Содержание к диссертации
Введение
1. Ризосфера как специфическая экохимическая среда обитания микроорганизмов (Обзор литературы) 13
1.1. Трофические и регуляторные процессы в ризосфере 16
1.1.1. Количество корневых экзометаболитов 17
1.1.2. Качественный состав корневых экзометаболитов 23
1.1.3. Зоны интенсивной экссудации на поверхности корня 29
1.1.4. Факторы, влияющие на уровень экссудации 30
1.1.5. Энергетическое потребности ризобактерий 35
1.1.6. Обмен регуляторными молекулами между
растениями и микроорганизмами 42
1.2. Микробиологическая экология ризосферы 53
1.2.1. Микробиологическая заселенность корневой
зоны 55
1.2.2. Состав ризосферной микрофлоры 60
1.2.3. Влияние растений и микроорганизмов на физико-химические условия в ризосфере 71
2. Влияние компонентов корневых экзометаболитов на рост микробных сообществ 78
2.1. Качественный состав и динамика корневых экзометаболитов различных видов растений 79
2.1.1. Материалы и методы 80
2.1.2. Томаты (Lycopersicon escidentum) 84
2.1.3. Пшеница (Triticum aestivam L.) 86
2.1.4. Райграс (Lolium midtiflonim) 91
2.1.5. Видовая специфичность состава экссудатов Сахаров и органических кислот 94
2.2. Рост ризобактерий на индивидуальных соединениях корневых экзометаболитов 101
2.2.1. Материалы и методы 101
2.2.2. Утилизация органических кислот и Сахаров 102
2.3. Формирование комплекса ризосферной микрофлоры в модельных условиях почвенного микрокосма 114
2.3.1. Материалы и методы 115
2.3.2. Влияние суммарного количества органического вещества 118
2.3.3. Влияние качественного состава корневых экзометаболитов 129
3. Значение взаимодействия ризобактерии с растениями для биологического контроля фитопатогенов 136
3.1. Механизмы защитного действия ризобактерии от фитопатогенов (Обзор литературы) 136
3.1.1. Конкурентные взаимоотношения с ризосферной микрофлорой и фитопатогенами за питательные вещества в почве 137
3.1.2. Синтез соединений, обладающих антибиотической активностью 145
3.2. Выделение и фенотипическая характеристика бактерий,
являющихся антагонистами к фитопатогенным грибам 151
3.2.1. Материалы и методы 152
3.2.2. Селекция ризобактерии и первичная оценка их антифунгальной активности 158
3.2.3. Колонизирующая активность изолятов 166
3.3. Роль трофических потребностей бактерий антагонистов в процессе колонизации ризосферы 172
3.3.1. Материалы и методы 173
3.3.2. Отсутствие корреляции между утилизацией Сахаров штаммами Pseudomonas и их колонизирующей способностью 175
3.4. Влияние условий роста ризобактерии на антифунгальную активность 183
3.4.1. Материалы и методы 184
3.4.2. Влияние состава среды на антифунгальную активность водорастворимых бактериальных метаболитов 186
3.4.3. Определение антифунгальных метаболитов в культуральной жидкости PGPR штаммов 193
3.4.4. Антифунгальная активность летучих бактериальных метаболитов 202
4. Рост и нитрогеназная активность диазотрофов при использование корневых экзометаболитов 210
4.1. Улучшение минерального питания и водного режима в ризосфере (Обзор литературы) 210
4.2. Кинетика колонизации корневой поверхности при интродукции ассоциативных бактерий 218
4.2.1. Материалы и методы 219
4.2.2. Колонизация стерильных корней 220
4.2.3. Колонизация корней в почвенных условиях 226
4.3. Влияние состава органического вещества на рост и уровень нитрогеназной активности 236
4.3.1. Материалы и методы 237
4.3.2. Индивидуальные компоненты водорастворимых корневых экссудатов 238
4.3.3. Летучие соединения прорастающих семян и корней 244
4.4. Влияние генотипа растений на рост и нитрогеназную активность корневых диазотрофов 249
4.4.1. Материалы и методы 250
4.4.2. Степень использования корневых экссудатов ассоциативными диазотрофами 251
4.4.3. Рост Azospirillum brasilense на корневых экзометаболитах пшеницы различной
