Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Использование целлюлолитических бактерий в биотехнологии 11
1.2 Взаимоотношения между целлюлолитическими бактериями и высшими растениями 27
1.3 Природные микробные ассоциации и смешанные культуры целлюлолитических бактерий 31
2 Объекты и методы исследований 40
3 Целлюлолитическиеазотфиксирующие бактерии и применение их для биоконверсии целлюлозосодержащих субстратов 59
3.1 Влияние условий культивирования на рост и ферментативную активность целлюлолитических и азотфиксирующих бактерий 60
3.2 Исследование целлюлазного комплекса азотфиксирующих бактерий 65
3.3 Исследование нитрогеназной активности целлюлолитических бактерий 69
3.3.1 Ассимиляция атмосферного и нитратного азота целлюлолитическими бактериями при их выращивании на отходах растениеводства 74
3.3.2 Влияние дополнительных факторов питания на развитие и азотфиксирующую способность целлюлолитических бактерий 78
3.3.3 Влияние микроэлементов на развитие и азотфиксирующую способность целлюлолитических бактерий 80
3.4 Автоселекция целлюлолитических азотфиксирующих бактерий в условиях полунепрерывного культивирования 84
3.5 Твердофазная ферментация отходов растениеводства с использованием целлюлолитических азотфиксирующих бактерий 88
3.6 Использование целлюлолитических азотфиксирующих бактерий в мелиоративно-удобрительных целях 97
4 Щллюлолитическшкаротинсинтезирующие бактерии и возможность их применения в кормопроизводстве 99
4.1 Кинетические характеристики роста целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий 100
4.2 Антимикробные свойства целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий и их чувствительность
к антибиотикам 100
4.3 Биосинтез витаминов группы В целлюлолитическими каротинсинтезирующими бактериями
4.4 Экскреция свободных внеклеточных аминокислот
целлюлолитическими каротинсинтезирующими бактериями ПО
4.5 Исследование целлюлазной активности каротинсинтезирующих бактерий 116
4.6 Исследование каротиногенеза целлюлолитических бактерий 116
4.6.1 Влияние длительности и температуры культивирования целлюлолитических бактерий на биосинтез каротина 119
4.6.2 Влияние источников углерода и азота на биосинтез каротина целлюлолитическими бактериями 126
4.6.3 Зависимость биосинтеза каротина целлюлолитическими бактериями от содержания микроэлементов и витаминов вереде 126
4.7 Твердофазная ферментация растительного сырья с использованием целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий 129
4.8 Использование вторичного роста целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий для селекции более активных штаммов 134
4.8.1 Условия формирования и характеристика вторичных
колоний бактерий 134
4.8.1.1 Влияние густоты посева и размера первичных колоний у целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий 135
4.8.1.2 Характер распределения вторичных колоний на первичных колониях целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий 135
4.8.1.3 Влияние температуры культивирования на частоту образования вторичных колоний бактерий 136
4.8.1.4 Влияние значений рН среды на частоту возникновения колоний вторичного роста бактерий 140
4.8.1.5 Влияние источников углерода на частоту образования вторичных колоний бактерий 140
4.8.1.6 Влияние источников азота на частоту формирования вторичных колоний бактерий 144
4.8.1.7 Влияние компонентов среды на индукцию вторичного роста бактерий 144
4.8.2 Сравнительное исследование исходных и вторичных культур
целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий 147
4.8.2.1 Влияние антибиотиков на исходные и вторичные культуры бактерий 152
4.8.2.2 Кинетические характеристики роста исходных
и вторичных культур бактерий 152
4.8.2.3 Влияние металлов на исходные и вторичные культуры бактерий 154
4.8.2.4 Витаминобразующая способность исходных и вторичных культур бактерий 158
4.8.3 Каротиногенез субкультур вторичного роста 162
5 Взаимоотношение целлюлолитических бактерий с высшими растениями 168
5.1 Выделение и характеристики целлюлолитических бактерий, используемых для инокуляции семян высших растений 168
5.2 Влияние целлюлолитических бактерий на всхожесть семян и развитие проростков высших растений 169
5.3 Влияние целлюлолитических бактерий на образование корней высшими растениями 172
5.4 Влияние длительности инокуляции целлюлолитическими бактериями на всхожесть семян и развитие проростков 175
5.5 Влияние инокуляции целлюлолитическими бактериями на стерильные и нестерильные семена высших растений 178
5.6 Влияние продуктов метаболизма целлюлолитических бактерий на рост эпифитной микрофлоры семян высших растений 180
5.7 Влияние клеток целлюлолитических бактерий и их метаболитов на высшие растения 182
5.8 Влияние культуральной жидкости целлюлолитических бактерий на рост и развитие высших растений 186
5.9 Биологически активные вещества целлюлолитических бактерий, перспективных для применения в агробиологии 191
5.9.1 Биосинтез витаминов группы В целлюлолитическими бактериями 191
5.9.1.1 Влияние витаминов группы В и продуктов метаболизма целлюлолитических бактерий на развитие проростков 194
5.9.2 Экскреция свободных внеклеточных аминокислот целлюлолитическими бактериями 196
5.9.2.1 Ассимиляция свободных внеклеточных аминокислот целлюлолитических бактерий высшими
растениями 198
5.10 Влияние высших растений на целлюлолитические бактерии 201
5.10.1 Адаптация целлюлолитических бактерий к высшим растениям 204
5.11 Применение целлюлолитических бактерий в полевых условиях 210
6 Естественные и искусственные ассоциации целлюлолитических бактерий 214
6.1 Кинетические характеристики роста природных микробных ассоциаций целлюлолитических бактерий 216
