Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Классификация и свойства флавоноидов 8
1.1.1. Природа флавоноидов 8
1.1.2. Классификация флавоноидов 9
1.1.3. Свойства флавоноидов 15
1.1.4. Факторы, влияющие на состав ФС в растениях 16
1.2. Активные формы кислорода и антиоксидантная защита в растениях 19
1.2.1. Общая характеристика и свойства форм активированного кислорода 20
1.2.2. Активные формы кислорода в онтогенезе растений 24
1.2.3. Участие фенольных соединений в защите от окислительного стресса 25
1.2.4. Влияние абиотических и биотических факторов на окислительную активность ФС 29
1.2.5. Синергизм ФС с другими антиоксидантами 32
1.3. Мутуалистические взаимодействия бактерий с растениями ...34
1.3.1. Этапы симбиотического взаимодействия 34
1.3.2. Эволюционные и генетические аспекты совместимости Rhizobiaceae с растением-хозяином. 36
1.3.3. Синтез Nod-фактора 39
1.3.4. Флавоноиды как коиндукторы нодуляции 42
1.3.5. Влияние температуры и других абиотических факторов на симбиоз ...47
1.4. Иммунные аспекты растительно-бактериального взаимодействия 50
1.4.1. Взаимодействия растений с патогеном... 50
1.4.2. Ответы растений- симбионтов, сходные с защитными реакциями 52
1.4.3. Участие ФС в иммунных реакциях растений 53
1.5. Выводы из обзора литературы и постановка задач 57
2. Материалы и методы 60
3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Исследование количественного и качественного состава ФС в корнях этиолированных проростков гороха 71
3.1.1. Количественный и качественный состав ФС в корнях проростков гороха и влияние температуры выращивания растений 72
3.1.2. Влияние роста и развития растения на содержание в корнях ФС 83
3.1.3. Влияние инфицирования ризобиями на количественный и качественный состав ФС в корнях гороха 86
31.4. Исследование ФС в разных зонах корня 93
3.3. Изучение динамики ПОЛ в корнях проростков гороха при инокуляции nxRhizobium leguminosarum 98
3.3.1. Динамика ПОЛ в корнях, при оптимальной температуре выращивания растений 99
3.3.2. Динамика ПОЛ в корнях при пониженной температуре выращивания растений 103
3.2. Исследование анти- и прооксидантных свойств ФС корней гороха 105
3.2.1. Влияние ФС на неиндуцированное окисление лецитина ...108
3.2.2. Влияние ФС на окисление лецитина, индуцированное аскорбатом железа 108
3.3.3. Исследование способности ФС перехватывать супероксидный радикал 112
3.3.4. Исследование прооксидантной активности ФС 115
3.3.5. Взаимодействие ФС с ионами металлов переменной валентности.. 117
3.3.6. Исследование окислительной активности маркерных соединений. 120
4. Заключение 124
5. Выводы 129
6. Литература 131
- Активные формы кислорода и антиоксидантная защита в растениях
- Мутуалистические взаимодействия бактерий с растениями
- Влияние инфицирования ризобиями на количественный и качественный состав ФС в корнях гороха
- Влияние ФС на окисление лецитина, индуцированное аскорбатом железа
Введение к работе
Взаимоотношения высших растений и почвенных микроорганизмов Rhizobiaceae являются одной из интереснейших и сложнейших проблем. Некоторые из этих ассоциаций полезны для растений, т.к. способствуют фиксации атмосферного азота. В тоже время, другие формы бактерий, например, Agrobacterium tumefaciensвызывают заболевания. В дополнение к очевидной агрономической важности изучения растительно-бактериальных взаимодействий, интересно, что симбиотическая ассоциация основана на молекулярном диалоге партнеров: передаче сигнальных молекул и активации специфических генных систем. Известно, что ключевой сигнальной единицей растительно-микроорганизменного симбиоза являются молекулы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (в дальнейшем мы условно объединим их в термин «фенольные * соединения», сокращенно - ФС). Некоторые из этих ФС, выделяемые в ризосферу корнями растения хозяина, являются хемоаттрактантами, другие участвуют в экспрессии ризобиальных nod- генов (Geurts, Fransen, 1996; Morris et al., 1998; Тихонович, Проворов, 1998).