плоидности 255
5. Гормональные взаимодействия между ризобактериями и растениями 264
5.1. Бактериальный синтез ауксинов в почве (Обзор литературы) 264
5.1.1. Синтез ауксинов ризосферными микроорганизмами 265
5.1.2. Действие экзогенных ауксинов на растение 268
5.2. Использование корневых экзометаболитов при биосинтезе ауксинов в ризосфере 273
5.2.1. Материалы и методы 274
5.2.2. Уровень синтеза индольных производных ризобактериями 279
5.2.3. Влияние триптофана корневых экзометаболитов 288
5.2.4. Фитостимулирующая активность PGPR штаммов 295
6. Имитационное моделирование роста и функционирования бактерий в ризосфере 309
6.1. Математическое моделирование процессов взаимодействия почвенных микроорганизмов и растений (Обзор литературы) 309
6.2. Имитационная модель динамики численности и активности ассоциативных диазотрофов в зоне корня 321
6.2.1. Биологический смысл 323
6.2.2. Математическое формулирование 327
6.2.3. Расчетные параметры модели 334
6.3. Исследование динамики популяций микроорганизмов в ризосфере 340
6.3.1. Расчет размера зоны ризосферы 341
6.3.2. Конкурентные взаимоотношения 347
Заключение 357
Выводы 366
Список литературы
- Трофические и регуляторные процессы в ризосфере
- Видовая специфичность состава экссудатов Сахаров и органических кислот
- Конкурентные взаимоотношения с ризосферной микрофлорой и фитопатогенами за питательные вещества в почве
- Улучшение минерального питания и водного режима в ризосфере (Обзор литературы)
Введение к работе
Микроорганизмы являются неотъемлемой и самой реактивной частью любого биогеоценоза (В.И. Вернадский, 1967). Они в процессе своей жизнедеятельности создают условия для развития других высших форм жизни. Как часть биоценоза, микроорганизмы постоянно находятся во взаимодействии со всеми его компонентами и в первую очередь с растениями. Испытывая влияние со стороны растений, микроорганизмы, в свою очередь, также оказывают существенное влияние на их рост и развитие. Познание внутренних механизмов процесса взаимодействия почвенных микроорганизмов с растениями представляет собой проблему, имеющую важнейшее теоретическое и практическое значение. Этот процесс затрагивает глобальные масштабы круговорота органических и минеральных веществ в биогеоценозе и в значительной мере обуславливает накопление пищевых ресурсов, повышает устойчивость растений к патогенам и адаптацию к стрессам, в определенной степени регулирует развитие растений (Звягинцев, 1987).
В почве микроорганизмы подвергаются действию многочисленных внешних факторов. В основном, считается, что на количество, типы и активность почвенных микроорганизмов влияет природа и доступность использования энергетических источников питания, физическая и биологическая характеристика среды обитания и ее условий, т.е. влажности, температуры, аэрации (Виноградский, 1952; Waisel et al., 1996). Влияние отдельных факторов может в значительной степени варьировать в различных участках одной и той же почвы, что обуславливает появление экологических микрониш, условия в которых определяют направление развития микроорганизмов. Только в исключительных случаях набор всех звеньев в микронише является оптимальным для роста микроорганизмов. Микробный ценоз в микронише изменяется в зависимости от смены источников питания, от типов почв, обла- дающих различными потенциальными возможностями, при этом реакция одних и тех же микроорганизмов не всегда одинакова и зависит от динамики состава и активности всего микробиологического сообщества в почвенной среде. Однако при всем этом всегда, в конце концов, в процессе сукцессии достигается динамическое равновесие, что является результатом взаимодействия среды и микрофлоры (Заварзин, 1974).