6.2 Деградация целлюлозы и целлюлазная активность природных микробных ассоциаций целлюлолитических бактерий 224
6.3 Исследование влияния бактерий-спутников природной ассоциации на рост и развитие целлюлолитических
бактерий 224
6.4 Азотфиксирующая активность природных микробных ассоциаций 227
6.5 Влияние микроэлементов на накопление биомассы и ферментативную активность природной микробной ассоциации целлюлолитических бактерий 231
6.6 Получение устойчивой и продуктивной ассоциации микроорганизмов для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья 236
6.7 Смешанные культуры целлюлолитических бактерий и дрожжей для получения кормового белка на отходах растениеводства...240
Заключение 244
Выводы 251
Список использованных источников
- Использование целлюлолитических бактерий в биотехнологии
- Влияние условий культивирования на рост и ферментативную активность целлюлолитических и азотфиксирующих бактерий
- Кинетические характеристики роста целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий
- Выделение и характеристики целлюлолитических бактерий, используемых для инокуляции семян высших растений
Введение к работе
Актуальность проблемы
Целлюлоза является главной составной частью растительного покрова Земли Синтез ее по своим масштабам превосходит синтез всех других природных соединений, что обуславливает важную роль разлагающих ее микроорганизмов в процессах минерализации и в круговороте углерода Микробиологическая конверсия возобновляемых ресурсов биосферы в различные полезные продукты в настоящее время представляет собой одну из важнейших проблем, чем и определяется неослабевающий интерес к целлюлозоразрушающим микроорганизмам Основная проблема, связанная с утилизацией лигноцеллюлозных отходов, состоит в том, что целлюлоза очень устойчива к различным воздействиям Поэтому ежегодно в различных лабораториях мира исследуются штаммы микроорганизмов с целью изыскания новых, с более высоким уровнем биосинтеза целлюлаз, а также разрабатываются биотехнологические способы использования целлюлозы и, в первую очередь, целлюлозосодержащих отходов растениеводства
Институтом микробиологии и вирусологии МОиН РК внедрен способ получения кормовых продуктов для животноводства из отходов растениеводства Способ предусматривает использование целлюлозоразлагающих бактерий, создающих в ферментируемой массе необходимый сахарный минимум и, вследствие этого, благоприятные условия для развития молочнокислых бактерий и накопления молочной кислоты, что способствует получению корма с 80 - 100%-ной поедаемостью и хорошей сохранностью.
Для создания генофонда взаимозаменяемых организмов продуцентов целлюлаз, отличающихся высоким уровнем практически ценных показателей, была создана коллекция целлюлолитических бактерий, а также изучены бактерии-спутники, в том числе обеспечивающие их азотом за счет его фиксации из атмосферы (Смирнова, 1992) Изучение физиолого-биохимических свойств целлюлолитических бактерий показало способность отдельных представителей этой группы микроорганизмов обогащать среду биологически активными веществами, что может быть положено в основу разработки способов повышения качества получаемых с их участием кормовых продуктов
В настоящее время не подлежит сомнению большая перспективность применения смешанных культур микроорганизмов как природных ассоциаций, так и созданных экспериментатором и сочетающих производственно полезные качества отдельных штаммов Поэтому для более глубокой конверсии различных отходов агропромышленного комплекса, представляющих собой сложные субстраты, необходимо изыскание природных микробных ассоциаций, а также создание смешанных культур, отвечающих этим требованиям
Поскольку целлюлолитические бактерии являются важным звеном в круговороте углерода в природе и существенной частью экосистемы, представляется перспективным исследование возможности их применения в других отраслях биотехнологии
Цель и задача исследований
Целью настоящей работы является разработка научных основ практического применения целлюлолитических бактерий
повышение питательной и биологической ценности кормовых продуктов, получаемых путем микробной трансформации возобновляемого сырья путем использования новых штаммов-продуцентов протеина и других биологически активных веществ,
более глубокая конверсия отходов растениеводства путем использования природных ассоциаций целлюлолитических бактерий и экспериментально созданных смешанных культур бактерий с более высокой физиоло-го-биохимической активностью,
разработка новых способов использования целлюлолитических бактерий в различных областях биотехнологии, в частности, агробиологии и почвоведении.
В задачу исследований входило
Поиск новых штаммов бактерий продуцентов целлюлолитических ферментов, биологически активных веществ, а также штаммов, обладающих способностью к фиксации азота атмосферы при росте на целлюлозе и исследование возможности использования их для биоконверсии отходов агропромышленного комплекса в кормовые продукты с повышенной питательностью и биологической ценностью
Повышение эффективности процессов биоконверсии различных субстратов путем использования природных ассоциаций и смешанных культур микроорганизмов
Поиск новых штаммов целлюлолитических бактерий для использования в агробиологии, а именно для биологической стимуляции всхожести семян и роста растений, а также новых штаммов бактерий для использования в мелиоративно - удобрительных целях в рисосеянии
Разработка новых способов использования целлюлолитических бактерий в различных областях биотехнологии, в частности, агробиологии и почвоведении.
