Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Уникальность цианобактерий как микробиологических объектов (обзор литературы) 10
1.1. Таксономическая характеристика цианобактерий 10
1.2. Структурные особенности цианобактерий 14
1.3. Гетеротрофные спутники 17
1.4. Основы функционирования цианобактерий в почвенных экосистемах 22
1.4.1. Распространение цианобактерий и их экология 22
1.4.2. Цианобактерий как накопители органического вещества и азота в почве 25
1.4.3. Фитосанитарный эффект цианобактерий, их влияние на растения 27
1.5. Создание биопрепаратов на основе цианобактерий 32
ГЛАВА II Методы и объекты исследования 3 7
ГЛАВА III Возможность применения цианобактерий при выращивании сельскохозяйственных культур 44
3.1. Ростстимулирующий эффект цианобактерий ' 44
3.2. Изучение действия цианоризобиального консорциума на растениях гороха 50
3.3. Создание микробных консорциумов на основе цианобактерий 57
ГЛАВА IV Санация почвы и растений 67
4.1. Взаимоотношения цианобактерий и фитопатогенных грибов (лабораторные опыты) 69
4.2. Влияние цианобактерий на развитие фузариозной инфекции озимой ржи (полевой опыт)
4.3. Влияние цианобактериальной обработки на выживаемость сеянцев
хвойных пород 84
4.3.1. Влияние цианобактериальной обработки на выживаемость сеянцев ели 85
4.3.2. Влияние цианобактериальной обработки на выживаемость сеянцев сосны 94
ГЛАВА V Разработка и оптимизация препаративных форм на основе цианоб актерий 102
5.1. Жидкие культуры цианобактерий 103
5.2. Почвенный цианобактериальный инокулюм 105
5.3. Мох как субстрат для биопрепаратов 106
5.4. Опилки как субстрат для биопрепаратов .107
5.5. Технология приготовления цианобактериальной пасты 108
5.6. Эффективность внесения разных форм биопрепаратов 109
Заключение 115
- Таксономическая характеристика цианобактерий
- Ростстимулирующий эффект цианобактерий
- Взаимоотношения цианобактерий и фитопатогенных грибов (лабораторные опыты)
- Жидкие культуры цианобактерий
Введение к работе
Актуальность работы. Насущной задачей земледелия является его экологизация, которая включает использование ресурсов почвы для сохранения ее потенциального и увеличения эффективного плодородия. Подходы к решению задачи, в частности, заключаются в использовании микробной компоненты почвы. Привлекательна в этом плане непременная и многочисленная группа фотртрофных микроорганизмов - цианобактерий. Прежде всего, внимание к ним привлечено благодаря наличию азотфиксации и широкому спектру адаптации к различным почвенным и гидротермическим условиям (Гапочка, 1981, 1999; Кондратьева, 1996; Панкратова, 1998). С точки зрения прикладного использования, они технологичны, что включает дешевые среды для культивирования (отсутствие в среде органических соединений и источников минерального азота) и быстрое накопление биомассы даже в экстенсивных культурах, не требующих дорогого оборудования {Venkataraman, 1969; Singh, 1975; Кузякина, 2004). Вместе с тем, на общем фоне исследований цианобактерий не достаточно изучены в агробиотехнологии, кроме рисовых полей. Поэтому внимание к этой группе организмов в практическом аспекте сосредоточено на изучении их действия на растения и возможности составления на их основе активных препаратов. На кафедре ботаники, физиологии растений и микробиологии Вятской государственной сельскохозяйственной академии в многолетних опытах было изучено распространение цианобактерий в почвах различных климатических зон России (Голлербах, Штина, 1969; Штина, Голлербах, 1976; Штина, 1997); изучены физиологические параметры для многих видов (Резник, 1991; Панкратова и др., 1996; Домрачева, 2005); определены размеры накопления азота в почвенных условиях различных зон России, прежде всего умеренных (Панкратова, 1971, 1973, 1987, 2006; Панкратова, Вахрушев, 1971; Вахрушев, 1974; Панкратова, Мезенцева, 1985); показано влияние цианобактерий на растения (Панкратова,
1979, 1981; Калинин, 1995); начато изучение возможностей использования цианобактерий как консортов сложных микробных сообществ (Панкратова, Калинин, 1991; Калинин, 1995; Ковина, 2001; Панкратова и др., 2004 и др.). На этой основе мы продолжили работы с цианобактериями.