В почве можно определить два основных типа микробных ценозов (Lynch, 1990). Первый обнаруживается в почве, удаленной от влияния корней и его существование связано с наличием органических остатков, в основном растительного происхождения. Второй тип ценоза находится в почве; непосредственно примыкающей к поверхности корней - ризосфере и его существование определяется метаболитической активностью корневой системы. Именно микроорганизмы, которые аккумулируются на поверхности корней и в непосредственной к ним близости, оказывают действие на рост и питание растений. Основное наиболее значимое действие ризобактерий заключается в повышении доступности питательных минеральных веществ почвы, фиксации и перевода в доступную форму атмосферного азота, подавление фитопа-тогенной инфекции и гормональное воздействие на рост растения. Это микробное сообщество представлено видами с различными морфологическими, физиологическими и биохимическими свойствами, которые существенно отличаются от свойств микроорганизмов, распространенных за пределами влияния корней (Lynch, 1990; Metting, 1993).
Значение микроорганизмов, обитающих в ризосфере, чрезвычайно велико. Они, с одной стороны, являются активными участниками в круговороте питательных веществ между почвой и растением, синтезируют необходимые для роста физиологически активные соединения и играют существенную роль в биологическом контроле фитопатогенов. С другой стороны, увеличе- ние в ризосфере численности фитотоксической и патогенной микрофлоры, оказывает негативное воздействие на рост растений. Однако, несмотря на важность и разнообразие функций ризосферных микроорганизмов, сведения о закономерностях, определяющих формирование микробиологического ценоза в зоне корня и молекулярных факторах его управления, недостаточны. Изучение законов, управляющих формированием микробиологических сообществ и изменениями, которые происходят в этих сообществах в почве, и особенно в микронишах, является общепризнанным подходом к оценке почвы как своеобразного продукта природы, способного возобновлять запасы питательных веществ для растений (Руссель, 1977).
В нашей работе мы исходили из концепции, утверждающей, что растения способны осуществлять регуляторные функции по отношению к окружающей их корни почвенной среде (Красильников, 1958; Возняковская, 1969; Берестецкий, 1982; Звягинцев и др., 1993; Harley, Russell, 1979; Sarkar et al., 1979; Zobel, 1992). Растения как автотрофы создают органическое вещество в процессе фотосинтеза, почвенные микроорганизмы питаются за счет образующейся органики (Умаров, 1986; Waisel et al., 1996). Благодаря своей высокой биохимической активности эта микрофлора оказывает существенное и в большинстве случаев положительное влияние на рост растений. Таким образом, в почве возникает общность растение - микроорганизмы, позволяющая получить некоторые новые функции, которыми не обладали ее участники раздельно.
В этом аспекте также рассматривается концепция стабильного (sustainable) биологического земледелия, позволяющая определить регулирующие взаимоотношения растений и микроорганизмов в агрофитоценозах и выделить молекулярно - генетические факторы, обеспечивающие эффективное взаимодействие партнеров (Тихонович, Проворов, 1993; Паников, 1998). Н. А.
Красильников (1958) считал, что растения являются самым мощным фактором формирования микробных ценозов почв. Он предполагал, что роль растений более важна, чем географический фактор и основное влияние на формирование микробных ценозов почв оказывают высшие растения и хозяйственная деятельность человека. Однако по этому вопросу получены очень противоречивые экспериментальные данные, что не позволяет до сих пор классифицировать сельскохозяйственные растения не только по их влиянию на численность и состав микроорганизмов в ризосфере, но и по принципам формирования этой микрофлоры (Берестецкий, 1982). Все же по современным представлениям (Звягинцев и др., 1993) растения являются центрами формирования бактериальных сообществ в почве. Живое растение предоставляет для бактерий совокупность специализированных экологических ниш, при этом наиболее тесные взаимосвязи бактерий и растений наблюдаются на листьях и корнях в местах, связанных с интенсивным выделением экссудатов. Растения и микроорганизмы представляют собой целостную систему, функционирование которой осуществляется в результате тесного взаимодействия ее компонентов в условиях значительного влияния почвы. Таким образом, эффективность функционирования ризосферного комплекса в значительной степени зависит от интеграции, в том числе и на генетическом уровне участвующих в нем партнеров.
Большая роль в определении свойств микробного сообщества в ризосфере принадлежит определяемым генотипом растений корневым экзомета-болитам, которые реализуются микроорганизмами в процессе роста корней. Водорастворимые и летучие экзометаболиты, состоящие в основном из низкомолекулярных хорошо доступных для усвоения микрофлорой органических соединений, являются источниками углерода, энергии и физиологически активных веществ для ризосферных микроорганизмов (Stotzky, Schenk,
1976b; Waisel et al., 1996). Интенсивное поступление в ризосферу продуктов фотосинтеза растений создает высокую энергетическую обеспеченность этой зоны (Lynch, 1990). Пути использования дополнительного углерода почвенной микрофлорой и способы влияния на их эффективность являются важной задачей почвенной микробиологии и до настоящего времени не учитываются при создании современных технологий в земледелии.
