Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Методы выделения плазмвдной днк 9-35
ГЛАВА II . Анализ плазмвдных днк с помощью специфических эндонуклеаз, конструирование рекомбйнантных молекул днк 35-46
ГЛАВА III. Материалы и методы 47-73
ГЛАВА ІV . Выделение плазмвдной днк, детерминирующей синтез пестицина 74-88
1. Сравнительная эффективность некоторых методов выделения плазмидной ДНК 74-84
2. Биологическая идентификация препаратов плазмидной ДНК 85-88
ГЛАВА V. Молекулярные характеристики днк плазмвды песгициногенносги 89-105
1. Определение молекулярной массы плазмиды пестициногенности 89-96
2. Изучение нуклеотидного состава плазмидной ДНК 96-97
3. Определение числа копий плазмиды пестициногенности на один хромосомный эквивалент Y.pestis 97-98
4. Изучение чувствительности ДНК плазмиды пестициногенности к специфическим эндо-нуклеазам 99-103
5. Некоторые характеристики мини-плазмид чумного микроба 103-105
ГЛАВА VІ . Конструирование рекомбйнантных молекул днк на основе репликона плазмиды пестициногенности, использование их для картирования 106-122
1. Использование в качестве клонируемой ДНК плазмиды pBR 322 I06-II4
2. Картирование плазмиды пестициногенности с использованием гибридной плазмиды . I14-122
Заключение 123-135
Выводы 136-137
Список использованной литературы 138-
- Сравнительная эффективность некоторых методов выделения плазмидной ДНК
- Определение молекулярной массы плазмиды пестициногенности
- Изучение чувствительности ДНК плазмиды пестициногенности к специфическим эндо-нуклеазам
- Картирование плазмиды пестициногенности с использованием гибридной плазмиды .
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сразу же вслед за открытием явления бактериоциногении у чумного микроба ( Ben-Gu-rion, Hertman, 1958) стали предприниматься попытки установить генетическую природу этого явления. По аналогии с колициногени-ей многие исследователи склонны были считать, что синтез пеети-цина I контролируется внехромосомным элементом наследственности (см.например, Hertman, Ben-Gurion, 1959; Brubaker, Surgalla, 1961; Пак, 1969; Hu et al., 1972; Brubaker, 1972; Brubaker, 1974). Несмотря на отсутствие прямых доказательств справедливости этого предположения, Hardy K.G. (1975) в своем обзоре пишет о плазмиде пестициногенности чумного микроба, как о само собой разумеющемся.
Отнесение пестициногенности к числу признаков, ассоциированных с вирулентностью чумного микроба (см., например, Brubaker, 1972), повысило интерес исследователей к выявлению генетической природы этого детерминанта, что способствовало переходу от этапа предположений и аналогий к поискам экспериментальных доказательств, способных установить истину. К началу семидесятых годов Кольцовой Е.Г. с соавт. (1971; 1971; 1973) и Проценко О.А. (1973) удалось показать, что детерминант пестициногенности мобилизуется к конъюгационному переносу некоторыми трансмиссивными R-факторами с частотами, значительно превышающими таковые для известных хромосомных маркеров. Кутырев В.В. (1979) затем не только подтвердил эти данные, но и показал "ограниченную" несовместимость детерминанта пестициногенности с плазмидой Col EI, а также способность плазмиды Col EI комплементировать мобилизацию детерминанта пестициногенности плазмидой RP4.
Таким образом, были получены достаточно весомые свидетельства
в пользу плазмидной природы пестициногенности. Однако, первая из известных попыток выделить из Y.pestis препарат плазмидной ДНК оказалась безуспешной ( Little, Brubaker, 1972). Только в 80-х годах опубликованы первые сообщения о результатах исследования, проведенных в нашей лаборатории (Попов и др., 1980) и зарубежными исследователями ( Ferber, Brubaker, 1981), по выявлению методами электрофоретического анализа плазмид чумного микроба, в том числе и плазмиды пестициногенности. Очевидно, что изучение молекулярных характеристик и биологических свойств плазмиды, ответственной за синтез пестицина І у возбудителя чумы, является весьма актуальной проблемой.
Целью настоящего исследования было изучение основных молекулярно-биологических характеристик плазмиды пестициногенности чумного микроба и возможности использования ее в качестве векторной молекулы в молекулярно-генети-ческих исследованиях возбудителя чумы.