Исследование физиолого-биохимических особенностей новых перспективных штаммов целлюлолитических бактерий и их природных ассоциаций с целью управления их ферментативной активностью и продуктивностью
Научная новизна
Выделены и изучены новые штаммы целлюлолитических бактерий рода Bacterium, Bacillus, Brevibacterium и Flavobactenum, в том числе способные к фиксации молекулярного азота атмосферы и синтезу биологически активных веществ, в частности, (J-каротина
Впервые показана возможность получения кормового продукта для животноводства с повышенными показателями питательности и биологической ценности за счет использования новых штаммов
Показана возможность повышения эффективности переработки лигно-целлюлозных субстратов путем использования природных микробных ассоциаций и применения смешанных культур микроорганизмов с предварительной адаптацией их друг к другу на уровне метаболитов и последующей автоселекцией ассоциаций в условиях полунепрерывного культивирования
Впервые показана возможность применения целлюлолитических бактерий для повышения, всхожести семян, стимуляции роста и развития растений сельскохозяйственных растений
Впервые показано, что целлюлолитические бактерии, способные к фиксации молекулярного азота атмосферы, могут быть использованы в мелио-ративно-удобрительных целях в рисосеянии для повышения урожая
Практическая иенность работы
Использование отселекционированных целлюлолитических бактерий для биоконверсии целлюлозосодержащих отходов растениеводства (пшеничная, рисовая солома, стебли, листья, стержни кукурузы) позволяет получать кормовые продукты с повышенными показателями поедаемости, переваримости и питательности
Разработан способ повышения питательности целлюлозосодержащих отходов растениеводства методом твердофазной ферментации за счет использования целлюлолитических азотфиксирующих бактерий, синтезирующих протеин и биологически активные вещества (витамины группы В и свободные аминокислоты) (Патент Республики Казахстан №4028,1993)
Разработан способ обогащения кормовых продуктов Р-каротином путем твердофазной ферментации отходов растениеводства целлюлолитиче-скими каротинсинтезирующими бактериями (Предварительный патент Республики Казахстан №9314,2000)
Разработан способ использования целлюлолитических бактерий для биологической стимуляции всхожести семян и роста растений агротехнических культур (Патент Республики Казахстан №4900, 1993, Предварительный патент Республики Казахстан №8751,2000)
Разработан способ применения целлюлолитических бактерий в мелио-ративно-удобрительных целях на засоленных почвах под культуру риса (Авторское свидетельство СССР №1740358,1992)
На опытно - промышленной установке Института микробиологии и вирусологии Министерства Образования и Науки Республики Казахстан наработан препарат целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий в виде сухой закваски, который был передан для производственного испытания в Оренбургский Государственный Аграрный Университет Получены результаты о положительном эффекте применения данных целлюлолитических бактерий
Положения, выносимые на защиту
Физиолого-биохимические свойства новых штаммов факультативно-анаэробных ацидотолерантных целлюлолиріческих бактерий позволяют использовать их для конверсии различных отходов растениеводства в кормовой продукт с повышенной питательностью и биологической ценностью
Использование природных ассоциаций целлюлолитических бактерий и их смешанных культур с молочнокислыми бактериями и дрожжами интенсифицирует процессы биоконверсии различньк субстратов в кормовые продукты,, предварительная адаптация микробных ассоциантов друг к другу на уровне метаболитов и последующая автоселекция адаптированных клеток в условиях полунепрерывного культивирования повышает их продуктивность
Целлюлолитические бактерии в силу своих биохимических особенностей, а именно сцособности к синтезу гидролаз и биологически активных веществ, являются стимуляторами всхожести семян и роста растений
Процессы биодеградации целлюлозы в почве под воздействием внесенных извне целлюлолитических бактерий способствуют благоприятному мелиоративно-удобрительному эффекту при развитии культуры риса Применение новых штаммов целлюлолитических азотфиксирующих бактерий значительно усиливает положительный эффект за счет снабжения растений легкоусваиваемыми формами азота
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на 10-м Международном конгрессе по азотфиксации «Nitrogen fixation fundamentals and applications» (St. Peterburg - Dordrecht, 1995), на съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 1997), на Международной конференции по проблемам современной микробиологии и биотехнологии (Алматы, 2000), на Международной научно-практической конференции «Спонсируемые биотехнологические разработки и проблемы нераспространения» (Алматы, 2000); на 2-й Международной конференции «Agroeconomics of camehd farming» (Almaty, 2000)
В завершенном виде работа доложена на заседании секции физиологии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии МОиН РК
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 34 научные работы, получены одно авторское свидетельство СССР, два патента РК и два предварительных патента РК
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела, включающего описания объектов исследования и методики работ, 4 разделов, содержащих результаты экспериментальных исследований автора, заключения, выводов, списка литературы (463 названия работ) и 5 приложений Материалы диссертации изложены на 296 страницах текста, содержит 64 таблицы и 71 рисунок
Использование целлюлолитических бактерий в биотехнологии
Биотехнология охватывает все аспекты использования биологических систем для получения хозяйственно-ценных продуктов и в настоящее время является одним из наиболее приоритетных направлений науки и техники, о чем свидетельствуют все возрастающие ассигнования на ее развитие во всех странах мира. Наиболее быстро развивается одна из традиционных отраслей биотехнологии - микробная технология, целью которой является теоретическое и экспериментальное обоснование методов и режимов, обеспечивающих воспроизводимое получение популяций микроорганизмов и целевого продукта их жизнедеятельности с заданными свойствами 151. Резкое ухудшение структуры питания населения выдвигает на первый план вопросы, связанные с получением с помощью микроорганизмов корма для сельскохозяйственных животных, а также повышения и стимуляции урожайности агротехнических культур растений. Однако прогресс в области биотехнологии сдерживается недостаточностью сырьевой базы. Одной из важнейших задач в настоящее время является изыскание дополнительных сырьевых источников. Особый интерес в этом плане представляют природные возобновляемые ресурсы биосферы - продукты фотосинтеза /6-Ю/. В результате фотосинтеза на Земле ежегодно воспроизводится 173 млрд. т сухого вещества, в том числе целлюлозы - ПО млрд. т /11,12/. Основными чертами этого вида сырья является его масштабность, возобновляемость и высокое содержание энергии и органических веществ. Целлюлоза, один из самых распространенных в природе растительных полимеров, является главной составной частью растительного материала. Синтез ее по своим масштабам превосходит синтез всех других природных соединений. Растительные остатки на 40 - 70% состоят из целлюлозы. Столь большое количество целлюлозы обуславливает важную роль разлагающих ее микроорганизмов в круговороте углерода и в процессах минерализации почв.