При инфицировании как патогенными, так и симбиотическими микроорганизмами, в тканях растений повышается уровень перекиси и супероксидного радикала (Аверьянов, Лапикова, 1988; Ramu et al., 2002). Это должно привести к усилению перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Меньшикова, Зенков, 1993). Ограничить или усилить пероксидацию могут липофильные соединения, находящиеся в области мембран, в том числе ФС. Фенольные антиоксиданти эффективно ингибируют Ог\ 02\ ОН' и индуцированное им ПОЛ (Рогинский, 1988). По современным представлениям, значение имеют два основных механизма влияния ФС на свободно-радикальные процессы в качестве антиокисидантов. Один из них- это перехват свободных радикалов. Он приводит к образованию нерадикальных продуктов. Такого плана процессы происходят при образовании лигнина (Рогинский, 1988) и полимеризации флаванов (Li, Xie, 2000). Второй механизм — это связывание ионов металлов с переменной валентностью, инициирующих окисление органических соединений (Владимиров, Арчаков, 1974). При взаимодействии с радикалами основную роль играют ароксильные ОН- группы ФС (Рогинский, 1988).
Одни и те же ФС могут проявлять анти- и прооксидантную активность в зависимости от ситуации. Так подщелачивание среды способствует их аутоокислению (Аверьянов, Лапикова, 1988), при этом возникает возможность генерации супероксидных радикалов. В среде окисления, содержащей ионы Fe, некоторые ФС могут успешно заменять аскорбат при генерации гидроксильных радикалов (Li, Xie, 2002).
Зависимость проявления окислительно-восстановительных свойств от рН среды, возможно, будет иметь значение в растительных клетках при взаимодействии с микроорганизмами. Известно, что в числе быстрых реакций при этих взаимодействиях происходит снижение потенциала мембран и изменение рН как во внеклеточном пространстве, так и в цитоплазме поверхностных клеток (Чиркова, 2002; Хадри, Бисселинг, 2002).
Учитывая все вышесказанное, можно предположить, что содержащаяся в чувствительных к инфекции клетках лабильная группа липофильных ФС может оказывать влияние на уровень свободных радикалов и, соответственно, ПОЛ при условиях изменения рН.
В связи с этим целью представляемой работы было изучение роли липофильных фенольных соединений корней этиолированных проростков Pisum sativum в регуляции перекисного окисления липидов на начальном этапе симбиотического взаимодействия с совместимым эндосимбионтом Rhizobium leguminosarum L. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи: исследовать количественный и качественный состав эндогенных липофильных фенольных соединений корней этиолированных проростков Pisum sativum и его изменения на первом этапе развития межорганизменного взаимодействия с бактериальным симбионтом Rhizobium leguminosarum; изучить влияние температурных условий выращивания растений на количественный и качественный состав и свойства липофильных фенольных соединений корней Pisum sativum; * 3) изучить динамику перекисного окисления липидов в корнях Pisum sativum в начальный период после инфицирования его бактериями Rhizobium leguminosarum; показать наличие у липофильных фенольных соединений в системе in vitro наличия анти- и прооксидантных свойств, которые, возможно, вносят определенный вклад в работу антиоксидантных систем растения; определить возможные пути реализации регуляторных свойств различных эндогенных липофильных фенольных соединений в окислительных процессах (хелатирование ионов металлов переменной валентности, скавенгирование свободных радикалов и т.д.) в корнях Pisum sativum на начальных этапах инфицирования Rhizobium leguminosarum.
