Введение к работе
Актуальность проблемы
Целлюлоза - основной компонент клеточных стенок растений, является самым распространенным (исключая ископаемые ресурсы) источником органического углерода на Земле (Coughlan, 1990). Кристаллическая структура целлюлозы обуславливает ее исключительную устойчивость к различным внешним факторам среды и необходимость синергетического действия нескольких типов гидролитических ферментов (целлюлаз) для ее полного гидролиза. Тем не менее, в природе происходит эффективная деструкция целлюлозы за счет деятельности грибов и бактерий, которые участвуют, таким образом, в минерализации органического вещества и глобальном цикле углерода. При этом доступность кислорода, по всей видимости, играет одну из ключевых ролей в стратегии разложения целлюлозы микроорганизмами. В аэробных условиях значительная роль в этом процессе принадлежит грибам, хотя среди аэробных бактерий также есть целлюлолитические представители (Cellulomonas fimi, Streptomyces cellulolyticus и др.). Аэробные целлюлолитики характеризуются высокими урожаями клеток и наличием неассоциированных целлюлазных систем (Рабинович и Мельник, 2000). В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют, как правило, бактерии, которые синтезируют мультидоменные гидролитические ферменты, связанные с клетками, либо надмолекулярные комплексы - целлюлосомы. В то же время открытым остается вопрос о способности факультативно анаэробных микроорганизмов разлагать целлюлозу, поскольку за исключением нескольких мезофильных бактерий - Cellulomonas terrae (An et al., 2005), Telmatobacter bradus (Pankratov et al., 2012) - для абсолютного большинства представителей этой физиологической группы рост на целлюлозе не показан.
Работы по изучению целлюлолитических микроорганизмов были начаты еще в середине прошлого века. Однако повышенный интерес к данной группе был вызван топливным кризисом 70-х гг., поскольку низкая себестоимость и повсеместное присутствие целлюлозного сырья делает его доступным ресурсом для производства топлива (Lynd et al., 2002). С тех пор был изучен целый ряд мезофильных и термофильных микроорганизмов, способных с разной степенью эффективности гидролизовать целлюлозу (Beguin et al., 1994; Schwarz, 2000; Blumer-Schuette et al., 2008). К настоящему времени целлюлазы уже нашли успешное применение во многих отраслях промышленности и сельском хозяйстве (Hongpattarakere, 2002; Sukumaran et al., 2005). Вместе с тем, использование именно термофильных представителей и их термостабильных ферментов позволяет избежать загрязнения нежелательной микрофлорой (Vielle & Zeikus, 2001). Кроме того, воздействие высоких температур способствует увеличению доступности трудногидролизуемых нерастворимых веществ (Niehaus et al., 1999) и делает возможным проведение консолидированной биообработки сырья (Consolidated Bioprocessing, CBP, Lynd et al., 2002).
К началу наших исследований большинство описанных термофильных целлюлолитических бактерий относились к типам Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes. Среди архей рост на целлюлозе был показан только для одного гипертермофильного представителя - Desulfuroccocus fermentans (Perevalova et al., 2005). Помимо изучения биоразнообразия целлюлолитических микроорганизмов, многочисленные исследования, проводимые в настоящее время, направлены на попытки увеличения скорости и эффективности микробного разложения целлюлозы. У ряда микроорганизмов исследована структура и функции отдельных ферментов и целлюлазных систем в целом, проведено клонирование и экспрессия целлюлаз (Zverlov et al., 1998; Berger et al., 2006; Raman et al., 2009; Olson et al., 2010). Однако фундаментальное понимание процесса микробного разложения целлюлозы остается неполным, а энергетические проблемы - нерешенными (Lynd et al., 2002).
Вышесказанное свидетельствует об актуальности изучения термофильных целлюлолитических микроорганизмов как с научной, так и с прикладной точек зрения. В то же время данные о малом количестве культивируемых прокариот относительно их общего числа (Amann et al., 1995) и недостаточная изученность микробного разнообразия термальных мест обитания прямо указывают на возможность выделения новых термофильных целлюлолитических микроорганизмов. Они, в свою очередь, могут прояснить роль этой группы в занимаемых эконишах и оказаться потенциальным источником ценных ферментов.
Цели и задачи исследования
Целью работы было обнаружение, выделение и характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов и их ферментов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
изучение разнообразия термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов из различных термальных местообитаний;
-
характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов;
-
первичная характеристика целлюлолитической активности у представителей новых таксонов.
Научная новизна и практическая значимость работы
Из наземных, подземных и морских термальных мест обитания было выделено 30 штаммов анаэробных целлюлолитических прокариот, относящихся к различным таксонам. Из них 26 штаммов оказались термофильными организмами.
Описаны новые виды экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Thermotogae - Thermosipho affectus sp. nov. и Fervidobacterium riparium sp. nov. Для представителей данных родов способность к росту на целлюлозе была показана впервые. Для представителей типа Thermotogae в целом впервые был продемонстрирован рост на микрокристаллической целлюлозе.
Выделена новая умеренно термофильная целлюлолитическая бактерия 'Melioribacter roseus' gen. nov., sp. nov., отнесенная к новому семейству 'Melioribacteraceae'. Предложен новый тип 'Ignavibacteriae', включающий класс Ignavibacteria, порядок Ignavibacterales и два семейства 'Melioribacteraceae' и Ignavibacteraceae.
Описан новый род термотолерантной бактерии - Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov. Впервые показан рост на целлюлозе, в том числе микрокристаллической, у представителей класса Anaerolinea типа Chloroflexi.
Частично охарактеризованы штаммы анаэробных целлюлолитических бактерий родов Thermotoga, Caldicellulosiruptor и Clostridium, представляющие новые виды. Кроме того, получены новые штаммы ряда известных целлюлолитических микроорганизмов, расширяющие представления об их распространении и физиологии.
В результате работы создана коллекция анаэробных целлюлолитических микроорганизмов (30 штаммов 22 видов), способных разлагать целлюлозу и другие полисахариды в широком диапазоне температуры (20 - 92С), рН (5.0 - 9.5) и солености среды (0 - 8%). Новые микроорганизмы являются продуцентами термостабильных целлюлаз, которые могут быть устойчивы и к действию других физико-химических факторов.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о большом разнообразии термофильных целлюлолитических микроорганизмов, которые могут играть существенную роль в процессах разложения целлюлозы в природе при высоких температурах, и демонстрируют, что способность разлагать целлюлозу широко распространена у представителей различных филогенетических групп.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles 2010", "Extremophiles 2010", "Thermophiles 2011", "Extremophiles 2012", "ISME 2012", "Copper in Biology 2012", а также на Конкурсе научных работ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН в 2011 году и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» в 2010 и 2012 году.
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 17 печатных работах: 5 экспериментальных статьях, 1 коллективной монографии и 11 тезисах конференций.
Место проведения работы и благодарности
Основная работа выполнялась в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук.
Секвенирование последовательностей полных геномов и генов 16S рРНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре «Биоинженерия» РАН. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и ИБФМ РАН (г. Пущино). Определение хинонов проводили в ИБФМ РАН (г. Пущино). Состав жирных кислот и фосфолипидов проводили в РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Бонч- Осмоловской Е.А. и к.б.н. Кубланову И.В. за практическую помощь, ценные советы, полезную критику и постоянное внимание на всех этапах выполнения работы. Также автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим активное участие в работе на разных ее этапах.
Объем и структура диссертации