Для реализации потенциала взаимовыгодной интеграции растений и микроорганизмов, происходящей в ризосфере, и определения степени влияния на эти взаимодействия микробиологического, растительного и почвенного факторов требуется реализация четких экспериментов и теоретических исследований (Тихонович, Проворов, 1993). Решение этих задач требует адекватных экспериментальных и теоретических моделей, в которых результат микробно-растительного взаимодействия может быть достаточно точно измерен, а сама модель разложена на простые составляющие элементы. Изучение развития и контроля биологических популяций и моделирование этих процессов неизбежно носит количественный характер и поэтому связано с использованием математического аппарата (Уильямсон, 1975). Однако в настоящее время комплекс вопросов, связанных с измерением параметров жизнедеятельности микроорганизмов, происходящими в результате выращивания тех или иных растений в почве биохимическими процессами и способами влияния ризобактерий на развитие растений весьма сложен и во многих отношениях еще не выяснен.
Целью данной работы являлось создание новых экспериментальных и теоретических моделей, позволяющих изучать, прогнозировать и регулировать поведение ризобактерий в зоне корня. Разработка этих моделей создает основы для регулирования роста ризобактерий, повышения их активного потенциала и в итоге предлагает пути для конструирования высокопродуктив- ных, стабильных и экономически оправданных растительно-микробных сообществ.
В процессе выполнения работы ставились следующие задачи:
Определить влияние вида растений на специфику роста бактерий в модельных условиях ризосферы. Изучить динамику и молекулярный состав корневых экзометаболитов на ранних стадиях вегетации растений. Определить содержание компонентов водорастворимой фракции корневых экзометаболитов и выяснить их роль в формировании ризосферной микрофлоры.
Установить значение корневых экзометаболитов для осуществления ризобактериями защитной функции от фитопатогенов растений. Выделить и идентифицировать новые эффективные штаммы, обладающие антифунгаль-ной активностью, выяснить возможные механизмы их антагонистического действия на фитопатогены и определить оптимальные условия для осуществления защитных функций.
Изучить влияние молекулярного состава корневых экзометаболитов на интенсивность ассоциативной азотфиксации. Установить влияние плоид-ности генома на эффективность использования ассоциативными диазотро-фами корневых экзометаболитов пшеницы. Выяснить роль растительного энергетического материала на рост и активность ассоциативных диазотрофов.
Выявить роль триптофана корневых экзометаболитов - метаболити-ческого предшественника при биосинтезе ауксинов в ризосфере. Определить уровень экссудации триптофана корнями различных видов растений. Установить интенсивность биосинтеза ауксинов ризобактериями.
С помощью метода имитационного моделирования разработать математическую модель поведения микроорганизмов в ризосфере. Рассчитать теоретические параметры роста и функционирования ризобактерий с учетом пластического и энергетического обмена между растениями и микроорганизмами.
Данная работа выполнена во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, начиная с 1986 года в рамках общесоюзных и общероссийских проектов: "Биологический азот"; Государственной научно-технической программы "Перспективные процессы производства сельскохозяйственной продукции"; отраслевой научно-технической программы "Разработать научные основы формирования агроландшафтов и создать качественно новые зональные системы земледелия для основных природно-сельскохозяй-ственных зон страны". Гранта РФФИ "Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов становления бобово-ризобиального симбиоза" №96-04-50361, а также международных грантов: ИНТ АС "Молекулярные основы хозяйской специфичности нового типа ризобиального симбиоза, обладающего высокой эффективностью азотфиксации " № 94-1058; 2-х грантов Организации по проведению научных исследований (NWO, Нидерланды) "Применение ризобактерий в качестве биопестицидов и фитостимуляторов растений в биологическом земледелии" № 047.01.030 и "Повышение эффективности бактериальных инокулянтов для биологического земледелия" № 047.01.007.96.