Активные формы кислорода и антиоксидантная защита в растениях
Стресс (общий синдром адаптации по Г. Селье) представляет собой неспецифический компонент физиологических и патологических реакций живых систем, состояние напряжения, степень мобилизации систем поддержания гомеостаза на уровне организма, системы, органа, клетки, клеточных органелл (митохондриальный стресс) (Селье, 1972; Веселова и др., 1993). Стресс-) реакция развивается в ответ на воздействие необычных по качеству, силе или продолжительности раздражителей (высокая или низкая температуры, УФ свет, высокий радиоактивный фон, озон, засуха, физическое повреждение, инфицирование и т.д.). Таким образом, стресс представляет собой стереотипную, эволюционно древнюю, генетически детерминированную адаптационную реакцию живой системы, включающуюся в ответ на воздействие разнообразных экстремальных агентов. Сигналом для запуска стресс-реакции может служить стереотипное и биологически важное изменение внутренней среды клетки, организма. Таким сигналом может служить смещение оксидантно - антиоксидантного равновесия в направлении активации процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах. Переход клетки в состояние стресса инициирует более медленные гензависимые защитно-приспособительные реакции. Возрастает синтез низкомолекулярных антиоксидантов и антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, аскорбат-пероксидаза и т.д.). Накапливаются стресс-белки, полиамины, пролин и др. (Барабой, 1991). Начальным этапом в развитии ПОЛ является накопление активных форм кислорода (АФК) таких как синглетный кислород (J02), гидроксильный радикал (-ОН), гидропероксид (Н2О2), супероксидный анион-радикал (02). Существование и эволюция жизни в окислительных условиях возможны лишь благодаря выработке системы антиоксидантных механизмов, противодействующих процессу ПОЛ и сохранению на минимальном стационарном уровне количества его активных продуктов и липоперекисей. Подвижное равновесие между ПОЛ и активностью антиоксидантных механизмов присуще всем уровням организации живых систем. Оно смещено в сторону усиления антиоксидантных систем в состоянии физиологического покоя, обычной жизнедеятельности.
Под влиянием чрезвычайных (физиологических или патологических) раздражителей процессы биологического окисления, а так же ПОЛ закономерно усиливаются. Некоторое количество АФК необходимо для нормальной защиты, развития и жизнедеятельности организма, но их избыток потенциально вреден для большинства биологических макромолекул: нуклеиновых кислот, белков, мембранных липидов (Кул инский, 1999; Breusegen et al., 2001). Активирование Ог может осуществляться несколькими способами. Во-первых, обращением спина одного из неспареных электронов молекулярного кислорода происходит при оптическом возбуждении в фотореакциях, сенсибилизируемых красителями, что соответствует образованию синглетного кислорода. Другой важный путь «активирования» молекулярного кислорода связан с его одноэлектронным восстановлением: (акцептирование электрона с антипараллельным спином)- образование супероксидного аниона. Дальнейшая редукция кислорода происходит в несколько этапов. На первом этапе цепная реакция нуждается в инициации, последующие же шаги являются экзотермическими и могут протекать и спонтанно, и катализироваться. Это могут быть либо реакции с соседними молекулами (хотя с синглетами это происходит не всегда, т. к. в норме время их жизни гораздо короче, чем нужно для диффузии), либо они подвергаются внутренней реорганизации в долго живущие триплеты. Qz-ЧН) 02 " - Н202 — ОН +Н20 - 2 Н20 Первый шаг в редукции молекулярного кислорода - это образование гидроперекисного (Н02 ) радикала и супероксидного (02 ) анион-радикала. Время жизни для 02 " ==2-4 мкс. В связи с этим он способен удаляться на значительные расстояния от мест своего образования. Кроме того, 02" способен проникать через липидные мембраны. Супероксидный радикал имеет редокс потенциал -0,33 В и обладает как окислительными, так и восстановительными свойствами. Большая часть имеющихся экспериментальных данных свидетельствует о том, что этот радикал может непосредственно не обуславливать окислительные процессы в биологических