Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биоразнообразие микроорганизмов, участвующих в окислении соединений Fe(II) 14
1.1. Таксономический состав и филогенетическое положение железоокисляющих прокариот 17
1.2. Физиологическое разнообразие и распространение железоокисляющих организмов
1.2.1. Ацидофильные железоокисляющие прокариоты 21
1.2.2. Нейтрофильные железоокисляющие прокариоты
1.2.2.1. Аэробные железоокисляющие микроорганизмы 28
1.2.2.2. Анаэробные железоокисляющие микроорганизмы 33
1.2.2.3. Фотосинтезирующие железоокисляющие микроорганизмы 36
1.3. Механизмы окисления Fe(II) у микроорганизмов 38
Глава 2. Роль микроорганизмов в окислительных реакциях геохимического цикла железа 49
Заключение по обзору литературы 53
Экспериментальная часть
Глава 3. Объекты и методы исследований 56
3.1. Объекты исследований 56
3.2. Методы полевых исследований
3.2.1. Физико-химические методы 56
3.2.2. Отбор проб 56
3.3. Моделирование процессов бактериального и химического окисления Fe(II) в воде источников 57
3.4. Методы лабораторных исследований
3.4.1. Состав питательных сред 58
3.4.2. Методы исследования морфологии и ультраструктуры клеток 59
3.5. Исследование культурально-физиологических свойств бактерий 59
3.5.1. Методы изучения ростовых параметров и метаболизма 59
3.5.2. Биохимические методы 60
3.5.3. Анализ состава жирных кислот клеток 61
3.5.4. Метод определения состава полярных липидов мембран клеток 61
3.5.5. Метод анализа мембранных липохинонов 61
3.6. Методы генетических исследований 61
3.7. Анализ изотопного состава 5654Fe 63
Результаты исследований и их обсуждение
Глава 4. Характеристика минеральных железистых источников различного происхождения 64
4.1. Низкотемпературные минеральные источники 65
4.2. Соленый источник 66
4.3. Термальный источник 66
4.4. Распространение и численность железобактерий в железистых источниках различного генезиса 68
Глава 5. Выделение и характеристика новых нейтрофильных литотрофных железоокисляющих бактерий 71
5.1. Новые литотрофные железобактерии из железистых источников различного происхождения 71
5.2. Характеристика штамма Sp-1 76
5.3. Характеристика штамма Hfl 82
5.4. Анаэробный метаболизм F. denitrificans и Н. siderophila 89
Глава 6. Роль микроорганизмов в окислении Fe(II) в природных водах минеральных железистых источников различного генезиса 98
6.1. Фракционирование стабильных изотопов 5 5 Fe в культурах железобактерий в микроаэробных и анаэробных условиях 98
6.2. Изотопный состав железа в образцах воды источников, прилегающих болот и в железистых осадках 100
6.3. Фракционирование стабильных изотопов 56/54Fe в модельных экспериментах 100
Заключение 107
Выводы
Список литературы
- Аэробные железоокисляющие микроорганизмы
- Моделирование процессов бактериального и химического окисления Fe(II) в воде источников
- Соленый источник
- Характеристика штамма Hfl
Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность к окислению восстановленных соединений железа присуща многим прокариотным организмам различных таксономических групп, обладающих разными типами обмена веществ. Представители железоокисляющих микроорганизмов встречаются в доменах Bacteria, Archaea и даже в домене Eucarya (Halberg & Johnson, 2001). Наиболее изучены представители литотрофных ацидофильных железобактерий, а также органогетеротрофные железобактерии, широко распространенные в пресных водоемах и осадках, обогащенных органическим веществом. С 90-х годов двадцатого столетия начались интенсивные исследования практически неизвестной группы нейтрофильных литотрофных железобактерий. Первым ее представителем была описанная еще в XIX веке Эренбергом Gallionella ferruginea (Ehrenberg, 1836). Согласно концепции С.Н. Виноградского, G. ferruginea является типичным аноргоксидантом, ассимилирующим углекислоту в процессе хемосинтеза (Виноградский, 1888, 1922). Однако, убедительные доказательства хемолитоавтотрофного метаболизма для G. ferruginea были получены лишь в 1991 году (Halbeck & Pedersen, 1991). Публикации о представителях другой новой группы - литотрофных анаэробных железобактерий, способных к окислению Fe(II) за счет использования нитратов в качестве акцептора электронов, появились только в конце 90-х годов.