Цель исследования. Разработать основы использования цианобактерий в монокультурах и в сложных микробных консорциумах для применения их как стимуляторов роста и антифунгальных препаратов в земледелии.
Задачи исследования:
Поиск оптимальных способов применения цианобактерий для стимуляции роста различных растений;
Изучение действия цианоризобиального консорциума на горохе;
Изучение действия цианобактериального консорциума на капусте;
Изучение антифунгального действия цианобактерий в моно- и смешанных культурах;
Разработка технологичных форм биопрепаратов для земледелия на основе цианобактерий.
Научная новизна. Впервые показано усиление эффекта нитрагиниза-ции бобовых под действием искусственных консорциумов Nostoc paludosum и видов Rhizobium. Впервые обнаружено, что цйанобактериальный компонент консорциума внедряется в ткань клубенька, при этом увеличивается количество клубеньков на корнях, эффективность азотфиксации и стимулируется рост растений. Впервые при изучении действия на капусту сложных микробных консорциумов на основе цианобактерий с Flavobacterium sp., Pseiidomonas sp., Agrobacterium radiobacter показано, что цианобактерий и цианобактериальные консорциумы могут быть использованы для борьбы с грибной инфекцией овощных, зерновых и хвойных культур, вызываемой видами p. Fusarium. Предлагаются новые формы и методы внесения биопрепаратов на основе цианобактерий.
Практическая значимость. Предложен метод стабилизации обработки семян бобовых растений клубеньковыми бактериями. Приведены технологичные методы культивирования цианобактериальных консорциумов. Разработаны новые методы санации почв и растений с помощью цианобактерий, что соответствует современным требованиям экологизации земледелия.
На VIII Московском Международном салоне инноваций и инвестиций наша исследовательская группа была награждена бронзовой медалью за разработку «Цианобактерий как основа нового направления при создании агро-биопрепаратов». Полученные данные используются при проведении курсов микробиологии и физиологии растений на агрономическом факультете Вятской ГСХА.
Основные положения, выносимые на защиту:
С целью стимулирования развития корневой системы и роста надземной массы растений эффективно использовать цианобактерий.
На основе цианобактерий можно составлять смешанные микробные ассоциации (цианобактериальные консорциумы) с программируемым составом.
Стимулировать развитие клубеньков и рост растений гороха по сравнению с традиционным приемом нитрагинизации удается при использовании цианоризобиального консорциума.
Цианобактерий в виде монокультур, смеси нескольких видов и цианобактериальных консорциумов оказывают ингибирующее действие на развитие фитопатогенных грибов.
Экономически оправданной и агрономически эффективной является форма биопрепаратов на основе цианобактерий в виде цианобактериальной пасты.
Разработку новых экологически безопасных препаратов на основе цианобактерий можно рассматривать как перспективное направление в агробио-технологии.