Задачи настоящей работы состояли в следующем:
адаптировать известные методы выявления плазмид в бактериях и получения плазмидной ДНК в препаративных количествах для работы с клетками Y.pestis и оптимизировать их таким образом, чтобы получать устойчиво воспроизводимые результаты;
провести биологическую идентификацию плазмидной ДНК, выделенной методами трансформации бесплазмидных штаммов Y.pestis
и E.coli с последующим изучением фенотипа трансформантов. При этом необходимо было решить и задачу селекции трансформированных клеток в связи с отсутствием у плазмиды пестициногенности селективных маркеров;
- определить молекулярную массу плазмиды пестициногенности
- б -
независимыми методами - электронно-микроскопическим, электрофо-ретическим и методом аналитического ультрацентрифугирования; определить плавучую плотность плазмидной ДНК в растворах солей цезия и установить мольную долю нуклеотидов Г+ Ц;
определить число копий плазмиды пестициногенности на один хромосомный эквивалент, что могло бы осветить два вопроса: способ контроля репликации этой плазмиды, а также потенциальную возможность использования ее в качестве векторной молекулы;
изучить чувствительность ДНК плазмиды пестициногенности, выделенной из различных по происхождению штаммов Y.pestis
к специфическим эндонуклеазам (рестриктазам), наиболее популярным в экспериментах по молекулярному клонированию; определить локализацию сайтов рестрикции для некоторых рестриктаз на молекуле плазмиды пестициногенности. Такая рестрикционная карта могла бы быть основой для последующего генетического картирования этой плазмиды;
- методами генной инженерии сконструировать гибридную плазми-
ду на основе плазмиды пестициногенности, введя в нее ген устой
чивости к какому-либо из лекарственных средств в качестве удоб
ного селективного маркера; кроме того, это была бы реальная про
верка плазмиды на возможность использования ее в качестве вектор
ной молекулы.
Научно-практическая значимость работы и положения, выдвигаемые для защиты:
- разработан метод электрофоретического выявления плазмидной
ДНК в бактериальных клетках, позволяющий воспроизводимо выявлять
плазмиды с широким спектром молекулярных масс из большого круга
бактерий как рода Yersenia, так и других родов микроорганиз-
мов. Метод может быть использован для исследования штаммов чумного микроба, выделяемых в природных очагах, по набору плазмид, который у возбудителя чумы является относительно устойчивой характеристикой; оптимизирован метод препаративного выделения ДНК плазмид чумного микроба, который без дополнительных модификаций позволяет выделять плазмиды различной молекулярной массы из широ кого круга хозяев бактериальной природы;
совместно с сотрудниками отдела генетики ВНИПЧИ "Микроб" разработан способ котрансформации клеток Y.pestis, существенно упрощающий биологическую идентификацию препаратов плазмидной ДНК, выделенной из чумного микроба и не обладающей селективными маркерами;
определены такие молекулярные характеристики ДНК плазмиды пестициногенности, как масса, процентное содержание ГЦ-пар и плавучая плотность в растворе хлористого цезия. Определение числа копий плазмиды на один хромосомный эквивалент клетки Y.pestis свидетельствует об "ослабленном" контроле репликации этой
плазмиды со стороны хромосомальных генов;
определена чувствительность ДНК плазмиды пестициногенности к ряду специфических эндонуклеаз (рестриктаз). Показано наличие уникальных сайтов для некоторых из них, что является благоприятным фактором при использовании этой плазмиды в качестве векторной молекулы; составлена рестрикционная карта плазмиды пестициногенности чумного микроба, которая может служить основой картирования плазмиды; определена примерная локализация гена, детерминирующего синтез пестицина I;
выявлены и частично охарактеризованы две мини-плазмиды чумного микроба, образованные de novo в одном из штаммов чумного микроба, которые могут стать основой для конструирования плаз-
мидного вектора;
- сконструирована рекомбинантная плазмида pGM6, наделяющая трансформированные ею клетки Y.pestis и E.coli способностью синтезировать пестицин I, фибринолизин, плазмокоагулазу и устойчивостью к тетрациклину, построена рестрикционная карта этой плазмиды.