субстратах и мембранах, а инициировать свободнорадикальвые состояния через другие формы активированного кислорода, возникающими вслед за 02 " (Byczkowski et al., 1998). Его реакционная способность зависит от среды и значительно более активна в апротонных растворителях по сравнению с водными растворами. Прямое воздействие супероксидного аниона с биологическими субстратами можно ожидать в мембранных структурах, или гидрофобных областях белков (Мерзляк, 1989). В водных же системах супероксидный анион и гидроперекисный радикал претерпевают дисмутацию до пероксида водорода и кислорода: Как уже отмечалось, при протонировании супероксидного аниона возникает Н02 радикал, который обладает более сильными окислительными свойствами (Gebicki, BielskL1981). Обычно при физиологических рН равновесие смещено в сторону образования супероксидного аниона. Тем не менее, в определенных условиях, в отдельных компартментах клетки, возникает некоторое количество гидроперекисного радикала. Перекись водорода, гидроперекисный и пероксильный анионы представляют собой нерадикальные продукты, возникающие в результате присоединения второго электрона к супероксидному аниону. При физиологических рН и гидропероксидный, и пероксильный анионы немедленно превращаются в Н2Ог (Byczkowski, Gessner, 1998). Перекись водорода обладает очень высокой стабильностью в водных растворах и в зависимости от условий может обладать как окислительными, так и восстановительными свойствами-(Halliwell, Gutteridge, 1984). Биологическая токсичность Н202 усиливается при наличии металлов и протекает в соответствии с реакцией Хабера-Вайса или Фентона (Lamb, Dixon, 1997)
Мутуалистические взаимодействия бактерий с растениями
Бобово-ризобиальное взаимодействие — это азотфиксирующий эндосимбиоз. Его формирование - сложный многостадийный процесс, подразделяемый на несколько этапов. 1. Размножение бактерий в ризосфере растения-хозяина. 2. Преинфекция. Происходит период взаимного узнавания партнеров и подготовки к формированию симбиотической системы. Растение в нано- или пикомолярных концентрациях начинает продуцировать специфические флавоноиды, которые активируют гены вирулентности (nod-rQHbi) ризобий. Nod-гекы кодируют синтез Nod-факторов (липохитоолигосахаридов), вызывающих у растения-хозяина скручивание корневых волосков и образование клубеньковой меристемы (Geurts, Fransen, 1996; Тихонович, Проворов, 1998). 3. Прикрепление ризобий к поверхности корневых волосков в месте резкого сгиба, при этом пектолитические ферменты растения разрушают клеточную стенку корневого волоска. 4. Проникновение бактерий в растение. Вокруг этих бактерий образуется инфекционная нить, стенки ее образованы клетками хозяина, а внутреннее пространство этой полости заполнено полисахаридами растения и микросимбионта (Martinez, 1994). 5. Далее происходит эндоцитоз ризобий из инфекционной нити внутрь клеток хозяина. В цитоплазме растительной клетки; симбиотические бактерии окружаются специальными перебактероидными мембранами (ПБМ), синтезируемыми в основном растительной клеткой и частично ризобиями (Тихонович, Проворов, 1998). Количество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растений: 5-10 у вигны, фасоли и сои, по одной у гороха, люцерны и клевера. Бактериальные клетки, окруженные общей ПБМ, называются симбиосомой и являются основной функционально-структурной единицей симбиоза (Roth, Stacey, 1989). 6. Ризобий в ПБМ преобразуются в особые симбиотические формы — бактероиды, имеющие в 3-5 раз большие размеры, чем саободноживущие бактерии (Werner, 1992). Все это способствует формированию азотфиксирующих клубеньков. Морфология и число клубеньков строго определяется растением-хозяином, что, возможно, связано с большой энергоемкостью их образования (Тихонович, Проворов, 1998). На поздних стадиях симбиоза проявляются такие важные для селекции растений признаки, как азотфиксирующая активность (скорость восстановления N2 в NH4+) и симбиотическая эффективность (способность растений интенсивно развиваться, используя симбиотрофное питание азотом). Каждый вид или биотип ризобий вступает в симбиоз с определенным кругом растений-хозяев, на основании чего выделен ряд групп перекрестной инокуляции.