Трофические и регуляторные процессы в ризосфере
Большинство микроорганизмов, за исключением олиготрофов, остаются в неактивном состоянии в почве до поступления дополнительного органического субстрата (Wainwright, 1988). Выделение в почву органического материала из растущих корней (корневые экзометаболиты или ризодепозиты) стимулирует микробиологический рост, изменяет химическое и физическое состояние окружающей среды и дает импульс для начала формирования ризосферы (Lynch, 1990; Whipps, 1990). Ризодепозиты Линч (Lynch, 1990) определял как потери корнем фотосинтетатов в виде органических соединений и выделение углекислоты при его дыхании. При этом происходит микробиологическая утилизация выделяемого углерода и соответствующее образование углекислоты при дыхании ризосферной микрофлоры. Оба процесса приводят к увеличению органического пула ризосферной почвы (Sauerbeck, Johnen, 1977; Lynch, 1990). В последнее время проявляется значительный интерес к качественным и количественным аспектам энергетической обеспеченности ризосферы и ее связью с углеродным балансом целого растения и функционированием ризосферной микрофлоры.
В основном баланс углерода в ризосфере изучается учеными в двух аспектах: в первом - микробиологами и почвоведами, интересующимися попу-ляционной биологией, физиологией и экологией микроорганизмов в ризосфере и почве, и во втором - физиологами растений и агрономами, имеющих дело с ростом и физиологией высших растений (Мергель, Тимченко, 1998). Роль и влияние ризосферных микроорганизмов нередко недооценивают за исключением случаев бобово-ризобиального симбиоза и микоризации корней растений, где нередко проводится всесторонний анализ поведения и действия микросимбионта. Различные группы исследователей используют разнообразные методы измерения потока углерода из корней, что естественно приводит к значительной вариабельности данных его качественного и количественного состава. В связи с этим необходимо создание общей системы, которая с одной стороны позволяла бы экспериментально изучать, а с другой стороны моделировать процессы, вызываемые поступлением специфического органического вещества в зону ризосферы.
Одним из первых оценил важность выделительной функции корней физиолог растений С. П. Костычев (1933). Работы последующих лет (Смирнов, 1970) подтвердили представления о том, что выделение веществ клетками корней является нормальным проявлением процессов жизнедеятельности растений. Активная роль корней во многих обменных и синтетических процессах, в результате которых из поглощенных ионов и поступивших из листьев ассимилятов создаются сложные соединения, имеет значение не только для растений, но и для соприкасающейся с корнем почвенной микрофлоры (Aiken, Smucker, 1996).
Для определения количественного и качественного состава корневых экзометаболитов многие исследователи в основном использовали жидкие питательные среды, выращивая растения в контролируемых стерильных условиях в климатических камерах. Одни группы исследователей проводили экспозицию листьев растений в атмосфере 14С02 и измеряли радиоактивность культуральной среды, листьев и корней, в большинстве случаев для определения суммарного количества углерода в корневых экзометаболитах (Barber, Martin, 1976; Whipps, Lynch, 1985; Helal, Sauerbeck, 1986; Lilijeroth et al., 1994; Bekku et al., 1997). Другие группы изучали химический состав экссудатов -семена проращивали и затем удерживали над поверхностью жидкости, при этом корни росли в растворе и выделяли в среду весь комплекс соединений, входящих в состав корневых экзометаболитов (Vancura, 1967; Rovira, 1969; Vancura, Hanzlikova, 1972; Pfikryl, Vancura, 1980; Kraffczyk et al., 1984; Lambers, 1987; Jones, Darrah, 1996).