Сравнительная эффективность некоторых методов выделения плазмидной ДНК
На начальных этапах работы ДНК плазмиды пестициногенности выделяли из штамма Y.pestis Java 19/36. Этот штамм был получен Проценко О.А. (1981) в результате конъюгационного переноса фактора пестициногенности из Y.pestis 231 с помощью плазмиды R144 и последующей ее элиминации из клонов трансконъюгантов. Для выделения плазмидной ДНК использовали методы, разработанные Clewell D.B., Helinski D.R. (1969) и Blair D.C. с соавт. (1971; 1972). В этих методах в качестве агентов, лизирующих бактериальные клетки, предложены детергенты Тритон Х-100 и Brij-58, В наших экспериментах, однако, эти детергенты плохо лизировали клетки Y.pestis Java, и в последующем мы использовали сарко-зил и додецилсульфат натрия (ДСН) в различных концентрациях -вплоть до двух процентов. И даже в этом случае для обеспечения полноты лизиса клеток лизаты прогревались на водяной бане (65С) в течение 10-15 минут. Несмотря на достаточно полный лизис бактериальных клеток, выход плазмидной ДНК оставался на низком уровне (для сопоставимости данных выход плазмидной ДНК приводится на 2,5 л жидкой культуры Y.pestis, выращенной при 28С в течение 18-20 часов на качалке; условия подготовки затравочной культуры и посевная доза одинаковы) и составлял всего несколько десятков микрограммов. Допуская возможность интерферирующего влияния белков и полисахаридов на эффективность выделения плазмидной ДНК, мы испытали метод, предложенный Guerry Р. с соавт. (1973), характерной особенностью которого является осаждение значительной части хромосомно-мембранного комплекса с помощью ДСН в сочетании с высокой концентрацией їГаСІ, а также депроте-инизация "осветленного" лизата фенолом. Мы не добились с помощью этого метода заметного увеличения выхода плазмидной ДНК, однако эти эксперименты оказались полезными в том плане, что позволили проанализировать и установить этапы процедуры выделения, на которых происходят наиболее существенные потери плазмидной ДНК: - предварительное завершение лизиса клеток при 65-70С в присутствии ДСН ведет к разрушению хромосомно-мембранного комплекса и, как следствие, незначительному освобождению лизата от хро-мосомальной ДНК в процессе его "осветления". Это влечет за собой необходимость подготовки большего числа пробирок с градиентом концентрации CsCi -этидиум бромид; - ДСН является релаксирующим агентом для плазмиды пестицино-генности чумного микроба; - значительные количества плазмидной ДНК осаждаются на интерфазе в процессе фенольной или хлороформенной депротеинизации "осветленного" лизата и необходимы дополнительные манипуляции для извлечения этой ДНК. Необходимость получения достаточно больших количеств высоко-очищенной плазмидной ДНК заставляют обратиться к другим, более эффективным методам. К их числу принадлежит, на наш взгляд, метод Humphreys G.O. с соавт. (1975), позволяющий сконцентрировать ДНК из больших объемов лизата. Мы с успехом пользовались этим методом довольно длительное время, дополнив его солевой депротеинизацией осадка ДНК. Выход плазмидной ДНК возрос до 100-320 мкг. Существуют, однако, некоторые ограничения, препятствующие стабильному применению этого метода. К их числу следует отнести необходимость экспериментальных поисков концентрационных поправок для полиэтиленгликоля 6000 разных партий и разных фирм.
Чтобы избежать недостатков указанных методов при выделении плазмидной ДНК из культур Y.pestis, подвергли критическому анализу значительное число опубликованных в научной печати методик и разработали на их основе компиллятивный метод, который и применяется в нашей лаборатории (детали метода приведены в главе Ш). Необходимо, вероятно, привести хотя бы эмпирическое обоснование наиболее существенных этапов этого метода.
Мы отказались от общепринятой обработки бактериальных лизатов РНК-азой, так как эта процедура малоэффективна и не освобождает лизаты от примесей РНК (рис.2). ttorgard M.V. (1981), специально исследуя этот вопрос, также пришел к выводу о неэффективности применения РНК-азы для удаления примесей РНК из лизатов. Вероятно, это явление связано с неадекватными условиями для проявления активности фермента в бактериолизатах, так как этот же препарат активно гидролизует очищенную РНК. В связи с этим от примесей РНК мы избавлялись с помощью гель-хроматографии.
