (LC2-047T), 98,5 % с V. rotiferianus LMG 21460T (рисунок 11).
Филогенетическое дерево, основанное на анализе сиквенсов 16S rRNA, построено по методу Neighbor-Joining (Saitou, Nei, 1987). Bootstrap (процентное соотношение) 1000 повторов показывает соответствующие ветви. Photobacterium angustum ATCC 25915T, Photobacterium iliopiscarium ATCC 51760T и Photobacterium phosphoreum ATCC 11040T использованы как корневые виды. Объединённое дерево, построенное на основе генов 16S rRNA и housekeeping генов recA, gyrB, pyrH показало, что штамм, анализируемый в настоящей работе, не кластеризуется ни с одним из известных видов бактерий (рисунок 12).
Филогенетическое дерево, основанное на анализе объединенных сиквенсов трех housekeeping генов recA, gyrB, pyrH и 16S rRNA, построено по методу Neighbor-Joining Neighbor-Joining (Saitou, Nei, 1987). Photobacterium angustum ATCC 25915T и Photobacterium phosphoreum ATCC 11040T использованы как корневые виды.
На основании всех полученных данных, филогенетического анализа, морфологических, культуральных, физиологических и биохимических характеристик, хемотаксономического анализа, штамм VNB-15 следует идентифицировать как новый вид в роде, для которого предложено название Vibrio aquamarinus sp. nov.
Прилагательное aquamarinus - относится к аквамарину, прозрачному синевато-зеленому или голубому минералу группы берилла; относится к цвету излучаемого света.
Штамм Vibrio aquamarinus sp. nov. депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП «ГосНИИГенетика» и в Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (Приложение А, Б). Штамму присвоены названия Vibrio aquamarinus VKPM B-11245 и Vibrio aquamarinus DSM 26054, соответственно.
Штамм VNB-15 был выделен из воды, отобранной в Черном море в районе п. Абрау-Дюрсо (44о40 36"N, 37о33 49"E).
Вибрионы являются одним из наиболее распространенных организмов в поверхностных водах по всему миру. Род Vibrio насчитывает десятки филогенетически, фенотипически и экологически обособленных видов, широко распространенных в природе. Представители рода Vibrio обнаружены в морской среде с различной степенью солености, в устьях рек, на поверхности морских животных (от планктона до рыбы) и в содержимом их кишечника, где они выступают в качестве факультативных симбионтов, паразитов или патогенов. (Thompson et al., 2004). В девятом издании «Bergey,s Manual of Determinative bacteriology» (Holt et al., 1994) к роду Vibrio причислялись 34 отдельных вида, объединенных такими общими свойствами, как размер и форма клеток, подвижность при помощи жгутиков, потребность в ионах Na+, чувствительность к вибриостатическому агенту О/129.
Определение интенсивности биолюминесценции выделенных светящихся бактерий
Согласно данным, приведенным в Экологическом вестнике Дона (2006), максимальное загрязнение воды и ДО Нижнего Дона в 2005 г. также было отмечено в районах выпуска сточных вод очистных сооружений городов Ростова-на-Дону и Азова, в местах впадения притоков Северский Донец, Сал, Аксай, а также в дельте р. Дон. К сожалению, исследования генотоксичности ДО в районах выпуска сточных вод очистных сооружений г. Ростова-на-Дону и р. Сал в тот год не проводились. Как и в предыдущие годы, в 2005 г. были зафиксированы районы повышенной экологической опасности, в которых концентрации важнейших антропогенных токсикантов превышали ПДК загрязняющих веществ как в воде, так и в ДО. 2006 г. В 2006 г. генотоксический эффект ДО был зарегистрирован в 9 из 13 исследованных районов (таблица 32), или в 70 % случаев. Значение фактора индукции колеблется от 1,6 до 3,4. Причем во всех исследованных пробах ДО генотоксичность выявлена без применения метаболической активации, что говорит о преобладании в грунтах преимущественно мутагенов прямого действия. В случае тестирования генотоксичности ДО с применением метаболической активации низкие значения фактора индукции свидетельствуют о присутствии в грунтах токсичных веществ. Самые высокие величины фактора индукции были отмечены в районе устья р. Сал (2.5) и 500 м ниже устья р. Сал (3,4) (Сазыкина и др., 2009-г, 2011-б).
2007 г. В июне 2007 г. наблюдалось снижение генотоксичности ДО, что можно объяснить процессами естественного самоочищения водоема, в частности – вымыванием генотоксикантов из грунтов течением. Тем не менее, на участках в 500 м выше устья р. Аксай, 500 м ниже устья р. Маныч и в устье р. Маныч наблюдаются относительно постоянные значения генотоксичности ДО, что свидетельствует о наличии в данных районах устойчивого загрязнения грунтов генотоксикантами (таблица 32).