Из-за трудностей выделения и культивирования группа нейтрофильных литотрофных анаэробных железобактерий слабо изучена в физиологическом и таксономическом плане. За последние 20 лет были описаны, но остаются до сих пор невалидированными три вида, относящиеся к классам Alpha- и Betaproteobacteria, и один вид описан в качестве единственного представителя нового класса Zetaproteobacteria. Ряд выделенных штаммов до сих пор не идентифицирован в таксономическом отношении. Немногочисленные экологические исследования указывают на участие литотрофных нейтрофильных железобактерий в образовании оксидов железа в специфических природных условиях, таких как глубоководные морские гидротермы (Горшков и др., 1992; Emerson & Moyer, 2002; Edwards et al, 2003), железистые осадки, образуемые на выходе глубинных подземных вод на дневную поверхность (Emerson & Moyer, 1997; Sobolev & Roden, 2004), ризосфера корней растений (Emerson et al, 1999). Исследование функциональной роли нейтрофильных железобактерий в природных экосистемах осложняется неустойчивостью соединений Fe(II) в водах со слабо кислыми, нейтральными и слабо щелочными значениями рН, при которых доминируют аэробные процессы химического окисления. Известно также, что химическое окисление Fe(II) слабо выражено при низком окислительно-восстановительном потенциале в
микроаэробных или анаэробных условиях среды - подобные условия характерны для ряда экосистем современных и древних водоемов.
В связи с вышесказанным, исследование процессов анаэробного окисления Fe(II) представляет большой теоретический интерес для выяснения генезиса и условий происхождения как современных, так и древних осадочных отложений докембрия (полосчатых руд = BIF) и рудных отложений более поздних геологических эпох. Следует указать также, что немаловажное практическое значение могут иметь биологические реакции анаэробного окисления Fe(II) в процессах коррозии металлических конструкций и оборудования систем водоснабжения, нефтедобычи и, вероятно, других крупномасштабных технологических процессов.
Одним из подходов к оценке роли биологических процессов в окислительных
реакциях геохимического цикла железа может быть применение методов
фракционирования стабильных изотопов Fe, которые дают ценную информацию
для сравнительной характеристики бактериального и химического окисления Fe(II),
а также позволяют судить о скорости и масштабах их геохимической активности.
Имеющиеся сведения по фракционированию стабильных изотопов Fe
немногочисленны из-за слабой изученности природы механизмов фракционирования железа вследствие высоких скоростей химических реакций окисления Fe(II) в условиях нейтральной кислотности сред в континентальных и океанических водоемах (Anbar, 2004). Большое значение имеет возможность использования стабильных изотопов железа в качестве маркеров для расшифровки и понимания происхождения осадочных руд Докембрия Земли и при изучении марсианских отложений железа (Beard et al., 1999; Anbar, 2004).
Настоящая работа направлена на исследование литотрофных микроорганизмов, участвующих в процессах анаэробного окисления Fe(II), и выяснение их функциональной роли в различных водных экосистемах.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании представителей нейтрофильных литотрофных железобактерий и выяснении их распространения и роли в окислении Fe(II) в минеральных железистых источниках различного генезиса.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.
-
Исследование распространения, численности и доминирующих форм литотрофных железобактерий в источниках различного происхождения.
-
Исследование новых нейтрофильных литотрофных железобактерий, их метаболизма и таксономического положения.
3. Выяснение роли литотрофных железобактерий в процессах окисления железа в природных условиях, а именно:
а. Определение вклада железобактерий в трансформацию состава стабильных
изотопов железа в низкотемпературных минеральных источниках различного
происхождения и в культурах железобактерий;
б. Сравнительная оценка скоростей биогенных и абиогенных процессов
окисления железа в воде минеральных железистых источников с использованием
методов фракционирования стабильных изотопов Fe.
Научная новизна работы. Выделено 6 штаммов нейтрофильных литотрофных факультативно анаэробных железобактерий, среди них 4 неизвестных ранее вида железобактерий, и два штамма, относящихся к ранее описанным видам, для которых способность к окислению Fe(II) нами показана впервые. Штамм Sp-І описан в качестве единственного представителя нового рода Ferrovibrio denitrificans gen. nov., sp. nov. в пределах класса Alphaproteobacteria. Галотолерантный штамм Hfl, выделенный из солоноводного источника, описан в качестве нового вида Hoeflea siderophila sp. nov. рода Hoeflea в пределах класса Alphaproteobacteria. Результаты исследований расширяют представления об условиях распространения, видовом и физиологическом разнообразии нейтрофильных литотрофных железобактерий в железистых природных водах различного происхождения.