Специфичность хозяина, проявляемая при образовании клубеньков, определяется обменом сигнальными молекулами между растениями и бактериями. Совместимость с потенциальным хозяином - это основная черта внутриклеточных паразитов и симбионтов. Бактерии должны обеспечить тесный контакт для прямого переноса частей генома в клетку растения. Микроорганизмам выгодно такое взаимодействие, но при этом им необходимо быстро прикрепиться к клеточной стенке хозяина. Там они могут инициировать морфологический ответ, благоприятный для их будущего размножения. И; растительным паразитам, и симбионтам необходимо или избегать, или подавлять иммунные ответы растений, такие как реакции; сверхчувствительности (СВЧ), которые препятствуют их распространению и размножению (Sequeira, 1984). Совместимые взаимодействия между растениями и бактериями изучены в деталях только в двух системах семейства Rhizobiaceae: галловая болезнь, вызываемая Agrobacterium tumefaciens и корневая нодуляция вызываемая различными видами Rhizobium в бобовых растениях-хозяевах. Эти два рода бактерий близко родственны и их взаимодействия с хозяевами часто протекают параллельно (Sequeira, 1984). Становление и функционирование бобово-ризобиального симбиоза является результатом комплементации генотипов партнеров. Установлено, что все этапы формирования такого симбиоза, а также его эффективность и азотфиксиругогцая активность контролируется генами обоих партнеров, причем «симбиотические» гены растений и бактерий связаны друг с другом тонкими регуляторными взаимодействиями. Симбиотическая ассоциация основана на молекулярном диалоге партнеров, который заключается в передаче сигнальных молекул и активации программ развития специфическими генными системами. Все это позволяет рассматривать совокупность генов партнеров, вступивших в симбиоз, как единую генетическую систему (Geurts, Franssen, 1996). Эволюция клубеньковых бактерий происходит в тесной связи и, в значительной степени, определяется эволюцией растения-хозяина (Доросинский, 1975). Действительно, распространение ризобий в почве зависит, в первую очередь, от соответствующего бобового растения, которое может существенно влиять на судьбу бактерий в почве. Это действие может быть обусловлено:
Влияние инфицирования ризобиями на количественный и качественный состав ФС в корнях гороха
Как уже отмечалось выше, в биохимическом аспекте семейство Leguminoceae характеризуются особым составом флавоноидов (изофлавоны), что, возможно, связано с их способностью к симбиотическим взаимоотношениям с бактериями семейства Rhizobiaceae. Показано, что соединения фенольной природы являются теми веществами, при помощи которых растения стимулируют или ингибируют различные системы взаимодействия, как с патогенными, так и симбиотическими микроорганизмами. Известно, что флавоноиды, выделенные корнями в почвенный раствор имеют не только хемотаксическое действие на почвенные бактерии, но и способны экспрессировать ризобиальные nod — гены (Geurts, Franssen, 1996; Тихонович, Проворов, 1998; Novak et аї., 2004). Ограничение количества клубеньков на корнях отдельного растения также, по-видимому, обусловлено изменением в составе ФС у растения — хозяина (Rao, Cooper, 1995). В связи с этим нами было исследовано влияние инфицирования ризобиями на количественный и качественный состав фенольных соединений корней гороха.
Исследование влияния инокуляции Rhizobium leguminosarum на содержания ФС На рис.6 представлены данные по динамике концентрации ФС и соединений имеющих положительную реакцию на ванилин, в ответ на инокуляцию Rhizobium leguminosarum в корнях гороха выращенного при 22С. Как видно из графика, через 12 часов после инфицирования происходит значительное увеличение общего содержания ФС в корнях инокулированных растений по сравнению с контрольными неинокулированными растениями. К 24 часам разница между обоими вариантами существенно сокращается. Что же касается соединений, положительно реагирующих на ванилин, то их содержание меняется уже через 6 часов. По-видимому, растение-хозяин таким способом реагирует на прикрепление микросимбионта. Через 12 часов после инокуляции содержание соединений, положительно реагирующих на ванилин, возвращается на исходный уровень концентрации, которая и сохраняется при дальнейшей экспозиции растений.