В течение 2005-2007 г. наблюдалась определенная положительная динамика снижения количества загрязненных участков. Если в период развития промышленности и сельскохозяйственного производства регистрировалось значительное поступление в водоемы загрязняющих веществ разной природы, то в течение 2005-2007 гг. спектр и концентрации загрязняющих веществ в разных компонентах экосистемы несколько уменьшились (Сазыкина и др., 2012-б). В частности, в течение этих лет регистрировалось наиболее низкое загрязнение воды Нижнего Дона стойкими ХОП (Экологический вестник Дона, 2006-2008). Снижение загрязнения вод в этот период можно также объяснить закрытием ряда промышленных предприятий области, проведением ремонтно-восстановительных и реконструкционных работ на очистительных станциях водоканалов городов Ростова-на-Дону, Таганрога, Красного Сулина, Каменска-Шахтинского и других. Тем не менее, причиной накопления генотоксических веществ в водоемах могут быть не только промышленные стоки и химизация сельского хозяйства. Достаточно широкий перечень таких соединений содержится в ливневых и бытовых стоках городов. Мутагены могут вырабатываться многими микроорганизмами, водорослями, присутствующими в естественных микробиоценозах. Совпадение временных трендов снижения генотоксичности, спада промышленного производства и снижения применения ядохимикатов в сельском хозяйстве свидетельствует об определяющем характере вклада двух последних источников в накопление генотоксикантов в ДО нижнего течения р. Дон.
2011 г. Генотоксичность была зарегистрирована во всех исследованных ДО районов (таблица 32) – в 12 районах (92 % проб) с использованием метаболической активации, в 11 – без ее применения (84,6 % проб). Наибольший генотоксический эффект был зарегистрирован в устье р. Аксай (фактор индукции 3,0), 500 м ниже усья р. Аксай (3,3) и устье р. Сал (3,1) (Сазыкина и др., 2011-б). Высокие показатели генотоксичности зафиксированы также в районе 0 км, створ и 500 м ниже г. Азова. Об ухудшении в 2011 г. качества воды р. Дон в контрольных створах г. Ростова-на-Дону (в черте города и ниже города) и г. Азова (ниже города) упоминается также и в государственном докладе (2011). Только в 2011 г. в Нижний Дон было сброшено 1 436,22 млн. м загрязненных сточных вод (Государственный доклад, 2012).
В 2011 г. были исследованы 3 новых района – устье р. Мокрая Каланча, устье р. Большая Кутерьма и район ст. Багаевская. Данные по генотоксичности с учетом данных районов приведены в таблице 35. Во всех этих районах наблюдался генотоксичный эффект средней силы (таблица 35). Для исследования ДО, отобранных в р. Дон в 2011 г., были дополнительно использованы биосенсорные штаммы, предназначенные для выявления загрязнения различной природы. Также для сопоставления данных, полученных при помощи lux-биосенсоров, и химического загрязнения, был проведен химический анализ донных отложений. Полученные результаты представлены ниже в п. 7.3.
В целом по результатам исследований можно выделить следующие районы, ДО которых хронически загрязнены генотоксикантами: 0 км, створ; 500 м ниже г. Азова; 500 м выше устья р. Аксай; 500 м ниже устья р. Маныч; устье р. Маныч; 500 м выше устья р. Маныч (таблица 33). В данных районах число генотоксичных проб, исследованных в течение 2001–2011 гг., составляет в сумме 51, 4 % без применения метаболической активации и 55,3 % при ее использовании (Сазыкина и др., 2009-г, 2011-б, 2012-б). Эти районы, по-видимому, можно предложить в качестве контрольных для мониторинга генотоксичности водной среды Нижнего Дона. Стабильная регистрация достоверных генетических эффектов позволяет прогнозировать в этих районах деградацию биоресурсов.
В таблице 33 представлены данные по количеству генотоксичных экстрактов ДО р. Дон в каждом из исследованных районов за весь период исследования. Наибольший процент генотоксичных проб приходится на вышеперечисленные районы. Также по количеству загрязненных промутагенами проб выделяется район 500 м выше устья р. Сал, но высокие показатели генотоксичности регистрировались в нем преимущественно в 2011 г.
Оценка экотоксикологических параметров воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров, 2010 г
Из данных, представленных в таблице 47, видно, что в экстрактах почв г. Ростова-на-Дону преобладают прямые мутагены – они зарегистрированы во всех пробах (89 %), кроме шестой. Присутствие веществ промутагенной природы отмечено лишь в одной пробе № 7 (11 %). Полученные эффекты, вероятно, обусловлены индустриальным загрязнением г. Ростова-на-Дону. Основными загрязнителями территории города являются автотранспорт, предприятия теплоэнергетики, машиностроения и стройиндустрии, а также суда воздушного транспорта.
Самый высокий генотоксический эффект (величина фактора индукции составила 5,47) обнаружен в экстракте почвы № 4, отобранного в районе Ростовской ТЭЦ-2. Известно, что энергетика является одной из самых загрязняющих отраслей народного хозяйства, а ТЭЦ – главные загрязнители атмосферы твёрдыми частицами золы, окислами серы азота, другими веществами, оказывающими вредное воздействие на здоровье людей, а также углекислым газом, способствующим возникновению «парникового эффекта».