Личный вклад. Автором диссертации проведено обобщение литературных данных и планирование части экспериментов, получена основная часть фактических данных, проведена их интерпретация.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на:
Всероссийской научно-практической конференции «Экологический мониторинг: научный и образовательный аспекты» (Киров 2002-2005 гг.), был получен сертификат участника Всероссийской научной школы 2003-2006 гг.;
ежегодных областных общественных конференциях - Экология. Здоровье. Жизнь (Киров 2002-2004 гг.);
Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения Академика Н.В. Рудницкого: Здоровье - Питание -Биологические ресурсы (Киров - Фаленки 2002 г.);
- Международной научно-практической конференции, посвященной 80-
летию ВНИИОЗ: Современные проблемы природопользования, охотоведения
и звероводства (Киров 2002 г.);
5-ой Международной конференции: Проблемы лесной фитопатологии и микологии (Звенигород 2002 г);
научных конференциях аспирантов и соискателей: Науке нового века -знания молодых (Киров 2003, 2004 гг.);
Всероссийской школе: Экология и почвы (Пущино 2003 г);
юбилейной конференции агрономического факультета (Киров 2004 г);
Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (памяти академика РАН Е.Н. Кондратьевой) (Москва 2005 г);
VIII Московском Международном салоне инноваций и инвестиций: Конкурс изобретений и инновационных разработок, ВВЦ (Москва 2008 г);
Международной конференции: «Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области» (Киров 2008 г).
Диссертация обсуждена и одобрена на заседании кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии Вятской ГСХА 30 января 2008 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ, из них одна статья опубликована в журнале из списка ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы (287 наименований, в том числе 45 на иностранных языках) и приложений. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков и 23 таблицы.
Работа выполнена на кафедре ботаники, физиологии растений и микробиологии Вятской ГСХА с 1996 г. по 2007 г. в рамках исследовательской работы по теме: «Разработка биологических приемов усиления симбиотиче-ской азотфиксации у бобовых культур и борьбы с корневыми гнилями зерновых на основе цианобактериальных консорциумов», имеющей государственную регистрацию 01.200.201264.
Благодарности. Ряд исследований выполнены совместно с сотрудниками кафедры: д.б.н. Панкратовой Е.М., д.б.н. Домрачевой ЛИ., к.б.н. Калининым А.А., к.б.н. Ковиной А.Л., к.с.-х.н. Устюжаниным И.А., Зяблых Р.Ю., о чем свидетельствуют совместно опубликованные работы. Автор выражает глубокую признательность и искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. Панкратовой Е.М. и коллективу кафедры за годы совместной работы.
С особой признательностью и уважением благодарю д.б.н. Гоготова И.Н., д.б.н. Лобакову Е.С., д.б.н. Баулину О.И., д.б.н. Горелову О.А., а также сотрудников ВНИИСХМ и лично д.б.н. Тихановича И.А. и д.б.н. Кожемякова А.П. за предоставленные штаммы гетеротрофных организмов.
'10
Таксономическая характеристика цианобактерий
К цианобактериям относится большая группа организмов, сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез, сопровождающийся выделением кислорода, что свойственно водорослям и высшим растениям. Вопрос о положении цианобактерий в системе живого мира имеет долгую противоречивую историю. В течение длительного времени они рассматривались как одна из групп низших растений - синезелёные водоросли, поэтому и систематика осуществлялась в соответствии с правилами Международного кодекса ботанической номенклатуры. И только в 60-х гг. XX в., когда было установлено четкое различие между прокариотными и эукариотными типами клеточной организации и на основании этого сформулировано определение бактерий как организмов, имеющих прокариотное строение клетки, встал вопрос о пересмотре таксономического положения этих организмов. Синезелёные водоросли оказались типичными прокариотами. Поэтому они получили название «цианобактерий» (ЦБ). ЦБ, подобно ар-хебактериям, являются отдельной самостоятельной ветвью развития органического мира (Костяев, 2000; Звягинцев и др., 2005). У альгологов (особенно гидробиологов) до сих пор эти организмы называются синезелёными водорослями (Кондратьева, Сиренко, 1997), у микробиологов - цианобактериями (Громов, 1996; Определитель бактерий Берджи, 1997). Такой разброс отражает уникальность рассматриваемой группы. Следовательно, использование обоих указанных терминов правомочно.