Целлюлоза является одним из наиболее перспективных источников для получения белка одноклеточных на кормовые нужды и прямой конверсии лигноцеллюлозных субстратов в кормовые продукты для сельского хозяйства. Однако из-за низкого содержания белковых веществ, невысокой усвояемости и перевариваемости целлюлозосодержащие отходы сельского хозяйства и ряда отраслей промышленности являются неполноценными по своему качеству и не могут быть использованы в кормопроизводстве без специальной обработки. Биотехнологические решения использования данного сырья позволили бы одновременно рационально утилизировать целлюлозосодержащие отходы, увеличить их кормовую ценность и уменьшить последствия их воздействия на окружающую среду.
Большинство известных способов получения микробного белка и кормовых продуктов из лигноцеллюлозных отходов базируется на кислотном или щелочном гидролизе и получении при этом простых Сахаров /13-18/. В тоже время химический гидролиз имеет ряд недостатков, связанных с большим расходом реактивов, потребностью в специальной аппаратуре, образованием нежелательных продуктов гидролиза. Все это оказывает известное влияние на качество и стоимость микробного синтеза. Еще в 1953 году А. А. Имшенецкий писал: «...Целлюлоза - это сырье будущего и гидролизная промышленность не может не стремиться к применению микроорганизмов и их ферментных препаратов, гидролизующих целлюлозу с образованием Сахаров...» /19/.
В последние годы все большее внимание ученых привлекает ферментативное расщепление или гидролиз целлюлозы. Именно это явление - ферментативное расщепление целлюлозы до глюкозы лежит в основе биологической утилизации целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства и промышленности /20/. А сам путь микробной конверсии сырья основан на деградации целлюлозы различными микроорганизмами или ферментными препаратами целлюлаз, полученными из микроорганизмов.
Учеными разных стран придается большое значение разработке вопросов микробной деградации целлюлозы /21-40/. « Если даже малую долю этих отходов превращать гидролитическим или микробиологическим путем в полезные продукты, это может быть весьма ощутимый и, что важно, возобновляемый источник углеродов, заменителей нефтепродуктов, а также исходных соединений для микробиологического синтеза» /41/, то есть разработка рациональных способов утилизации целлюлозосодержащих отходов позволила бы полностью решить ряд проблем производства пищевых и кормовых продуктов, а также топлива.
Однако из-за низкой усвояемости данных отходов, связанных с наличием трудногидролизуемых полисахаридов и инкрустирующих веществ, применение их в кормопроизводстве незначительно. Хотя это огромный резерв для получения полноценных кормов и полезных продуктов. Ежегодно во всем мире накапливается около 1400 млн. т соломы, из которых на кормовые цели используется менее одной трети. Существует много способов переработки целлюлозного материала, как с целью повышения его усвояемости сельскохозяйственными животными, так и для использования в качестве питательной среды для культивирования микроорганизмов. Однако экономическая эффективность их невысока вследствие затрат на реактивы и специальное оборудование.
Кроме традиционного использования соломы /41-51/ в последнее время утилизируются и другие целлюлозосодержащие отходы: багасса сахарного тростника /52-54/, мелкое волокно целлюлозы и пульпа зерновых волокон /55-57/, сухие водоросли /58-61/, древесина и опилки /62-64/, стебли хмеля и клещевины /65, 66/, отходы табака /67/, костра льна и конопли /68/, пульпа луба /69/, виноградные гребни /70, 71/, твердые остатки сока цитрусовых /72/. Несмотря на усилия многих ученых мира, технологии биоконверсии лигноцеллюлозного сырья, отличающейся достаточно высокой эффективностью и экономичностью, еще не создано /73-76/. С одной стороны, это зависит от специфики субстрата. Так Я. Я. Лаукевиц с соавторами /77/ объясняет это тем, что относительно высокая стойкость целлюлозы и лигно-целлюлозной матрицы является фундаментальным явлением и обусловлена эволюцией живой природы. С другой стороны, для прямой конверсии этих субстратов еще не удалось добиться оптимального выбора целлюлозораз-рушающих микроорганизмов и выявить оптимальные условия их культивирования, а кроме того, еще не исчерпаны возможности использования смешанных культур микроорганизмов /78, 79/. Несомненно, что будущее в решении проблемы получения полезных продуктов из целлюлозосодержа-щего сырья принадлежит как прямой конверсии лигноцеллюлозных отходов, так и их ферментативному гидролизу. Поэтому интерес к подбору микроорганизмов - продуцентов целлюлазного комплекса, оптимизации процессов их выращивания не только не ослабевает, но и возрастает во многих странах мира.