В работе был применен метод фракционирования стабильных изотопов железа с целью оценки скоростей и роли бактериальных процессов окисления Fe(II) по сравнению с абиогенным в воде железистых минеральных источников. Сопоставление величин скоростей окисления, эффекта фракционирования изотопов железа (обогащения оксидов железа легким изотопом) в источниках и бактериальных культурах по сравнению с химическими процессами свидетельствует о превалирующей роли биогенного фактора в окислительных реакциях геохимического цикла железа в исследованных водных экосистемах.
Практическая значимость. Работа расширяет фундаментальные представления об условиях местообитания и видовом разнообразии нейтрофильных литотрофных железобактерий и функциональной роли биологических окислительных реакций геохимического цикла железа в пресноводных и солоноводных экосистемах. Полученные результаты могут быть использованы в соответствующих разделах учебных программ по микробиологии и экологии.
Апробация работы. Результаты диссертации были изложены на международных и российских конференциях:
III и IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты микробиологии» (Москва, 2007, 2008).
12 Международном симпозиуме «Microbial Ecology», ISME, 2008 (Австралия,
2008).
7 Международном симпозиуме «Subsurface Microbiology», ISSM, 2008 (Япония,
2008).
Публикации. Материалы диссертации содержатся в 9 печатных работах: 5 экспериментальных статьях и 4 тезисах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов, изложенных на 131 страницах машинописного текста и содержит 13 таблиц, 21 рисунок и список литературы из 205 наименований, из них 44 отечественных и 161 иностранных работ.
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН под руководством д.б.н., проф. Дубининой Г. А. Молекулярно-биологическая часть работы проводилась в лаборатории всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (Пущино) под руководством к.б.н. Акимова В.Н. Измерение стабильных изотопов железа проводили в ИБВВ РАН (Борок) и в Геофизической обсерватории "Борок" -филиал ИФЗ РАН (Борок).
Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Осипову Г.А., к.х.н. ГапеевойМ.В., Долотову А.В., к.б.н. Кострикиной Н.А., к.б.н. Черноусовой Е.Ю., к.б.н. Детковой Е.А., к.б.н. Лысенко A.M. за помощь на отдельных этапах работы. Автор выражает особую благодарность научному руководителю д.б.н., проф. Дубининой Г.А. и д.б.н. Сорокину Д.Ю. за полезные советы и поддержку на всех этапах работы.
Аэробные железоокисляющие микроорганизмы
Ацидофильные железоокисляющие прокариотические микроорганизмы участвуют в окислении Fe(II) в кислых железистых водах: зон выветривания сульфидных минералов; болот, где происходит окисление пирита подстилающих пород; в источниках и озерах, встречающихся в зонах активного вулканизма. Такие экологические ниши характеризуются низкими значениями рН в результате накопления серной кислоты, которую образуют ацидофильные организмы при окислении соединений серы. В этих условиях соединения двухвалентного железа находятся в стабильной химической форме, что благоприятствует развитию железоокисляющих ацидофильных микроорганизмов.
В условиях среды при рН 4 ацидофильные организмы используют в качестве основных энергетических субстратов растворимые соединения Fe(II), которые окисляются в реакции: 4Fe2+ + 02 + 4ІҐ - 4Fe3+ + 2Н20 [2] Первый вид ацидофильных железоокисляющих бактерий -Acidithiobacillus ferrooxidans был открыт в конце 1940 года Колмером (Colmer et ah, 1950). Позднее были выделены и описаны новые многочисленные виды ацидофильных железобактерий, относящиеся к разным родам и классам в пределах доменов Bacteria и Archaea. Ацидофильные аэробные микроорганизмы, окисляющие Fe(II) В составе филы Proteobacteria. Среди представителей класса Betaproteobacteria известны только два вида ацидофильных железобактерий: один с невалидированным названием: Ferrovum myxofaciens - экстремальный ацидофильный микроорганизм (Kimura et al, 2011) и штамм Thiomonas spp. - умеренно ацидофильный организм, способный расти как гетеротрофно, с использованием ряда органических соединений, так и автотрофно, ассимилируя СОг в цикле Кальвина (Halberg & Johnson, 2001). Долгое время считалось, что единственным донором электронов при автотрофном росте у данного микроорганизма служат соединения серы, однако в 2001 г. была показана его способность окислять соединения Fe(II) (Dennison et al, 2001).