В табл. 1 приведены данные, характеризующие размер корневой экссудации, определенной с помощью меченой углекислоты, при различной длительности выращивания растений. Применение изотопной метки позволяет наиболее точно учитывать количество выделившегося углерода. Как видно из приведенных данных, выделение углерода из корней у различных авторов сильно варьировали в зависимости от возраста, вида и сорта растений. В опытах с пшеницей, ячменем, кукурузой, томатами и горохом доля углерода, поступающего в почву и утилизирующегося микрофлорой, уменьшалась с возрастом растений. Для проростков пшеницы и ячменя доля углерода, теряемого в виде корневых экзометаболитов, изменялась от 17 до 31% (Barber, Martin, 1976; Wliipps, 1984; Whipps, Lynch, 1985). В работе (Liljeroth et al., 1994) показано, что для кукурузы после 44 сут вегетации 26 - 34% ассимилированного растением 14С попадало в почву в виде корневых выделений и дыхания корней. Для пшеницы эта величина была несколько выше и составляла 40 - 58%. В своих исследованиях Мартене (Martens, 1990) нашел, что у растений пшеницы приблизительно 45% углерода, поступившего в корни, выделялось в почву. Однако у молодых проростков злаковых культур количество вещества, выделяемого в водных культурах стерильными корнями в течение первых недель, составляло 2 - 5 % от сухого веса корней (Barber, Gunn, 1974;).
Видовая специфичность состава экссудатов Сахаров и органических кислот
Из приведенных результатов по динамике корневых экзометаболитов следует, что соотношение между суммарным количеством вещества во фракциях органических кислот и Сахаров меняется за время эксперимента. Причем для разных видов растений динамика корневых экзометаболитов существенно различается (табл. 9). Набухающие семена томатов выделяют больше Сахаров, чем органических кислот. Однако уже на 4-е сут доля органических кислот в экссудатах значительно выше. Указанная закономерность сохраняется и для корневых экзометаболитов 14-и сут растений. В ризосфере моло дых растений томатов фракция органических кислот играет главную роль. В экссудатах пшеницы во всех пробах доминируют сахара. У набухающих семян и 14-и сут растений Сахаров в 3 - 4 раза больше, чем органических кислот. У 4-х дневных проростков их больше только в 1,2 раза. Динамика отношения количества выделяемых органических кислот и Сахаров у райграса сходна с динамикой выделений у томатов. В течение первых 2-х сут у набухающих семян количество экссудируемых органических кислот приблизительно 2 раза выше, чем Сахаров. Однако содержание кислот и Сахаров становится равным после 4-х сут роста растений. Наибольшее количество органических кислот и Сахаров 416,6 мкг/растение на 14-е сут выделяют корни пшеницы, томаты и райграс выделяют соответственно 31,4 и 10,1 мкг/ растение.
Индивидуальный состав органических кислот и Сахаров в пробах экссудатов различных видов растений также имел свою специфику. Во фракции органических кислот у набухающих семян и проростков томатов доминировала щавелевая кислота, а у молодых растений - лимонная кислота. У пшеницы на всех сроках анализа в пробах преобладала яблочная кислота. В экссудатах райграса доминировала янтарная кислота. Все доминирующие кислоты являлись дикарбоновыми, входящими в реакции цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса). В углеводных фракциях экссудатов наблюдали большее разнообразие в составе доминирующих Сахаров. У томатов содержание преобладающих Сахаров в пробах менялось с гексозы глюкозы у набухающих семян на пентозу, ксилозу и дисахарид мальтозу у 14-и сут растений. В экссудатах семян и проростков пшеницы гексозы фруктоза и глюкоза заменялись у молодых растений на доминирующую мальтозу. В экзометаболитах семян райграса основным сахаром являлась пентоза арабиноза, которая вытеснялась также мальтозой в пробах проростков и молодых растений.
Корреляционный анализ данных из табл. 3-8 позволяет установить коррелятивную зависимость между индивидуальном составом органических кислот и Сахаров в пробах экссудатов различных видов растений и длительностью их выращивания. Как видно из результатов табл. 10 положительную и достоверную корреляцию в большинстве анализов наблюдали при сравнении состава органических кислот. Отрицательное значение корреляции было зарегистрировано только при сопоставлении проб 2-х и 14-и сут экссудатов томатов. При сравнении состава Сахаров наоборот доминировали отрицательные или не достоверные положительные коэффициенты корреляции. Из проведенного анализа можно сделать вывод, что состав органических кислот в экссудатах различных видов растений более стабилен во времени, чем состав Сахаров.