В связи с этим при создании рациональных технологических решений исключительно важным является подбор и создание высокопродуктивных штаммов с устойчивыми характеристиками. Поиск микроорганизмов с нужными свойствами должен проводиться с учетом условий, способствующих естественному отбору в данном направлении /80/. Большое внимание уделяется селекции микроорганизмов с применением генной инженерии. Так, путем введения чужеродных генов получены микроорганизмы, способные разлагать целлюлозосодержащие субстраты. Это и бактериальные организмы, такие как Escherichia coli, Bacillus subtilis /81-84/ и дрожжевые /85, 86/.
Влияние условий культивирования на рост и ферментативную активность целлюлолитических и азотфиксирующих бактерий
Для исследования влияния температуры культивирования и значений рН среды на удельную скорость роста целлюлолитических азотфиксирующих бактерий культуры выращивали на среде Гетчинсона, источником азота служил нитрат натрия. Максимальную скорость роста штаммов рода Bacillus (В. cytaseus 21, В. oligonitrophilus 128) наблюдали при температуре 30-32С (Цяшх = 0,449±0,002 ч"1 и [ІШХ = 0,412+0,001 ч1 соответственно), у штамма Ps. fluorescens 56 максимальную скорость роста отмечали при более высокой температуре - 32-34С (W = 0,381+0,001 ч"1 ). При температуре 43С и выше бактерии рода Bacillus не росли. Температурный предел Ps. fluorescens 56 несколько ниже - 40С. При понижении температуры культивирования ниже 25С скорость роста культур заметно снижается (рисунки 11,12,13).
Исследование зависимости скорости роста бактерий от значения рН среды культивирования показало, что все три штамма растут при рН не выше 8,5. Оптимальное значение рН среды для штаммов рода Bacillus около 7,0. Максимальную скорость роста у штамма В. cytaseus 21 наблюдали при рН 6,6-7,2; у штамма В. oligonitrophilus 128 - 6,5-7,5; для Ps. fluorescens 56 оптимум значения рН среды ниже 6,5, а максимальная скорость роста наблюдалась при рН 6,0-6,7. Скорость роста исследуемых культур значительно снижается при рН выше 8,0. При уменьшении значений рН среды ниже 6,0 для штаммов рода Bacillus и ниже 5,5 для Ps. fluorescens 56 скорость их роста снижается.
Исследование влияния температуры и значений рН среды на рост и активность ферментов (общая активность целлюлазного комплекса бактерий и нитрогеназы) проводили на модифицированной безазотистой среде Берка, в качестве источника углерода и энергии использовали Na-КМЦ.
Как показали проведенные опыты, наибольшую активность целлюлаз проявляют клетки, выросшие при температуре культивирования в пределах 25-40С, максимальную активность отмечали при 40С. Наибольшую нит-рогеназную активность отмечали при температурах 25-35С с пиком активности для Ps. fluorescens 56 при 30С, а бациллярных штаммов - при 35С (таблица 1).
Исследование влияния рН среды на активность целлюлазного комплекса и нитрогеназы показало, что наибольшая нитрогеназная активность клеток всех исследуемых штаммов проявляется в диапазоне значений рН среды от 6,5 до 7,5 с максимумом для обоих штаммов рода Bacillus при рН 7,0, а для штамма Ps. fluorescens 56 - при рН 6,5. С увеличением рН среды выше 7,5 нитрогеназная активность штаммов снижается и при рН 8,0 составляет около 30% от максимального значения. Оптимальный предел значений рН среды для целлюлазного комплекса исследуемых бактерий обна-ружен при рН 6,0-7,5 с оптимумом для штамма В. cytaseus 21 при рН 6,5, для штаммов В. oligonitrophilus 128 и Ps. fluorescens 56 - при рН 7,0. Увеличение значения рН среды выше 7,0 приводит к заметному падению активности целлюлаз. Снижение значения рН среды ниже 6,0 не приводит к резкому уменьшению данной активности. Так, для штамма В. cytaseus 21 при рН среды 5,0 и ниже сохраняется 60% активности целлюлазного комплекса бактерий (таблица 2).
В литературе практически не встречаются сведения об исследовании состава целлюлазных комплексов азотфиксирующих бактерий, способных расщеплять целлюлозу. Поэтому представлялось интересным исследовать состав ферментов целлюлазного комплекса данных бактерий, изучить влияние источников углерода и энергии, выявить локализацию ферментно го комплекса и исследовать влияние химических добавок на выход его из клеток. 1
Для исследования качественного и количественного состава целлюлаз бактерий, штамм В. cytaseus 21 выращивали/на средах как с чистой целлюлозой, в качестве которой использовали Na-КМЦ и фильтровальную бумагу, очищенную от сопутствующих гемицеллюлоз и ксиланов по методу На-плековой Н.Н. /23/, так и с природной целлюлозой (пшеничная солома, кукурузная солома, пшеничные отруби, свекловичный жом, вата). Субстратом для тестирования фермента эндо-1,4-Р-глюканазы (К.Ф. 3.2.1.4) служил раствор Na-КМЦ; в качестве субстрата для определения активности целлобиогидролазы (К.Ф. 3.2.1.91) использовали обезвощенное хлопковое волокно; для определения р-глюкозидазы (К.Ф. 3.2.1.21) - целлобиозу.