Согласно последнему 9-му изданию Определителя бактерий Берджи (1997), которым руководствуется большинство микробиологов, ЦБ отнесены к оксигенным фототрофным бактериям. Приводимые в определителе систе мы классификации ЦБ рекомендуется рассматривать как временные и подлежащие значительной модификации:
1. Наиболее простая система основана почти исключительно на изучении ограниченного числа ЦБ. Критерии, используемые в данной системе, включают морфологические признаки, способ размножения, ультраструктуру, физиологические особенности, химический состав и иногда генетические данные (Rippka et al, 1979);
2. Простая, но неприемлемая система Друэ, основанная преимущественно на морфологии организмов из гербарных образцов; в настоящее время она используется редко;
3. Система Гейтлера, сложная и основанная почти исключительно на морфологических признаках организмов из природных образцов;
4. Система, созданная в результате критической переоценки родов Гейтлера и также основанная, прежде всего, на морфологических признаках и способе размножения;
5. Современная и расширенная система, созданная Анагностидисом и Ко-мареком, представляет собой сложную модификацию системы Гейтлера, проведённую на основе данных по морфологии, ультраструктуре, способу размножения, изменчивости и других, полученных на природном материале и культурах. Здесь роды определены более узко, чем в системе 1.
В определителе Берджи приведены 5 подгрупп ЦБ: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales, Stigonematales. В последнем учебнике Микробиология (Гусев, Минеева, 2003) выделены те же пять основных таксономических групп. В почве представлены порядки Chroococcales, Oscillatoriales, Nostocales (Звягинцев и др., 2005).
Систематическое положение объектов нашего исследования трактуется в разных источниках по-разному. Но все они относятся к порядоку Nostocales, причем Nostoc pahidosum (Kiitz) Elenk (носток болотный) и Nostoc linckia (Roth) Elenk (носток Линка) входят в семейство Nostocaceae, a Micro chaeta tenera (Thur) Elenk (микрохета нежная), по Берджи (1997) относится к семейству Rivulariaceae (табл. 1), по Кондратьевой (1968) — к семейству Аи losiraceae, Голлербах и др. (1953) относят ее к семейству Nodulariaceae.
Ростстимулирующий эффект цианобактерий
Почвенные ЦБ являются непременным компонентом микрофлоры любого типа почвы. Следовательно, прямое влияние, прежде всего, они могут оказывать на корневую систему растений, с которой контактируют в ризо-плане и в ризосфере особенно в поверхностных слоях почвы. Ризогенный эффект ЦБ был установлен при проведении лабораторных опытов со многими сельскохозяйственными культурами. Так, например, при обработке семян ячменя сорта Джин культурой Nostoc paludosum шт. 18 визуально заметна разница в развитии корневой системы в опытном и контрольном варианте (рис. 5).
При проведении опытов с семенами пшеницы сорта Иргина эффективность использования цианобактерий также оказалась существенной. Рулонные культуры помещали в колбы объемом 100 мл с налитой в них либо без азотистой средой Громова №6, либо с 1,5-месячной культурой цианобакте-рий в количестве 50 мл. Экспозиция опыта — трое суток.
Доказано, что ЦБ оказывают стимулирующий эффект на растения пшеницы. Наиболее эффективной оказалась обработка семян N. linckia 271. В этом варианте длина корневой системы и проростков на 69,5 и 63,4% выше по сравнению с контролем (табл. 4).,
Обработка семян козлятника восточного (Galega orientalis) ЦБ Nostoc paludosum шт. 18. и Microchaeta tenera шт. 9 также приводила к видимому ри-зогенному эффекту (Научный отчет кафедры по международной программе «Интербиоазот - 2000», 1991).
Ризогенный эффект был доказан на культурах редиса, салата и разных сортов гороха (Красноуфимский-70, Лучезарный, А-16620, А-10666, А-17495, Надежда). Показано, например, что у растений гороха сортов Красноуфимский-70 и Надежда длина корней в вариантах с обработкой Nostoc paludosum шт. 18, Nostoc muscorum шт. 13, Nostoc muscorum шт. 21, Microchaeta tenera шт. 9, Cylindrospermum punctatum шт. 70, Tolypothrix tenuis шт. 17 была больше на 42,8 - 85,7 % по сравнению с необработанными вариантами (Панкратова, Калинин, 1991). Имеются и подтверждающие этот факт данные других исследователей, которые обсуждены в главе 1.