При пониженной же температуре (Рис.7) изменения концентрации как общей фракции ФС, так и той их части, которая положительно реагирует на ванилин, в контрольном и инокулированном вариантах происходят синхронно. Коэффициент корреляции для изменений содержания общих ФС 0.94. В содержании соединений, реагирующих с ванилином, достоверные различия в обоих вариантах выращивания растений появляются к истечению 48 часов после инфицирования (г 0,6). Такая небольшая зависимость содержания ФС в корнях от инокуляции, может быть обусловлена замедленными темпами развития растения и отсутствием аттракции бактерий на корнях, при этом температурном режиме (8 С), Изменение качественного состава ФС после инокуляции, определяемое методом ВЭЖХ На рисунке 8 представлены хроматограммы, полученные методом ВЭЖХ для ФС из корней гороха выращенного при оптимальной температуре (24 часа после инокуляции и контрольный варианты). Хотя между хроматограммами много общего, но наблюдаются и некоторые различия, связанные, очевидно, с влиянием инокуляции. Так после инфицирования появляется новое соединение со временем удерживания 9,7 мин. Становится меньше пик, выходящий на 12,7 мин. Оба этих соединения показывают положительную реакцию на ванилиновый реактив. После инокуляции симбионтом на хроматограмме исчезают два соединения со временем удерживания больше 19 минут.
В корнях растений выращенных при пониженной температуре, после инфицирования симбионтом, состав фракции ФС также изменяется (Рис.9). Например, исчезает большой пик, выходящий на 5,1 мин. Увеличивается оптическая плотность соединений, регистрируемых при 230 нм между 17 и 22 минутами в сравнении с инокулированным вариантом. Высокая адсорбция этих соединений в области 260 нм, может свидетельствовать об их катехиновой или проантоцианидиновой природе. Необходимо отметить, что в этом температурном варианте, при инокуляции, почти в шесть раз увеличивается концентрация соединения, выходящего на 15 минуте удерживания.
Таким образом, можно утверждать, что инфицирование бактериями Rhizobium leguminosarum, является фактором, влияющим на количественный и качественный состав фенольных соединений в корнях растения-хозяина. Но при оптимальной температуре выращивания растений, изменения как в общем содержании ФС, так и в содержании соединений имеющих положительную реакцию на ванилин, более выражены, чем при пониженной. Небольшое влияние инфицирования микросимбионтом на изменения в содержании ФС (г=0,94) при неблагоприятных температурных условиях, может быть связано с уменьшением количества бактерий, прикрепившихся к корням растения-хозяина. С другой стороны, возможно, именно отсутствие изменений в составе ФС ограничивает адгезию бактерий на поверхность корневых волосков.
Как уже отмечалось, проникновение бактерий в корни растения хозяина происходит неравномерно. Это определяется наличием зон восприимчивости к инфицированию симбионтом только на определенных участках корня. Важную роль в инициации взаимодействия с ризобиями отводят флавоноидам, которые выделяются корнями в ризосферу именно из клеток зоны, где происходит адгезия и проникновение бактерий (Rao, 1990). Вероятно, различия в составе флавоноидов, экскретируемых разными зонами корней и оказывающих различный эффект на экспрессию nod- генов, должны определяться различиями в составе эндогенных ФС соответствующих участков корней. Чтобы подтвердить это предположение мы исследовали содержание липофильных ФС в участках корня растений, подвергнутых инфицированию Rhizobium leguminosarum в течение 24 часов, при 22С. В качестве контроля использовали одновозрастные неинфицированные проростки. Проростки корней нарезали на фрагменты по 5 мм, начиная от кончика. Равноудаленные фрагменты объединяли в отдельные пробы и определяли в них концентрацию фенольных соединений. На рис.10 (А) представлены данные по содержанию ФС в разных фрагментах, по расстоянию от кончика корня, у исходных растений. На графиках видно, что наибольшая концентрация ФС достигается на участке 20-30 мм от кончика. Самый удаленный от кончика корня участок характеризуется самым низким содержанием липофильных фенольных соединений.
Влияние ФС на окисление лецитина, индуцированное аскорбатом железа
Далее были проведены эксперименты по исследованию активности ФС, выделенных из корней гороха, при индуцированном окислении лецитина. В качестве окисляющего агента нами был выбран аскорбат-Fe (аскорбиновая кислота + FeSO,»). Инкубацию проводили при температуре 22С в течение 1 часа, перемешивая. Об интенсивности перекисного окисления, как и ранее, судили по накоплению вторичных продуктов деградации липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Их измерение проводили по методике, приведенной для предыдущего эксперимента.