Было показано, что целлюлазный комплекс В. cytaseus 21 состоит из трех ферментов: эндо-1,4-Р-глюканазы, целлобиогидролазы и р-глюкозидазы.
При исследовании влияния источника углерода и энергии на активность внеклеточных целлюлаз выявлено, что природная целлюлоза стимулирует активность всех ферментов целлюлазного комплекса. На средах с Na-КМЦ и очищенной целлюлозой активность целлюлаз была более чем в два раза ниже (таблица 3).
Так, на среде с пшеничной соломой и пшеничными отрубями активность эндо-1,4-р-глюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы возросла по сравнению с очищенной целлюлозой (фильтровальная бумага) приблизительно в 2-2,5 раза.
Кинетические характеристики роста целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий
При микробиологическом анализе готовой ферментированной соломы часто встречаются бактерии, характеризующиеся яркой красной или оранжевой окраской, предполагающей наличие каротина. Этот вид корма используется, главным образом, в зимне-весенний период, когда из-за отсутствия зеленого корма в рационах сельскохозяйственных животных ощущается острый дефицит этого ценного биологически активного вещества. Одной из задач работы было выделение целлюлолитических бактерий, обладающих не только способностью разлагать целлюлозу, но и накапливать каротин. Выделение каротинсинтезирующих бактерий проводили из различных силосов и ферментированных отходов растениеводства хорошего качества. Освобождали от сопутствующей микрофлоры путем повторных пересевов на среду с целлюлозой в качестве единственного источника углеродного питания. Было выделено 86 штаммов целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий, относящихся преимущественно к родам Bacterium, Brevibacterium и Flavobacterium.. Клетки бактерий имеют различную форму, в преобладающем большинстве палочковидную, разной величины, часто характеризуются полиморфизмом (с возрастом приобретают кокковидную или иную форму) и снеппинг-делением. Подвижные неспороносные грамположительные клетки легко обесцвечиваются. Морфология клеток сильно зависит от состава питательной среды, возраста культуры, температуры культивирования. Большинство выделенных бактерий - факультативные анаэробы. Хорошо растут при температуре 16-40С и при нейтральном и кислом значениях рН. Все культуры развиваются на минеральных средах, где в качестве единственного источника углерода использована целлюлоза (фильтровальная бумага, Na-КМЦ, солома); синтезируют р-каротин.
Из собранной коллекции культур целлюлолитических бактерий для детального изучения были отобраны три штамма факультативных анаэробов, обладающих следующими свойствами: способность к росту на среде с целлюлозой при низких значениях рН среды; высокой скоростью синтеза микробной массы, способностью к синтезу целлюлаз и гемицеллюлаз для прямой биоконверсии поликомпонентных субстратов; высокой активностью синтеза р-каротина; комплексом целлюлаз с высокой активностью, термостабильностью и прочной адгезией на целлюлозе; отсутствие патогенносте и токсичности.
Два из них относятся к роду Brevibacterium (Brev. opacum 103KCS и Brev. erythra 38KCS) и один - к роду Flavobacterium (F. aurantiacum 81/3KCS). Отсутствие патогенности и токсичности установлено в Институте питания МОиН Республики Казахстан. Штаммы депонированы Национальной коллекцией культур микроорганизмов при Институте микробиологии и вирусологии МОиН Республики Казахстан.
Учитывая, что целлюлолитические бактерии - слабо изученная группа микроорганизмов, а о целлюлолитических каротинсинтезирующих бактериях сведений в литературе крайне мало и в связи с тем, что данные бактерии перспективны для использования в биотехнологии кормопроизводства, представлялось актуальным дать им разностороннюю характеристику, включающую кинетические параметры роста, синтез биологически активных веществ, отношение к антибиотикам и другое.
Исследовали кинетику роста бактерий на различных углеводных субстратах в периодических условиях. Данные представлены на рисунках 22, 23,24.
Анализ кривых роста показывает, что в зависимости от источника углерода изменяются такие показатели, как уровень накопления биомассы, длительность лаг-периода и фазы экспоненциального роста. Самый высокий уровень накопления биомассы обоими штаммами Brevibacterium отмечается при росте на глюкозе, а для штамма F. aurantiacum 81/3 - на лактозе. При росте на ксилозе все штаммы растут хуже, чем на глюкозе. Наименьшее накопление биомассы отмечено при росте на среде с Na-КМЦ.
Были определены также длительность лаг-фазы и удельная скорость роста на углеводах (таблица 17).
Самой короткой лаг-фазой для всех штаммов характеризуется рост на глюкозе, удельная скорость при этом была значительно выше, чем на других сахарах. При росте на лактозе удельная скорость роста была выше у штамма F. aurantiacum 81/3, а на Na-КМЦ - у штамма Brev. opacum 103. Продолжительность лаг-периода при росте на всех указанных сахарах кроме лактозы была больше у штамма F. aurantiacum 81/3.