К классу Gammaproteobacteria относят представителей рода Acidithiobacillus: At. thiooxidans, At. ferrooxidans, At. caldus, At. ferriovorans. Эти грамотрицательные микроорганизмы, ранее входившие в род Thiobacillus, были выделены в новый род на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (Kelly & Wood, 2000). At. thiooxidans и At. ferrooxidans играют ведущую роль в биовыщелачивании металлов, являясь активными серо- и железоокислителями при температурах 30С (Каравайко, 1989; Кондратьева 1996). Ацидитиобациллы, растущие при температурах 40-52С, относят к At. caldus. Этот вид является автотрофом, использует восстановленные соединения серы в качестве источника энергии, однако, в отличие от At. thiooxidans, может расти в миксотрофных условиях при добавлении в среду глюкозы или дрожжевого экстракта (Halberg & Johnson, 2001). У видов At. ferriovorans и At. ferrooxidans, отличающихся по ряду физиологических признаков, были обнаружены разные пути окисления Fe(II) (Hallberg et al, 2010, Amouric et al, 2011).
Также в состав класса Gammaproteobacteria входят Acidiferrobacter thiooxydans - выделенный в 1982 году Харрисоном, который был отнесен сначала к Thiobacillus ferrooxidans (штамм m-1), но полностью его описали гораздо позже (Hallberg et al, 2011), и один микроорганизм с невалидированным названием - Thiobacillus prosperus , главной особенностью которого является устойчивость к хлориду натрия. Он выдерживает концентрацию NaCl до 3.5%, тогда как рост большинства железоокисляющих ацидофильных бактерий ингибируется 1% NaCl (Nicolle etal, 2009).
В составе филы Actinobacteria.
В настоящий момент известны три железоокисляющих представителя: Acidimicrobium ferrooxidans - умеренный термофил, способный ассимилировать диоксид углерода, преимущественно развивается в смешанной культуре с Sulfobacillus sp. (Clark & Norris, 1996), Ferromicrobium acidiphilum - типичный мезофил, предпочитающий образовывать синтрофные ассоциации с At. thiooxidans (Halberg & Johnson, 2001), Ferrithrix thermotolerans - экстремально ацидофильный гетеротрофный нитчатый микроорганизм способный окислять Fe(II) и восстанавливать Fe(III) (Johnson et. al, 2009).
В составе филы Firmicutes.
К филе Firmicutes относятся только виды одного рода Alicyclobacillus. Ранее род был представлен термоацидофильными строго аэробными гетеротрофными спорообразующими бактериями и включал три вида: Alb. acidocaldrius, Alb. acidoterrestris и Alb. cycloheptanicus (Wisotzkey et al., 1992). За последние годы были описаны еще шесть новых видов: Alb. hesperidum (Albuquerque et al, 2000), Alb. herbarius (Goto et al, 2002), Alb. acidiphilus (Matsubara et al, 2002), Alb. sendaiensis (Tsuruoka et al., 2003), Alb. pomorum (Goto et al, 2003), Alb. tolerans и Alb. disulfidooxidans (Karavaiko et al, 2005).