Как оказалось, антиоксидантная активность фракций ФС, может сильно отличаться от аналогичной в предыдущем эксперименте (рис.16). Видимо, исследуемые соединения могут вступать во взаимодействия с новым фактором — ионами железа. Показано, что существует зависимость антиоксидантнои активности ФС от варианта выращивания растений. Выяснено, что, в присутствие индуктора, температурные условия роста растения и инокуляционный процесс влияют на антиоксидантную активность ФС. Можно заметить, что ПОЛ в корнях и антиоксидантная активность ФС в использованной системе взаимосвязаны. Для неинфицированных растений, выращенных при оптимальной температуре, коэффициент корреляции - г = -0,70, а для инфицированных г = 0,70. Можно отметить четкую отрицательную корреляцию между эндогенным ПОЛ и антиоксидантнои активностью ФС из корней, выращенных при 8С. Для контрольных (включая исходные проростки) г = -0,84, для инокулированных г = -0,94. Эти данные дают основание предполагать, что условия низкой положительной температуры способствуют формированию более мощной антиоксидантнои системы, направленои на выживание растений в неблагоприятных для них условиях существовния.
Необходимо отметить, что для многих флавоноидов показано как образование комплексов с ионами металлов (Yoshino, Murakami, 1998), так; и взаимодействие с гидроперекисными радикалами (как при спонтанном окислении).
Биохимические механизмы токсичности кислорода включают перекисное окисление липидов и генерацию Н2О2 совместно со свободным супероксидным анион-радикалом. При наличии следов солей металлов переменной валентности, (.." и Н2О2 могут in vitro реагировать корпоративно, с формированием гидроксильного радикала ОН. Образовавшийся радикал может атаковать и повреждать все известные биомолекулы. Некоторые исследователи полагают, что основной, если не весь, эффект 02 обусловлен формированием ОН in vitro (Владимиров, Арчаков, 1974). Ог может быть генерирован посредством фоторедукции флавинов. Подобные реакции выявляются редукцией нитрозолевого синего до голубого формазана. При этом происходит: увеличение абсорбции при 560 нм, что может отражать концентрации О2 . Добавление перехватчика ингибирует формирование голубого формазана.
На представленных на рис.17 гистограммах видно, что ФС, выделенные из корней проростков гороха, обладают большой активностью в перехвате Ог в не—лшшдной среде. Анализируя данные по оптимальной температуре, можно заметить, что в варианте 6ч. после инокуляции, перехватывающая активность минимальна. А .как показано ранее, именно на это время приходится увеличение уровня ПОЛ (3.3.1). Затем перехватывающая активность ФС увеличивается и сравнивается с контрольной. При этом наблюдается тенденция к стабилизации уровня ПОЛ в корнях растения-хозяина.
Что же касается активности ФС из корней растений, выращенных при пониженной температуре, то через 6 часов после инокуляции, перехватывающая активность резко увеличивается, что, возможно, и вносит свой вклад в отсутствие изменений в уровне ПОЛ. В месте с тем, оказывается, что через 24 и 48 часов после инокуляции активность соответствующих ФС уменьшается по сравнению с контролем, что может приводить к усилению перекисных процессов (см. рис.12).
Комплексы ФС, экстрагированные из корней гороха на разных этапах развития, практически всегда демонстрируют сильное скавенгирование (перехват) супероксидного анион-радикала. Такая эффективность, возможно, связана с полимерной природой некоторых компонентов, входящих в состав исследуемых комплексов ФС, наличие которых показано ив нашем случае. В подобной системе при небольших концентрациях (до 100 мкг/мл) мономерные катехины имеют меньшую перехватывающую активность, чем их полимеры (Li, Xie, 2000). Видимо, такой эффект может быть связан с тем, что полимеризация позволяет увеличить редокс-потенциал, а соответственно и антиоксидантную активность, мономерных: соединений (Uchida et. al., 1987; Packer et al., 1999). Полимеризация же флавоноидов часто связана именно со свободнорадикальными процессами, например, действием Н2О2 (Li, Xie, 2000; Владимиров, Арчаков, 1974). При оптимальной температуре, выращивания максимальную прооксидантную активность показывают комплексы из 6 часового контрольного варианта.