В ходе экспериментов установлено, что присутствие в лизирую-щей смеси этанола в концентрации 10-15 приводит к значительному уменьшению фракции РНК в профиле элюции с колонки биогеля смеси плазмида+РНК, полученной в результате центрифугирования в градиенте концентрации Csci- этидиум бромид (рис.3). Известно, что достижение РНК равновесного состояния, равного примерно 1,9 г/см3 в растворе CsCl, происходит более, чем за 60 часов центрифугирования при скорости вращения роторов типа 50 Ті, 70, ITi или Ту65, равной 40 тыс.об/мин (Davie et el., 1980). Это время значительно сокращается при проведении лизиса бактериальных клеток в присутствии невысоких концентраций этанола и после 43-х часов центрифугирования можно отобрать зону плазмидной ДНК
Определение молекулярной массы плазмиды пестициногенности
Предварительный электронно-микроскопический анализ показал, что плазмидная ДНК, полученная из пестициногенных штаммов У.ревis Java 19/36, EV 5/1, 358/12 находится в суперскрученной форме. После прогревания при 60С в течение 15 минут часть молекул переходит в форму открытого кольца, доступного для измерения его контурной длины (рис.9). Так как структура, приведенная на этом рисунке, однотипна для плазмид различного происхождения,
Электронномикроскопическая фотография закрытой суперскрученной и открытой кольцевой форм ДНК плазмиды пестициногенности чумного микроба, то мы приводим только фотографию плазмиды, выделенной из Y.pes-іів 358/12 1. Плазмида пестициногенности из Y.pestis Java 19/36 по результатам электронно-микроскопического изучения обладает молекулярной массой около 7,5 Md. Аналогичная плазмида из штаммов Y.pestis EV 5/1 и 358/12 отличается более низким значением молекулярных масс, которые составляли 6 0-6,3 Md. Мы предположили, что более крупные размеры плазмиды из Java 19/36 могут быть обусловлены рекомбинационными процессами при конъюгационном переносе ее из Y.pestis 231. Так как электронно-микроскопический анализ аналогичной плазмиды из Y.pestis 231 затруднен вследствие того, что этот штамм обладает и другими плазмидами, то наличие дополнительной вставки определяли методом гетеродуплексно-го анализа. При этом были приняты во внимание данные, полученные в электрофоретическом изучении разных штаммов Y.pestis. Согласно этим данным, Y.pestis 231 имеет плазмиду пестициногенности с молекулярной массой около 6 Md. Гетеродуплексный анализ плазмид, выделенных из штаммов 19/36 и 358/12 показал, что ДНК плазмиды пестициногенности из штамма Y.pestis 19/36 обладает одной непрерывной полинуклеотидной вставкой размером около что эта плазмида в штамме Y pestis Java 19/36 обладает негомологичной вставкой, поэтому в седиментационном анализе изучали плазмидную ДНК, выделенную из Y.pestis 358/12 и EV 5/1. Ниже приводится типичная седиментограмма и графики зависимости log г от времени центрифугирования ДНК, полученные в наших экспериментах (рис.II). Расчеты показали, что молекулярная масса изучаемых плазмид колеблется в пределах 5,7-6,5Md в разных опытах. При этом следует отметить, что при одновременном изучении этих двух плазмид (разные ячейки в одном роторе в ходе одного эксперимента) наблюдалось очень близкое совпадение коэффициентов седиментации для них, однако при исследовании каждой из плазмид в отдельности такого совпадения не было. Это не удивительно, если учесть замечание Фрайфельдера Д. (1980) о том, что: I) существующие в настоящее время эмпирические соотношения между S2Q и М получены на основе М, значения которых определены с ошибками; 2) по целому ряду причин (влияние концентрации ДНК, скорости вращения ротора, заряда молекул ДНК и ионной силы раствора, пространственной структуры молекул ДНК и т.д.) трудно определить значение S2Q для ДНК с ошибкой меньшей, чем 5$, а так как значение S20 изменяется медленнее, чем М, то пятипроцентная ошибка в определении коэффициента седиментации приводит к десятипроцентной ошибке в определении молекулярной массы ДНК.