В составе филы Nitrospirae. Среди представителей филы Nitrospirae Fe(II) окисляют только представители рода Leptospirillum, образующие отдельный филогенетический кластер. К этому роду относят три вида, имеющие практическое значение для биогидрометаллургии: L. ferrooxidans -мезофильный, строгий хемолитоавтотроф, способный к диазотрофии (Рагго & Moreno-Paz, 2003), L. thermoferrooxidans и L. ferriphilum аэробные организмы с хемолитотрофным типом метаболизма, которые способны
Моделирование процессов бактериального и химического окисления Fe(II) в воде источников
Первое предположение об участии железоокисляющих бактерий в образовании железных руд было высказано в XVIII веке при обнаружении Gallionella в образцах осадков ручья (Ehrenberg, 1836). С.Н. Виноградский считал, что «колоссальные отложения железных руд обязаны своим происхождением деятельности железобактерий». Гипотеза биогенного образования железных руд, признававшая железобактерии важным фактором рудообразования, была поддержана рядом исследователей. Железоокисляющие бактерии рассматривали не только как специфические катализаторы окисления, но и как концентраторы рудных элементов. Однако в середине шестидесятых годов эта теория столкнулась с рядом возражений со стороны геологов, отрицающих участие железоокисляющих бактерий в процессах образования осадочных месторождений железистых руд. Сущность возражений сводилась, главным образом, к тому, что рудообразующие элементы, а именно Fe(II), поступает в места формирования конкреций уже в окисленной форме, следовательно, отсутствуют условия для окислительной деятельности железобактерий, которые не способны участвовать в формировании руд (Страхов и др., 1968; Волков и Севастьянов, 1968). Однако в 50-х годах не была известна огромная роль биологического восстановления Fe(III) до Fe(II), определяющая циклический характер процессов биологического окисления и редукции железа в донных осадках водоемов. Огромный вклад в эту область исследований внесли работы Перфильева с соавторами, им удалось показать непосредственное участие железобактерий на начальных стадиях рудообразования в раннем диагенезе осадков иловых отложений в пресных карельских железорудных озерах, генетически связанных с зоной выхода фенно-скандинавского кристаллического щита. Было доказано, что окисление Fe(II) и восстановление Fe(III) при формировании вторичного микрозонального профиля в изолированных пробах ила протекает исключительно за счет деятельности микроорганизмов (Перфильев и Габе, 1964; Перфильев, 1972). Убедительные доказательства важнейшей роли микробиологических процессов в окислении и седиментации оксидов железа в донные отложения пресных водоемов были получены в результате многочисленных исследований на пресных водоемах различного типа, проведенные Дубининой Г.А. с соавторами, обобщенные в монографии «Экология водных микроорганизмов» (Горленко и др., 1977).
Большой вклад в представления о происхождении осадочных месторождений железа внесли геохимические и минералогические исследования, выполненные совместно с микробиологами. Было установлено, что протоферригидрит и ферригидрит - предшественники основных минералов осадочных отложений железа - гематита и сидерита, являются продуктами жизнедеятельности железобактерий (Чухров и др., 1973; Чухров, 1975; Балашова, 1974). Сходные результаты получены при комплексных исследованиях железистых отложений связанных с гидротермальными процессами в океанических условиях (Богданова и др., 1990; Горошков и др., 1992). Согласно представлениям геологов, в зависимости от геологических условий ферригидрит рассеивался в осадочных толщах или накапливался с образованием рудных отложений в виде гематита, а при наличии органического вещества переходил в сидерит. Немногочисленные исследования, подтвердившие биологическое происхождение ферригидрита в зоне гипергенеза континентальных и морских условиях, позволили ведущим отечественным геологам признать огромную роль железобактерий в образовании осадочных железистых руд, начиная с докембрия (Чухров, 1975).
Окислительная трансформация соединений Fe(II) при нейтральных значениях кислотности природных сред в континентальных и морских водоемах может протекать с высокой скоростью как за счет биогенных процессов в аэробных и анаэробных условиях с участием нейтрофильных железобактерий, так и абиогенных химических реакций. Ввиду высокой скорости химических окислительных реакций в присутствии кислорода, разноречивости результатов исследований по соотношению скоростей процессов биологического и химического окисления железа в зависимости от физико-химических условий в водной среде (Emerson et al, 2000; Picardal, 2012) и недостаточности сведений, оценка сравнительного вклада биогенных и абиогенных процессов в образовании осадочных отложений окисленного железа Fe(III) в осадках как современных, так и древних водоемов представляется сложной задачей (Anbar et al, 2004; Balci et al, 2006; Weber et al, 2006; Picardal, 2012).