В табл. 11 приведены результаты, устанавливающие коррелятивную зависимость между составом экссудатов у разных пар изучаемых видов растений. Как видно из приведенных данных состав органических кислот более видоспецифичен: корреляция между разными видами отсутствует по всем срокам анализа. В то же время, по составу Сахаров на ранних сроках (2 и 4 сут) выявлена сильная коррелятивная зависимость для большинства изучаемых видов растений. Видовую специфичность по составу Сахаров в экссудатах наблюдали только на 14-и сут.
Таким образом, впервые в многократных модельных опытах получены сравнимые данные по количественной динамике экссудации органических кислот и Сахаров у растений томатов, пшеницы и райграса. Из приведенных результатов следует, что корневые экзометаболиты различных видов растений, которые играют основную роль трофических соединений для ризосфер-ной микрофлоры, состоят из сложных смесей индивидуальных компонентов.
Конкурентные взаимоотношения с ризосферной микрофлорой и фитопатогенами за питательные вещества в почве
Наиболее интересными для практического применения являются бактерии, обладающие широкими защитными функциями по отношению к растениям, PGPR - штаммы (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) (Kloepper, Schroth, 1978). Априори ясно, что результирующий эффект различных взаимодействий микроорганизмов и растений будет зависеть от самых разных факторов, часто действующих в различных направлениях. Поэтому для формализации влияния микроорганизмов на растения и был введен термин PGPR. По современным понятиям, термин PGPR сейчас применяется к разнообразному спектру бактериальных штаммов, которые после инокуляции ими семян или корней растений повышают продуктивность растений. Защита растений может происходить за счет прямой стимуляции роста растений -увеличения поступления минеральных элементов азота и фосфора, продуцирования антифунгальных веществ и фитогормонов или косвенно за счет вытеснения фитопатогенов из ризосферы и подавления их развития активными биоконтрольными штаммами (Lambert, Joos, 1989; Lugtenberg et al., 1991; Weller, Thomashov, 1994). Причем часто могут включаться один или несколько специфических или неспецифических механизмов защиты (Kapulnik, 1996).
В этой главе мы рассмотрим основной косвенный механизм действия PGPR штаммов - конкуренцию с патогеном за питательные вещества в ризосфере и продуцирование антифунгальных веществ. Для большинства существующих механизмов действия, степень приживаемости и стабильность развития интродуцируемых ризобактерий в зоне корня играет критическую роль в эффективности их антагонистического влияния. Также рассмотрим прямой механизм действия - продуцирование антибиотических и биоцидных веществ, что является характерным свойством PGPR штаммов при их функционировании в ризосфере. Свойства увеличивать поступления минеральных элементов азота и фосфора и биосинтез фитогормонов будут рассмотрены в последующих главах.
Колонизацией корней, как определил Парк (Parke, 1991), является распространение микроорганизмов внутрь, по поверхности или вокруг растущих корней. Колонизация корней может начинаться с оболочки семян или через контакт с разлагающимися органическими остатками и коллоидными частицами, присутствующими в почве и обогащенными ассоциированными с ними микроорганизмами или вследствие дополнительной инокуляции семян и корней (Возняковская, 1969; Kloepper, Beauchamp, 1992). Микроорганизмы также можно наносить на семена или поверхность корня, создавая первичный источник инокулюма, из которого микроорганизмы затем сами должны мигрировать на растущую корневую систему и вступать в конкурентные взаимоотношения с уже находящейся микрофлорой (Parke, 1991). Во всех случаях приживаемость и стабильность развития интродуцируемых ризобактерий в зоне корня играет значительную роль в эффективности их действия. Часто не воспроизводимые результаты, получаемые в полевых опытах, объясняются неадекватной колонизацией корневой системы бактериальными штаммами. Другими словами, колонизация часто является лимитирующим фактором при биоконтроле (Schippers et al., 1987; Weller, Thomashow, 1994; Ching-A-Woeng etal., 1996).
Колонизация корней ризобактериями является сложным мультистадий-ным процессом, за который ответственно большое количество бактериальных и растительных генов (Lam, 1990; Dekkers, 1997). Процесс колонизации ин-тродуцируемыми ризобактериями может быть разделен на несколько стадий, включающих в себя хемотаксис к корневым экзометаболитам, адсорбцию, миграцию вдоль корневой поверхности и конкуренцию с местной микрофлорой (Scher et al., 1988; Lam, 1990; Lugtenberg et al., 1991; Weller, Thomashow, 1994; Ramos et al., 2000).