В наших опытах, приведенных с культурами гороха (сорт Альфа), капусты (сорт Крюмон), пшеницы (сорт Иргина), озимой ржи (сорт Фаленская 4), ели и сосны, было подтверждено, что использование ЦБ в качестве ино-кулята для семян или почвы положительно влияло на развитие корневой системы (табл. 5).
Амплитуда колебаний ризогенного эффекта зависела не только от растения, но и от условий проведения опыта, о чем подробнее будет сказано ниже.
Известно, что ризогенный эффект определяется наличием в ЦБ аукси-но- и гиббериллиноподобных веществ, поэтому этот эффект может колебаться в зависимости от дозы, срока, формы внесения ЦБ (инокуляционная биомасса, срок обработки семян или посевов) и отзывчивости культур.
Для выявления оптимальной формы внесения сравнивали эффективность обработки культуральной жидкостью и клетками ЦБ на рост проростков гороха.
В чашечных культурах использовали семена гороха сорта «Альфа» и Nostocpaludosum шт. 18. Длительность опыта - неделя. Всхожесть семян оказалась одинаковой (85-87 %) во в.сех вариантах. Наибольший ризогенный эффект отмечен при использовании суспензии клеток ЦБ (рис. 6. - А): длина корней у проростков этого варианта более чем в три раза превышала длину корней контрольного варианта. Кроме того, визуальное наблюдение и микро-скопирование показали, что ЦБ и их культуральная жидкость уменьшают развитие на семенах плесневых грибов. Ранее факт подавления плесневых грибов клетками Anabaena cylindrica шт. 20 также был отмечен на горохе (Панкратова, 1970).
В рулонной культуре подтверждена эта же закономерность, хотя стимулирующий эффект ЦБ был нескодько ниже, чем в предыдущем опыте. По-видимому, это объясняется условиями, складывающимися в этом опыте -снижением доступа света к клеткам ЦБ.
Тем не менее, положительный эффект сохранялся: после недельной экспозиции длина корней и высота проростков в третьем варианте по сравнению с контролем были больше на 26 и 36%, соответственно (рис. 6. — Б); при 2-х недельной экспозиции в третьем варианте прибавка в росте по сравнению с контролем составила более 14 % и 7 %, соответственно (рис. 6. — В).
Взаимоотношения цианобактерий и фитопатогенных грибов (лабораторные опыты)
В последние десятилетия на кафедре ботаники, физиологии растений и микробиологии Вятской ГСХА изучается возможность использования ЦБ для создания экологически безопасных биопрепаратов, обладающих фунги-статическим и фунгицидным действием (Панкратова, 1970, 2000; Панкратова и др., 1998; Домрачева и др., 2001, 2002; Калинин и др., 2002; Панкратова и др., 2002; Домрачева др., 2003, 2004; и др.).
Ранее нами было показано (раздел 3.3.) ингибирование возбудителей черной ножки и килы рассады капусты цианобактериями, относящимися к р. Nostoc. В следующих опытах фитосанптарный эффект изучался на примере подавления Fusariiim culmorum и Fusarium nivale. Исследовали взаимодействие Fusariiim culmorum с несколькими видами ЦБ: Nostoc paludosum шт. 18, N. Hnckia шт. 271., Microchaeta tenera шт. 265.
Методика эксперимента следующая: выращивали гриб Fusariiim culmorum на агаризованной среде Чапека в чашках Петри до появления мощных газонов, имеющих пышный мицелий бело-розового цвета (рис. 15. 1). При наложении пленок ЦБ на мицелий Fusariiim culmorum уже на 3 — 4 сутки появились зоны лизиса гриба, диаметром до нескольких сантиметров (рис.15).