Таким образом, наиболее благоприятным субстратом для роста штаммов является глюкоза. Лактоза также хорошо утилизируется. Ксилоза усваивается значительно хуже, чем глюкоза и лактоза. Na-КМЦ усваивается бактериями лишь после прохождения длительной лаг-фазы, в течение которой происходят адаптационные процессы.
Целлюлолитические каротинсинтезирующие бактерии являются крайне малоизученной группой микроорганизмов. Практическое использование данных бактерий для биоконверсии грубых целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства с последующим получением кормовых продуктов способствует массированному введению их в желудочно-кишечный тракт сельскохозяйственных животных. Поэтому важно иметь представление о характере взаимоотношений этих бактерий как с полезной, так и с патогенной микрофлорой. Кроме того, часто солома и другие отходы растениеводства сильно обсеменены различными микроорганизмами, в том числе гнилостными и патогенными для животных. Представляет интерес изучение антагонистических свойств исследуемых штаммов целлюлолитических ка-ротинобразующих бактерий.
В качестве тест-культур исследованы 17 организмов, включающие грамположительные и грамотрицательные бактерии - модели гнилостных и болезнетворных бактерий, дрожжевые организмы, а также актиномицеты и грибы.
Из представленной таблицы 18 следует, что целлюлолитические каро-тинсинтезирующие бактерии обладают антимикробными свойствами, угнетая рост ряда бактерий и дрожжей. Антагонистически действуют на гнилостные бактерии, такие как В. mycoides, В. subtilis, Е. coli, а также на ряд бактерий, являющихся моделью возбудителей пневмонии, стафилококкового сепсиса, сибирской язвы и других заболеваний. Наиболее широкий спектр действия отмечен у Brev. erythra 38, хотя другие исследуемые штаммы также обладают высокой антагонистической активностью. В таблице 16 приведены данные об отсутствии антагонистического воздействия на развитие молочнокислых бактерий. Это обстоятельство представляет особый интерес, поскольку молочнокислые бактерии не только являются основными представителями полезной микрофлоры организма сельскохозяйственных животных, но и наряду с целлюлолитическими бактериями могут быть использованы в процессе приготовления кормового продукта, в частности для твердофазной ферментации грубых отходов растениеводства. Следует отметить, что два штамма исследуемых бактерий (Brev. erythra 38, F. aurantiacum 81/3) обладают антагонистическим действием на дрожжи Candida albicans, вызывающие тяжелое системное заболевание человека и животных - кандидомикоз. При изучении взаимоотношений целлюлолити-ческих бактерий с плесневыми грибами и актиномицетами установлено, что они подавляют в разной степени рост и развитие актиномицетов и обладают ярко выраженным явлением фунгистазиса.
Сведений о чувствительности целлюлолитических каротинобразующих бактерий к антибиотикам в литературе не отмечалось. Для практического использования штаммов представлялось необходимым получение данных о результатах контакта культуры с различными антибиотиками. Полученные данные представлены в таблице 19 и рисунках 25 и 26.
Исследуемые штаммы целлюлолитических каротинсинтезирующих бактерий оказались весьма устойчивыми к влиянию антибиотиков, что свидетельствует об их явном селективном преимуществе. Наиболее высокой устойчивостью характеризуется штамм Brev. erythra 38. Из десяти исследуемых антибиотиков он оказался устойчивым к семи (окситетрациклин, тетрациклин, хлортетрациклин, левомицетин, эритромицин, пенициллин, олеандомицин). Штамм F. aurantiacum 81/3 - к пяти антибиотикам (тетрациклин, левомицетин, неомицин, стрептомицин, мо-номицин). Наибольшей чувствительностью к антибиотикам обладает штамм Brev. орасшп 103, который чувствителен к шести из десяти антибиотиков (окситетрациклин, левомицетин, эритромицин, неомицин, стрептомицин, мономицин) и устойчив только к четырем (тетрациклин, хлорте-рациклин, пенициллин, олеандомицин).Следует отметить, что все исследуемые штаммы оказались устойчивыми к тетрациклину, пенициллину, олеандомицину и обладали повышенной чувствительностью к неомицину, стрептомицину и мономицину, то есть к антибиотикам, относящимся к аминоглюкозидной группе.
Выделение и характеристики целлюлолитических бактерий, используемых для инокуляции семян высших растений
В процессе эволюции между растениями и микроорганизмами создались определенные взаимоотношения. Микроорганизмы не только используют растения в качестве места обитания, но и получают от них питательные вещества. Растения пользуются продуктами метаболизма микроорганизмов, удовлетворяя таким образом потребность в необходимых для нормального роста и развития элементах - азоте, фосфоре, калии, а также в биологически активных веществах - витаминах, аминокислотах, фитогор-монах, которые они сами не всегда в состоянии синтезировать в достаточном количестве. Растения также оказывают влияние на микроорганизмы при помощи биологически активных веществ. Как известно, зона корней населена бактериями, в первую очередь представителями рода Pseudo-monas, Bacillus, Cellulomonas и других. Среди них часто встречаются бактерии, обладающие целлюлолитической активностью. Влияние представителей этих родов на высшие растения практически не изучено, хотя обнаружение среди этих бактерий стимуляторов роста растений имеет большое практическое значение. Исследование их физиолого-биохимических особенностей и конкретных механизмов влияния на высшие растения может быть использовано для решения ряда вопросов общебиологического и агробиологического профиля.