Согласно палеоэкологическим исследованиям (Cloud, 1973) формирование докембрийских формаций железа, полосчатых железо-силикатных руд (Precembrian iron formation = BIF) началось в периоды позднего Архея и раннего Протерозоя, 2.5-2.7 млн. лет назад. Ранние модели формирования BIF связывали с окислением Fe(II) за счет абиотических процессов фотохимического окисления. Позже значительная роль была отведена также процессам оксигенного фотосинтеза с участием цианобактерий. В последнее два десятилетия для объяснения генезиса BIF были привлечены микробиальные процессы анаэробного окисления растворенного в океанической воде Fe(II), поскольку кислород в атмосфере появился позже, около 2.5 млн. лет назад, а масштабы его образования аэробными фототрофами не могли обеспечить глобальные процессы аэробного окисления Fe(II). В настоящее время более обоснованной представляется модель формирования BIF, где главентствующая роль отводится процессам осаждения железа с участием аноксигенных фототрофов (Widdel et al, 1993; Kappler et al, 2005 и др.) и анаэробных нитратзависимых железобактерий (Chaudhuri et al, 2001). Для нитратзависимых железобактерий показано, что анаэробное окисление Fe(II) сопровождается осаждением значительного количества внеклеточных минералов магнетита (Fe304) и гематита (Fe203), основных рудных комонентов BIF (Chaudhuri et al, 2001). Аноксигенное фототрофное окисление Fe(II) приводит к образованию слабо кристаллических оксидов Fe(III), которые в дальнейшем могут трансформироваться в гематит и магнетит с участием железоредукторов (Lovley, 2004). Таким образом, современная модель формирования BIF включает три основных биогенных анаэробных процесса окисления Fe(II) осуществляемых: 1) нитратзависимыми железобактериями; 2) аноксигенными фототрофами; 3) железоредуцирующими микроорганизмами.
В последнее десятилетие возрос интерес к исследованию стабильных изотопов железа при изучении геохимических и биогеохимических процессов. Этот интерес диктуется, прежде всего, возможностью использования изотопов железа в качестве биомаркеров (biosignature) для расшифровки и понимания происхождения современных и древних докембрийских осадочных железистых руд Земли, а также при изучении марсианских отложений железа (Beard et al, 1999; Anbar et al, 2000; Bullen et al, 2001; Beard et al, 2003; Croal et al, 2004; Tangalos et al, 2010). Однако современный уровень знаний по фракционированию стабильных изотопов железа не позволяет достаточно надежно интерпретировать получаемые результаты. В значительной степени это обусловлено недостатком сведений о механизмах абиогенных и биологических процессов дифференциации изотопного состава соединений в трансформации различных форм железа. Немногочисленны также сведения о факторах, контролирующих дифференциацию изотопного состава соединений железа в процессах, протекающих в природных средах. Эта задача остается одной из главных при оценке вклада биологических процессов в окислительных звеньях геохимического цикла железа в различных экосистемах.
Соленый источник
Таким образом, выделенный штамм нейтрофильной факультативно анаэробной железобактерии имеет ряд общих фенотипических свойств с представителями рода Hoeflea. Однако сравнительный анализ фено- и генотипических исследований, показывает, что штамм Hfl отличается от типового вида и двух других известных видов. Следует отметить, что у штамма Hfl, так же как и у фототрофной бактерии Н. phototrophica в клетках обнаружены гены pufL, pufM бакетриохлорофилла а, но пигмент бакетриохлорофилла а и способности к фототрофному росту не удалось обнаружить (табл. 6). Из наиболее важных физиологических отличий необходимо отметить способность к литотрофному росту с использованием соединений Fe(II) в качестве донора электронов и возможность анаэробного роста с использованием NO3 в качестве акцептора электронов, а также различия в количественном составе доминирующих жирных кислот и в содержании Г+Ц в ДНК. Уровень различий нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК с ближайшими видами рода Hoeflea составляет 1.8-1.5%, что подтверждает видовую независимость исследуемого штамма.
Таким образом, результаты исследований фено-, хемотаксономических свойств и филогенетического анализа штамма Hfl свидетельствуют о видовой независимости от ближайших представителей рода Hoeflea и позволяют описать его в качестве нового вида рода Hoeflea в пределах семейства Phyllobacteriaceae порядка Rizobiales класса Alphaproteobacteria. Новый вид назван Hoeflea siderophila sp. nov..