Микроскопирование показало.полное разрушение мицелия в зоне лизиса и наличие незначительного количества хламидоспор.
Таким образом, даже на питательной среде, подходящей только для гриба, ЦБ оказывают миколитический эффект. Лизис грибного мицелия сопровождался усиленным макроконидиогенезом. Величина удельной продукции макроконидий (т.е. число конидий на 1 метр мицелия) значительно возрастала со временем (табл. 11).
Увеличение репродуктивного потенциала Fusarium culmorum, связанное с возрастанием удельной продукции макроконидий, указывает на то, что под воздействием ЦБ стратегия гриба направлена только на выживание популяции, а не на активное освоение среды. Следовательно, потенциал фито-патогенности при этом значительно снижается.
В следующем опыте изучали действие ЦБП на F. culmorum и F. nivale. Для этого на газоны фузариев было нанесено по 1 мл культур ЦБ (N. paludo-sum, N. linckia или их смеси), выращенных на безазотистой среде Громова № 6 (с добавлением 0,5% агара), с титром 500 тыс. кл/мл среды. ЦБП на газоне гриба образовывала диск диаметром 1,5 см. Подавление развития грибов в форме подсыхания мицелия около дисков ЦБ началось на 4-е сутки. На 7-е сутки появились зоны лизиса и внутриагарное исчезновение пигмента. Мик-роскопирование показало полное разрушение мицелия F. culmorum и F. nivale, наличие незначительного количества хламидоспор. Величина зон лизиса колебалась от 15 до 40 мм и была максимальна при воздействии цианобакте-риальной смеси (табл. 12). Таким образом, в лабораторных опытах было показано, что испытанные виды ЦБ обладают миколитической активностью по отношению к обоим видам грибов-патогенов при взаимодействии в чистых культурах на питательных средах. Однако для осуществления биологического контроля над размножением фузариума с помощью ЦБ необходимо было изучить поведение партнеров в почве.
При внесении в стерильную почву N. pahidosum, М. tenera, N. linckia в виде моно- или смешанных культур и F. culmorum почва становилась супрессивной для гриба. Термин «супрессивные» почвы обозначает такие возделываемые или целинные почвы, в которых наблюдается подавление фито-патогенных микроорганизмов {Hornby, 1983). Различают индуцированную супрессивность, вызванную приемами, которые активизируют антибиотическую активность аборигенных микроорганизмов, и интродуцированную супрессивность, связанную с внесением в почву микробов антагонистов. В нашем опыте проявился фактор индуцированной супрессивности.
При этом особенно сильный эффект подавления развития фузариума отмечен для М. tenera, в присутствии которой в почве гриб не прорастал совсем. В то же время в контрольном варианте наблюдалось интенсивное развитие гриба с суммарной длиной мицелия более 5 м/см" поверхности почвы (табл. 13).
Жидкие культуры цианобактерий
Для культивирования ЦБ предложены многочисленные минеральные среды, в состав которых входит сравнительно небольшое число соединений, необходимых для процессов клеточного синтеза. В качестве жидких сред для культивирования ЦБ многими исследователями были изучены: среда Громова №6 (Громов, 1965), Гусева (Гусев, 1968), BG-11 {Rippka et al, 1979) и среда М (Tax, 1963). В лабораторных опытах учитывали скорость роста и накопление азота, сводные данные о которых представлены в монографиях (Гол-лербах, Штина, 1969; Штина Голлербах, 1976). На основании этих опытов было установлено, что почвенные аборигенные виды ЦБ наиболее хорошо растут на средах Громова № 6 и Гусева. Был проведен мониторинг 1 штаммов ЦБ, находящихся в коллекции ВГСХА, по таким показателям как скорость, накопление биомассы и технологичность отделения ее от культу-ральной среды (фильтрация под разряжением или центрифугирование), а так же по ризогенному эффекту (Калинин, 1995).