Учитывая эти погрешности метода, все же можно заключить, что молекулярные массы плазмиды пестициногенности, выделенной из штаммов Y.pestis EV 5/1 и 358/12 сходны между собой и близки к 6 Md. в) Электрофорез в агарозном геле В качестве стандартных реперов молекулярной массы ДНК использовали EcoRl- и Hind ill -фрагменты ДНК фага X » а так же от Типичная седиментограмма (А) и график зависимости log г от t (Б), полученные в эксперименте по определению коэффициента седиментации ДНК плазмиды пестициногенности чумного микроба. Симметричность пика ДНК на дифференциальной кривой седиментеграммы свидетельствует о гомогенности изучаемого препарата плазмидной ДНК. дельные фрагменты плазмиды pBR 322, имеющие линейную двухцепоч-ную форму, поэтому и ДНК плазмиды пестициногенности, выделенную из штаммов Y.pestis EV 5/1, 358/12 и Java 19/36 переводили в линейную форму с помощью R-PatI или R-Hindiii и затем подвергали эту ДНК электрофорезу в агарозном геле (рис.12). Из приведенного рисунка видно, что электрофоретическая подвижность плазмиды из Y.peatis Java 19/36 явно ниже, чем подвижность плазмид из Y,peetis EV 5/1 и 358/12. Расчеты, выполненные с помощью калибровочного графика зависимости log И от длины пробега ДНК, показали, что молекулярные массы двух последних плазмид сходны между собой и составляют - по данным разных экспериментов - 6,I-6 3 Md; масса же плазмиды из Y.pestie Java 19/36 составляет около 7,5 Md. Эти данные подтверждают результаты гетеродуплексного анализа о наличии в последней плазмиде по-линуклеотидной вставки.
Таким образом, показано близкое совпадение молекулярных масс плазмиды пестициногенности чумного микроба, определяемые различными независимыми методами. Наибольший разброс значений молекулярной массы плазмид получен при использовании метода аналитического центрифугирования. Это обусловлено, вероятно, не только погрешностями эксперимента, но и тем, что гидродинамическая теория седиментации ДНК находится пока только на стадии первоначальных разработок и все расчетные уравнения, используемые в седи-ментационном анализе ДНК, выведены с целым рядом допущений, недостаточно обоснованных теорией. На наш взгляд, достаточно надежным и, в силу относительной простоты выполнения и хорошей воспроизводимости, предпочтительным является метод электрофореза в агарозном геле.
Изучение чувствительности ДНК плазмиды пестициногенности к специфическим эндо-нуклеазам
ДНК плазмиды пестициногенности, полученную из штаммов Y,ревie EV 5/1, 358/12 и Java 19/36 изучали в рестрикционном анализе с помощью специфических эндонуклеаз R.EcoRl, R»BamHI, R Bglll, R Hindlll, R.pstl, R.PvuII, R-SalGI, R-Smal, R-Xhol. Анализ показал, что плазмида пестициногенности из трех разных штаммов чумного микроба имеет по одному сайту рестрикции для рестриктаз BamHl, Hindlll и PstI; по два сайта - для рест-риктаз Bgiii и Small; ДНК этой плазмиды не расщепляется рест-риктазами Pvuli, SalGl и Xhoi. Несколько необычная ситуация была выявлена при определении чувствительности плазмидной ДНК к рестриктазе EcoRi: при электрофорезе ДНК после обработки ее этой эндонуклеазой обнаружены два фрагмента. Однако, определение молекулярной массы этих фрагментов (А-фрагмент 4 ма, В-фрагмент 0,75 Md ) показывает, что В-фрагмент состоит из трех фрагментов (В-, С-, Д-фрагменты) с близкой молекулярной массой. Установлено, таким образом, что плазмида пестициногенности обладает четырьмя сайтами, чувствительными к действию эн-донуклеазы R»EcoRi.
Результаты рестрикционного анализа приведены на рис.14, 15, 16. Эти исследования позволяют сделать следующее заключение: плазмида, детерминирующая синтез пестицина І в разных штаммах чумного микроба, имеет общее происхождение и распространение этой плазмиды среди штаммов Y.pestis произошло сравнительно недавно- эволюцией не затронут ни один из локусов, ответственных за чувствительность к указанным выше специфическим эндонуклеазам.