Улучшение минерального питания и водного режима в ризосфере (Обзор литературы)
Один из прямых механизмов положительного действия PGPR штаммов-диазотрофов, связанный с их ростстимулирующими свойствами, является азотфиксация в ризосфере растений (Kapulnik, 1996). Попытки улучшить минеральное питание растений при инокуляции корней ризобактериями, охватывают в основном два аспекта: увеличение растворимости питательных элементов и увеличение их поступления в растение. Как известно, из всех элементов питания растения особенно остро нуждается в азоте. Значительным достижением микробиологии последних лет явилось обнаружение активности азотфиксации в ризосфере небобовых растений (Дарт, Дей, 1979; Умаров, 1982; Емцев и др., 1985; Dobereiner et al., 1972; Dobereiner, 1978; Dart, Wani, 1982; Chalk, 1991). Важность этой проблемы обусловлена перспективностью азотфиксации в ризосфере небобовых растений как источника недостающего доступного азота для обеспечения потребностей растения с одновременным снижением антропогенной нагрузки на почву. К настоящему времени получен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о широком распространении ризосферной азотфиксации у растений разных семейств и в почвах различных зон (табл. 33), а само явление получило название ассоциативной азотфиксации. Обычно к ассоциативным бактериям относят штаммы, взаимодействие которых с растениями не приводит к образованию каких-либо специализированных структур типа клубеньков на корнях растений, однако характеризуются образованием специфических бактериальных соедине-ний и структур, способствующих прикреплению бактерий к корням растений и проникновению их в межклеточные пространства и даже клетки кортекса корней (Каменева, Муронец, 1999).
В почве и ризосфере небобовых растений обнаружены азотфиксирую-щие бактерии, относящиеся к родам: Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bijerinckia, Clostridium, Derxia, Flavobacterium, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pseudomonas и др. Список азотфиксаторов, выделенных с корней растений и почвы ризосферы, непрерывно пополняется (Bashan, Holguin, 1997). В зависимости от вида растений, среди бактериальных компонентов ассоциации азотфиксирующих диазотрофов доминируют определенные виды азотфиксаторов.
Высокая азотфиксирующая активность некоторых ризосферных бактерий в чистых культурах неоднократно отмечалась многими исследователями (Клевенская, 1978; Васюк, 1989; Hardy, Eaglesham, 1995; Bashan, Holguin, 1997). Это послужило причиной многочисленных попыток использовать указанные бактерии для улучшения азотного питания, повышения продуктивности различных небобовых культур.
Было установлено (Умаров, 1982), что хотя при ассоциативной азот-фиксации микроорганизмы и растения не вступают в такое тесное взаимодействие, которое характерно для эндосимбиотических азотфиксирующих систем, в целом она имеет сходные экологические особенности, например, активность азотфиксации меняется по мере развития растений, достигая максимума в период цветения и снижаясь во время созревания.
Одним из главных факторов, стимулирующих деятельность микроорганизмов - азотфиксаторов, является растение, причем разные виды растений в различной степени влияют на азотфиксацию в почве (Калининская и др., 1973; Умаров, 1986; Садыков, 1989). Из полученных в работе (Умаров и др., 1989) данных следует, что ячмень в большей степени, чем пшеница, стимулирует активность азотфиксации. Прямой подсчет клеток путем люминесцентного микроскопирования не выявил значительных различий численности бактерий в ризосфере обеих культур. Следовательно, различия в уровне азот-фиксации по вариантам опыта обусловлены различиями в активности бактерий под действием растений, а не численности азотфиксаторов.
Определяющая роль растений обусловливается тем, что процесс азот-фиксации - один из самых энергоемких микробиологических процессов, лимитируемый, прежде всего, как считает большинство исследователей, содержанием доступного углерода в почве. Основным его источником в ризосфере являются корневые экзометаболиты. Кроме того, корни растений, активно поглощая кислород, существенно уменьшают его концентрацию в прикорневой зоне. Микроаэрофильные условия способствуют активизации нитрогена-зы - азотфиксирующего фермента диазотрофов, который инактивируется высокой концентрацией кислорода (Stewart, 1982).