На основании экспериментов установлено: - наиболее эффективна 1-1,5 месячная культура; - при экстенсивном способе выращивания (колбы Эрленмейера в люминеста-те или на зашторенном окне) ЦБ могут накапливать биомассу по сухому веществу в осенний период 1,2 - 43,4 мг/50 мл. и 85,8 - 154 мг/50 мл. в весенний за 30 суток (Калинин, 1,995); - наиболее легко разбивается и отделяется от культуральной среды биомасса N. paludosum шт. 18, что облегчает впоследствии производство инокулюма и его применение (Калинин, 1995); - из 20 штаммов, отобранных по максимальной скорости роста и технологичности, 5 выбраны по ризогенному эффекту, в том числе N. paludosum шт. 18; - по мере старения культур в них появляется много спор, которые вызывают общее изменение окраски; снижаетря темп роста, что требует регулярного пассажа культур на свежую среду; - транспортировка такой формы инокулята затруднена из-за особых требований к перевозке жидкости, сохранности стеклянной посуды и большого объема транспортируемого груза.
Но такая форма внесения имеет свои прерімущества: инокулюм свежий, легко контактирующий с объектом внесения благодаря слизи; при внесении на поверхность почвы дающий возможность визуально следить за приживлением. Эффективность такой формы была проверена нами в лабораторных и полевых опытах на разных культурах: горох, ячмень, пшеница, озимая рожь, капуста, ель, сосна (см. разделы 3.1., 3.2., 3.3., 4.1., 4.2., 4.3.). Из выше изложенного экспериментального материала следует, что по эффективности выделялись варианты с использованием смеси ЦБ.
Для почвенных ЦБ экологически естественнее твердые субстраты, чем условия жидких культур. Поиск более удобных форм препарата начинали с использования почвы.
Первые почвенные препараты готовили по следующей прописи: - оптимизировали рН почвенной вытяжки до 6,5 (учитывая, что ЦБ являются базифильными организмами); - стерилизацию вели в мягких условиях при 0,5 атм. дважды в течении 20 минут, предупреждая возможные изменения химических свойств и даже появление токсичности (Хотянович, 1991); - почву высушивали и инокулировали жидкой культурой ЦБ; - после вторичной десикации почву просеивали через сито и упаковывали в бумажные пакеты.
В условиях богарного земледелия использование такой формы препарата не имело стабильного эффекта (Штина и др., 1972). По нашему мнению, неудача была обусловлена низким титром инокулюма.
Поэтому мы готовили почвенный препарат несколько иначе: - в дерново-подзолистой почве рН выравнивали до нейтрального значения, (рН водной вытяжки 6,8 - 7,0); - почву стерилизовали по выше изложенной прописи; - помещали на фильтровальную бумагу, укрепленную на сите, и в остывшем состоянии вносили 150 мл среды Громова №6, в которой находился консорциум (Nostoc paludosum (105 кл/мл) + виды p. Rhizobium (10 кл/мл)). Жидкая фракция инокулюма поглощалась фильтровальной бумагой, и излишки ее вытекали через отверстия сита; - в таком состоянии почву сушили, механически перемешивали и упаковывали в полиэтиленовые пакеты, которые хранили до использования при комнатной температуре 18 — 22 С.
Титр ризобиума снижался в процессе сушки до 8-10 и при хранении в течение месяца - до 1,7-10 кл/г почвы. Титр ЦБ оставался стабильным.
Способ приготовления инокулюма, таким образом, был очень сложен по длительности и технологическим процедурам. Поэтому нам пришлось от него отказаться.
Модернизация следующего способа приготовления почвенного инокулюма состояла в том, что его готовили на стерильной, нейтральной почве, помещенной в закрытые пластмассовые контейнеры (приложение 8). Иноку-лят ЦБ подращивали в течение 1—2 месяцев в люминостате при постоянной температуре 22 - 25 С. При применении композитов с сапротрофными организмами их вносили в инокулюм перед обработкой семян. Преимущество такой формы заключается в том, что культура не подвергается высушиванию, то есть сохраняется в активном состоянии.