В настоящем разделе работы представлены результаты экспериментального исследования влияния целлюлолитических бактерий на рост и развитие высших растений. Объектом исследования служили культурные растения, используемые для производства продуктов питания и кормов.
В ранней фазе роста, когда развивается зародыш, прорастает семя и формируется проросток, растение особенно чувствительно к условиям внешней среды. Именно в этой фазе легче обнаружить влияние различных факторов на растительный организм, чем в последующие фазы роста. Поэтому первым этапом экспериментальных исследований было изучение влияния инокуляции целлюлолитическими бактериями на прорастание семян высших растений.
Выделение целлюлолитических бактерий проводили из различных источников в Алматинской области: разлагающейся древесины, кишечных трактов и экскрементов насекомых, разлагающих древесину, силосов хорошего качества, ризосферы корней растений. В результате проведенной работы получена коллекция целлюлолитических бактерий, включающая более 350 штаммов различной таксономической принадлежности и их природных ассоциаций. Отобрано 20 штаммов, обладающих наиболее высокой
целлюлолитической активностью, о чем судили по скорости и степени деградации фильтровальной бумаги, взятой в качестве единственного источника углерода. Клетки выделенных бактерий в преобладающем большинстве имеют палочковидную форму разной величины, часто характеризуются выраженным полиморфизмом (с возрастом приобретают коковидную или иную форму). Подвижные спороносные и неспороносные грамположи-тельные клетки легко обесцвечиваются. Морфология клеток сильно зависит от состава питательной среды, возраста культуры, температуры выращивания. Большинство выделенных бактерий - факультативные анаэробы.
Для детального изучения были отобраны три штамма факультативных анаэробов, обладающих следующими свойствами: высокой скоростью синтеза микробной биомассы, отсутствием фитотоксичности и фитопатоген-ности, а также отсутствием патогенносте для теплокровных животных. Два из них относятся к роду Cellulomonas (С. biazotea 150, С. efiusa 60) и один -к роду Bacillus (В. cytaseus 21). Отсутствие патогенносте и токсичности установлено в Институте питания МОиН РК. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию промышленных микроорганизмов Российского научно-исследовательского института «Генетика».
Первый этап работы включал бактеризацию семян пшеницы. С этой целью семена пшеницы сорта «Безостая-2», районированной в Казахстане, обрабатывали суспензией живых клеток, содержащей 1x106 - 1x108 клеток в мл в течение 18 ч при комнатной температуре. Целлюлолитические бактерии выращивали на среде Гетчинсона с соломой в качестве источника углерода и энергии в течение 5 суток при температуре 30С на качалке. В контроле семена замачивали в стерильной среде. По истечении срока замачивания семена высевали. Через 7 суток выращивания проводили подсчет проростков растений, измерение надземной части и корней. Полученные данные представлены в таблице 41 и на рисунке 48.
Как видно из результатов, представленных в таблице 41, исследуемые штаммы целлюлолитических бактерий оказывают стимулирующий эффект на всхожесть семян и развитие проростков пшеницы. Отмечено, что положительное влияние инокуляции зависит от используемого штамма бактерий. Так, максимальная всхожесть - 85,4% была получена в случае предпосевной инокуляции семян пшеницы штаммом Cellulomonas biazotea 150, она превышает таковую у контроля на 36,2%. Проростки пшеницы имели большую длину стеблевой части, на 15,7% превышающую этот показатель в контрольном варианте. Стебли и листовые пластинки были более ярко окрашенными и развитыми. Длина корней и их количество на одно растение соответственно в 1,6 и в 1,4 раза выше , чем у контроля. Два других штамма также оказывают стимулирующий эффект на всхожесть семян и развитие проростков. Но он был несколько ниже, чем в варианте, где использовали штамм С. biazotea 150. Так, в варианте со штаммом Bacillus cytaseus всхожесть семян возросла на 32,0% по сравнению с контролем, длина стебля - на 12,0%, а длина корня - в 1,5 раза больше таковой у контрольного варианта. Для варианта со штаммом С. eflusa 60 прослеживалась аналогичная закономерность по всхожести и увеличению роста проростков, но стимулирующий эффект в этом варианте был несколько ниже по сравнению с вариантами со штаммами В. cytaseus 21 и С. biazotea 150. Отмечено, что стимулирующий эффект целлюлолитических бактерий проявляется на корнях сильнее, чем на наземной части растений; это хорошо согласуется с данными таблицы 41 по увеличению средней длины стебля и возрастанию количества корней на одно растение.
Таким образом, впервые показана возможность повышения всхожести семян и дальнейшее положительное влияние на развитие и рост высших растений за счет предпосевной инокуляции семян целлюлолитическими бактериями.
Положительное влияние обработки целлюлолитическими бактериями, возможно, объясняется тем, что они частично разрушают твердую оболочку семян, что усиливает транспорт воды и растворенных в ней минеральных солей к зародышу семян. Факт наличия стимулирующего эффекта на проростки растений и, особенно, на их корнеобразующую способность позволяет предположить, что после первой фазы - частичной деградации твердой оболочки семян, наступает вторая - фаза влияния на уровне вторичных метаболитов, при которой происходит обогащение семян жизненно важными биологически активными веществами, такими, как витамины группы В, аминокислоты и другими.
Похожие диссертации на Физиологические и популяционные основы практического применения целлюлолитических бактерий