Необходимо, однако, отметить, что после трансформации штамма Рестрикционный анализ ДНК плазмиды пестициногенности, выделенной из разных штаммов чумного микроба. I. ДНК из штамма Java 19/36. 2-4. Эта же ДНК после обработки рестриктазами BamHI, HindiII, Fetl, соответственно. 6. ДНК из штамма EV 5/1. 7-9. Эта же ДНК после обработки рестриктазами BamHI, Hindlll, PatI, соответственно. 10. ДНК из штамма 358/12. П-ІЗ. Эта яе ДНК после обработки рестриктазами BamHI, Hindlll, Pstl, соответственно. 5, 14. EcoRi -фрагменты ДНК фага лямбда.
Y.pestis PHR 133 плазмидной ДНК, полученной из штаммов 358/12 и Java 19/36, ДНК этих плазмид в клонах трансформантов изменила свою чувствительность к некоторым из рестриктаз. Так, появились дополнительные сайты рестрикции для R Pstl (рис.17). Эти изменения произошли не в результате процесса трансформации, а после длительного (более I года) хранения и пересевов этих клонов.
Рестрикционный анализ ДНК плазмиды пестициногенности, выделенной из разных штаммов чумного микроба: I, 2. ДНК из штамма Java 19/36 - нативная и после обработки рестриктазой EcoRIj Несомненно, что эти изменения отражают особенности штамма PKR 133, однако сейчас неизвестно, связано ли это с особенностями системы рекомбинации указанного штамма или присутствием в нем транспозируемых элементов, наличие которых у чумного микроба показали Portnoy D.A. и Falkow S. (1981). Решение этого вопроса могло бы пролить свет и на причины утери некоторыми штаммами чумного микроба плазмид и отдельных детерминантов вирулентности.
Выше сообщалось (глава ІУ, рис.4) о выявлении в одном из субклонов Y.pestis 358/12 двух мини-плазмид. Нами высказано предположение, что эти мини-плазмиды, обозначенные pGMml и pGMm2, образованы de novo из плазмиды пестициногенности. Основанием для такого предположения послужило следующее обстоятельство: указанный клон Y.pestis 358/12 в течение длительного времени использовался в качестве продуцента ДНК плазмиды пес - 104 тициногенности и не обладал никакими иными плазмидами. Появление трех дополнительных плазмид (две мини-плазмиды и одна плазмида, незначительно отличающаяся по молекулярной массе от плазмиды пестициногенности) произошло одновременно и в течение короткого промежутка времени между двумя актами выделения плазмидной ДНК. Трудно допустить, что хромосома чумного микроба содержит три "лишних" участка огі, которые одновременно выщепились из хромосомы, образовав новые репликоны. В литературе, по крайней мере, нет сведений об этом. Но есть сведения (Portnoy, Palkow, 1981) о том, что плазмиды чумного микроба могут содержать IS -подобные элементы, которые играют большую роль в рекомбинационных процессах. ДНК мини-плазмид была выделена из агарозного геля после электрофореза суммарной плазмидой ДНК и охарактеризована по некоторым параметрам. а) Молекулярная масса, по результатам электронно-микроскопи ческого изучения составляет I,9Md для плазмиды pGMml и 1,5 Md для pGMm2. Результаты электрофореза в агарозном геле оказались сходными с этими данными и составляют около 2 и I,5Md, соответственно. б) Попытки обнаружить у этой плазмиды детерминанты, характер ные для плазмиды пестициногенности - пестицин I, фибринолизин и плазмокоагулаза - оказались безуспешными. В экспериментах с использованием способа котрансформации не было обнаружено клонов, обладающих этими активностями.
Картирование плазмиды пестициногенности с использованием гибридной плазмиды .