Таксономическое описание Hoeflea siderophila sp. nov. [Si.de.ro phi.la. L. n. sidero железо; N. L. masc. adj. philus любить; N. L. fem. adj. siderophila железолюбивая]. Тонкие слегка изогнутые палочки 0.4 х 0.9-2.2 мкм с одним полярно расположенным жгутиком. Размножаются бинарным делением, способны к образованию розеток. Клеточная стенка грамотрицательного типа. Факультативные анаэробы. Оптимальные значения и пределы роста: рН 7.5 (6.2-8.5), температура 30С (9-38С), соленость среды 1% (0.1-8.5%). Способны к органотрофному и миксотрофному росту с использованием Fe(II) в качестве донора электронов, за счет редукции N03 и N20, с образованием оксидов железа на поверхности клеток. В клетках обнаружена оксидазная активность и низкая каталазная активность. При аэробном органотрофном росте штамм Hfl использовал в качестве источника углерода ацетат, сукцинат, цитрат, лактат, малат, фумарат, пропионат, пируват, бутират, пропанол, глицерин, широкий спектр Сахаров, таких как рибоза, ксилоза, арабиноза, глюкоза, фруктоза, L-сорбоза, галактоза, D-манноза, 2-дезоксиглюкоза, сахароза, D-лактоза, трегалоза, D-мальтоза, целлобиоза, мелибиоза, декстроза, мелицитоза, Р-раффиноза, L-рамноза, ЦСНз-глюкозид, D-глюкуроновая кислота, мезоинозит, М-эритрит, L-арабинит, D-глюкозамин, N-ацетилглюкозамин, а также декстрин, гликоген, дрожжевой экстракт, пептон. Слабый рост происходил в средах с некоторыми аминокислотами: фенилаланином, триптофаном, гистидином. Бактерии не использовали: оксалат, формиат, бензоат, этанол, бутанол, пролин, лейцин, аланин, аспарагин, глутамин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, гидролизат казеина. Источники азота - аммонийные соли, NC»3 , N20, мочевина, дрожжевой экстракт, пептон. Не использовали NO2-, гистидин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, гидролизат казеина. Не способен к анаэробному росту с CIO4 , S0, ЭгОз2", Fe(OH)3 в качестве акцепторов электронов. При росте на минеральной среде Нг не мог служить в качестве донора электронов. Преобладающие жирные кислоты клеток: 11-октадеценовая (18:1со7с) 60.48%, гексадекановая (16:0) 14.65%, 11-метил-октадеценовая (11-Methyl 18:1со7с) 10.94%). Чувствительны к полимиксину, рифампицину и тетрациклину и устойчив к амикацину, бацитрацину, канамицину, микостатину и пенициллину.
Типовой штамм Hfl депонирован в GenBank под номером EU670237 и помещен в коллекции DSM 21587т, VKM А7094т. Выделен из солоноводного источника курорта Старая русса Новгородской области, Россия.
Физиолого-биохимические исследования окисления Fe(II) у новых представителей железобактерий были проведены при культивировании в анаэробных условиях, хотя оба вида обладали способностью использовать 02 в качестве акцептора электронов при окислении Fe(II) в микроаэробных условиях. Это было вызвано необходимостью избежать конкуренции с процессами быстрого химического окисления Fe(II) в опытах.
Биохимический анализ ферментов, участвующих в цепи последовательных реакций восстановления нитрата при окислении Fe(II), показал существенные различия в их активности. Так, активность нитратредуктазы у Н. siderophila составляла 30 нмоль в мин/мг белка, а нитритредуктазы была в 50 раз ниже и не превышала 0.6 нмоль в мин/мг белка. Сходная картина отмечена у F. denitrificans: при активности нитратредуктазы 46 нмоль в мин/мг белка, активность нитритредуктазы составляла 1.4 нмоль в мин/мг белка, т.е. в 30 раз ниже.
Характеристика штамма Hfl
Несмотря на интенсивно проводившиеся исследования литотрофных железоокисляющих микроорганизмов за последние два десятилетия, информация о видовом разнообразии, распространении и их функциональной роли в окислительных реакциях геохимического цикла железа остается ограниченной. К началу наших исследований были известны лишь микроаэрофильные литоавтотрофные нейтрофильные железобактерии рода Gallionella и несколько неидентифицированных штаммов одноклеточных факультативно анаэробных литотрофных железобактерий.