Вещества, вызывающие окислительных стресс, зафиксированы в трех пробах (60 %) почв городов Ростовской области при тестировании с помощью штамма Е. coli MG 1655 (pSoxS-lux), и во всех пробах почв с помощью биосенсора Е. coli MG1655 (pKatG-lux) (таблица 46). Данные, представленные в таблице 47, свидетельствуют о наличии веществ, вызывающих окислительный стресс, во всех исследованных экстрактах почв г. Ростова-на-Дону. Самый большой эффект зафиксирован при помощи биосенсора Е. coli MG 1655 (pSoxS-lux) в экстракте почвы, отобранной в центре города в районе пр. Буденновский (величина фактора индукции составила 6,98). Пр. Буденновский – одна из самых оживленных автотрасс города. В составе отработавших газов автомобильных двигателей внутреннего сгорания содержатся сотни вредных компонентов, среди которых наиболее существенными являются оксид углерода, углеводороды, оксиды азота, альдегиды и др.
Оксиды азота, например, в результате фотохимических реакций с другими органическими веществами выхлопных газов, образуют свободные радикалы, пероксиды и другие соединения, вызывающие окислительный стресс.
Концентраций мышьяка и ртути, дающих высокий статистически значимый эффект, ни в одной из исследованных проб не обнаружено (таблица 46, 47). Самый большой коэффициент индукции биолюминесценции биосенсора Е.coli MG1655 (pMerR-lux), зафиксированный в экстрактах почв, составил 1,52 (Сазыкина и др., 2012-а). Этот фактор индукции соответствует концентрациям ртути менее 0,0002 мг/л (10-9 М). Максимальный коэффициент индукции Е.coli MG1655 (pArsR-lux) сенсора составил 3,59 ед. (этот фактор индукции соответствует концентрациям мышьяка менее 0,00075 мг/л (10-8 М). Учитывая тот факт, что в большинстве своем фоновое содержание мышьяка в почвах составляет сотые доли миллиграмма на килограмм почвы, обнаруженные нами концентрации не представляют опасности.
Следует отметить, что если в области контроля и охраны атмосферного воздуха и природных вод разработаны методы анализа и ПДК для довольно большого числа веществ и элементов, то в области мониторинга и охраны почв выявление уровня токсичности тяжелых металлов затруднено. Для почв с разными механическими составами и содержанием органического вещества этот уровень будет неодинаков. В настоящее время ПДК для ртути составляет 2,1 мг/кг, для мышьяка – 2,0 мг/кг (ГН 2.1.7.2041-06). Для кадмия предложен ОДК, равный 0,5–2,0 мг/кг (ГН 2.1.7.2511-09).
В исследованных нами образцах почв содержание ртути и мышьяка, как отмечено выше, невелико. Возможно, благодаря тому факту, что именно почвенный покров в конечном итоге принимает на себя давление потока промышленных и коммунальных выбросов и отходов, выполняя важнейшую роль буфера и детоксиканта. Тяжелые металлы, фтор, оксиды азота и серы в первоначальном или преобразованном виде интенсивно связываются минеральными и органическими веществами почвы, что резко снижает их доступность, и, соответственно, общий уровень токсичности. Сопротивляемость почв химическому загрязнению также зависит от их гранулометрического состава, содержания гумуса, емкости поглощения, водного режима, водопроницаемости, преобладания нисходящих или восходящих токов влаги и т.п. (Лозановская и др., 1998).
Возможно, в исследованных образцах почв преобладают другие металлы. Как уже упоминалось, для каждого города характерны свои доминирующие загрязнители, которые в основном и создают определенный уровень загрязнения (Государственный доклад, 1998).
Таким образом, в результате проведенного тестирования с помощью батареи lux-биосенсоров, можно сказать, что по уровню загрязнения пробы почвы далеко не однородны. Наиболее загрязнённой можно считать пробу почвы, отобранной в районе ГРЭС (2-км зона) в г. Новочеркасске, и пробы № 4 и 8, отобранные в г. Ростове на Дону в районе ТЭЦ-2 и в центральном районе (пр. Буденновский), соответственно (Сазыкина и др., 2012-а).
С помощью батареи бактериальных lux-биосенсоров, позволяющих достичь оптимального сочетания экспрессности, чувствительности и трудоемкости, был проведен первичный анализ содержания токсикантов различной природы в образцах почв урбанизированных территорий Ростовской области (Сазыкина и др., 2012-а). В ряде проб было зарегистрировано наличие ДНК-тропных соединений, а также веществ, вызывающих состояние окислительного стресса. Полученные результаты показали, что тесты на основе биолюминесцентных бактерий являются достаточно информативными для разработки процедуры исследования загрязнения почв токсикантами различной природы. Более того, их использование позволяет оптимизировать стратегию экологического мониторинга. В частности, оно дает возможность прицельно отбирать пробы для исследования аналитическими методами, что особенно ценно при работе в районах чрезвычайных экологических ситуаций.