Анализ разнообразия железобактерий и специфики состава литотрофных железобактерий в исследуемых экосистемах в воде и осадках железистых источников определяются условиями местообитания, прежде всего, кислородным режимом. Доминирующими железобактериями во всех источниках различного происхождения и химического состава вод были одноклеточные литотрофные железобактерии различных таксономических групп. Их численность в свежеосажденных осадках составляла 10-10 кл/мл. В отдельных экосистемах, при повышенной концентрации Ог не более 1 мг/л, отмечено массовое развитие в осадках микроаэрофильных литоавтотрофных железобактерий рода Gallionella (болота, источники №8 и №4). Известные представители гетеротрофных железобактерий не были обнаружены в источниках ввиду чрезвычайно низкой продуктивности систем и низких концентраций доступных органических веществ в глубинных водах на выходе на дневную поверхность.
При решении вопросов о роли биогенного фактора в процессах окисления Fe(II) и в дифференциации изотопного состава в ходе образования оксидов Fe(III) в работе был использован комплексный подход, сочетающий одновременное исследование качественного состава сообществ и численности микроорганизмов, участвующих в трансформации соединений железа, их активности в дифференциации изотопного состава окисляемого
Fe(II), а также специфики метаболизма выделенных доминирующих в сообществе представителей групп нейтрофильных литотрофных железобактерий. В значительной степени решению поставленных задач способствовало изучение процессов окисления железа в природных водоемах и влияния на них физико-химических факторов водной среды. Эти задачи выполнялись с использованием серии модельных экспериментов и применением ингибиторного анализа для дифференциации процессов биогенной и абиогенной природы.
В ходе исследований из различных минеральных источников методом предельных разведений исследуемых образцов на питательных средах были выделены 6 чистых культур, доминирующих в сообществах представителей литотрофных железобактерий. Большинство из них, на основании результатов филогенетического анализа представляли новые таксоны уровня рода (2 штамма) или вида (2 штамма). Проведенное детальное исследование двух штаммов с использованеим фено-, генотипических и хемотаксономических характеристик позволили описать новый род Ferrovibrio gen. nov. с новым видом Ferrovibrio denitrificans sp. nov. и новый вид Hoeflea siderophila sp. nov. в пределах класса Alphproteobacteria.
Способность к окислению Fe(II) при миксотрофном росте обнаружена еще у четырех штаммов, в том числе у двух штаммов, принадлежащих к ранее описанным видам, для которых это свойство не было известно.
Исследование метаболизма новых видов F. denitrificans и Н. siderophila показало, что они обладают широкими метаболическими возможностями и способны, помимо органотрофного, к миксотрофному росту в микроаэробных и анаэробных условиях, в последнем случае за счет восстановления окисленных соединений азота, NO3- или N2O.
Результаты физиолого-биохимических исследований анаэробного метаболизма новых видов привели к заключению о функционированию в клетках «разорванной» цепи денитрификации, когда вследствие больших различий, в 30-50 раз, в активностях ферментов нитрат- и нитритредуктазы, протекает лишь первый этап восстановления NC»3 до NOV с одновременным ингибированием клеточного роста образующимся нитритом. Однако клетки обоих видов активно росли анаэробно органотрофно или литотрофно за счет окисления Fe(II) при замене N03 на N20 в качестве акцептора электронов, восстанавливая N2O до N2. Анализы результатов модельных экспериментов по фракционированию 56/54-п изотопного состава Fe в исследованных водных экосистемах показали, что дифференциация и скорость окисления Fe(II) определяется, по меньшей мере, двумя основными факторами: механизмом окислительных реакций (биологических или химических) и окислительной обстановкой внешней среды. Во всех случаях в культурах железобактерий и в опытных вариантах модельных систем эффект «облегчения» изотопного состава Fe был в 1.3-8.8 раз выше (в зависимости, главным образом, от кислородного режима) по сравнению с вариантом химического окисления. Максимальный эффект фракционирования стабильных изотопов железа отмечен в культурах железобактерий 4.7-8.8 раз, в отсутствие химического окисления Fe(II) в анаэробных условиях. Сопоставление величин эффекта изотопного фракционирования железа и обогащения осадков оксида железа легким изотопом 54Fe в природных осадках источников месторождения «Марциальные воды» и Старорусского источника и в прилегающих болотах с полученными в модельных экспериментах и в культурах железобактерий свидетельствуют о превалирующей роли микробиологического фактора по сравнению с абиогенными окислительными процессами в дифференциации изотопного состава отложений окисленных соединений железа, а также в скорости процессов окислительной ветви геохимического цикла железа в современных водных системах, обогащенных растворенным железом.