В главе У было показано, что ДНК плазмиды пестициногенности чумного микроба имеет специфические участки, расщепляемые эндо-нуклеазами BamHI, Bglll, EcoRI, Hindlll, Psti, Smal. Следующим этапом работы было решение вопроса о взаимном расположении на плазмиде некоторых из этих участков. Попытка использовать с этой целью метод двойной рестрикции оказалась безуспешной. Так, при совместном расщеплении плазмиды рестриктазами EcoRI и Psti, кроме EcoRI -фрагментов выявлены более мелкие фрагменты с молекулярными массами 0,39-0,41 и 0,32-0,36 Md (рис.23). Очевидно, что Psti -сайт расположен внутри одного из малых EcoRI -фрагментов. Установить истинное положение Psti -сайта известными методами рестрикционного картирования плазмид довольно трудно. Мы пришли к выводу, что наиболее целесообразно было бы использовать в качестве концевых меток достаточно протяженную и хорошо изученную последовательность ДНК, имеющую уникальные сайты рестрикции, сходные с таковыми на плазмиде пестициногенности. Этим условиям наиболее отвечает плазмида pBR 322, поэтому для рест-рикционного картирования плазмиды пестициногенности была использована рекомбинантная плаэмида ридб. Выше приведены данные рест-рикционного и гетеродуплексного анализа, свидетельствующие о том, что pGM6 состоит из одного полного репликона pBR 322 и одного полного репликона pPstl. Для определения полярности, в которой располагаются сайты рестрикции на плазмиде пестициногенности, плазмида pGl/іб была подвергнута совместному расщеплению рестриктазами Pvull и Hindlll. В качестве внутреннего маркера при этом использовали малый фрагмент HindiII-Pvull ( I,3Md). В качестве направления выбрали ориентацию фрагмента Pvull — Hindlll (3,2-3,3 Md ), который фланкирован последовательностями нуклеотидов, узнаваемыми R Pvull на участке, принадлежащем плазмиде pBR 322, и узнаваемыми R Hindlll на участке плазмиды pPstl с промежуточным общим сайтом R PstI ( PruII — Pstl I Md ). Из этого же эксперимента стало известным и положение сайта узнавания для R Hindlll на плазмиде пес-тициногенности. Этот сайт находится по часовой стрелке (для выбранной нами ориентации) от сайта R PstI на расстоянии 2,2-2,3 Md. Последующее расщепление pGM6 R«Hindlll совместно с R PstI и R-Hindill совместно с ВашНі подтвердило это положение сайта R Hindlil. В качестве внутренних маркеров молекулярной массы использовались фрагменты Pstl— Hindlll (0,450-0,460 Md ) и Hindlll—» Pstl (2,1-2,3 Md ), принадлежащие участку плазмиды pBR 322.
Достаточно легко оказалось установить положение сайта рестрикции для R.BamHI. При расщеплении pGM6 этим ферментом образовалось два фрагмента, которые не разделяются при электрофорезе в агарозном геле. Отсюда вытекает, что эти фрагменты обладают примерно равной молекулярной массой (с разницей в пределах разрешающей способности электрофореза в агарозном геле), которая в наших расчетах оказалась равной 4,465-4,570 Md. Прямая линия, проведенная через центр кольцевой карты от известного сайта BamHl, расположенного на участке pGM6, принадлежащего pBR 322, определяет положение сайта ВашНі на плазмиде пестициноген-ности. Этот сайт расположен по часовой стрелке от сайта Hindlll на расстоянии 0,390-0,420 Md. Последующее расщепление PGM6 R Hindlll совместно с BamHI подтвердило эту локализацию (0,405-0,430 Md от сайта Hindlll ). Что касается сайтов узнава - 117 ния для рестриктаз EcoRl и PstI, то совместное расщепление pGM6 ферментами EcoRl и PstI и отдельно EcoRl показало, что сайт PstI расположен в плазмиде пестициногенности почти посередине первого малого EcoRl -фрагмента, образуя плечи с размерами 0,32-0,35 и 0,400-0,425Md. Остальные два малые EcoRi-фрагменты расположены по часовой стрелке относительно этого фрагмента. Размеры каждого из малых EcoRl- фрагментов составляют 0,710-0,760Md и при электрофорезе в агарозном геле эта фракция дак, состоящая из трех примерно равных по молекулярной массе фрагментов, движется заметно быстрее стандартного Psti+SalGi-фрагмента pBR 322 (0,834Md). Результаты рестрикционного анализа плазмиды pGM6 приведены на рисунке 24.
Так как с помощью рестрикционного анализа гибридной плазмиды pGM6 стало известным положение на плазмиде пестициногенности сайтов узнавания R-Psti R BamHl R Hindiil и R EcoRT, а также из-за отсутствия на pBR 322 сайтов узнавания для R«BgllI и Smal для локализации сайтов узнавания R-BglEI и R»SmaI использовали метод расщепления различными парами рестриктаз непосредственно самой плазмиды пестициногенности. R Bglll имеет на этой плазмиде два сайта узнавания, образуя фрагменты с молекулярными массами 3,45-3,75Md и 2,40-2,65Md. Совместное расщепление плазмиды различными парами рестриктаз показало, что малый фрагмент расщепляется парами Bgin+EcoRi, Bglll+Pstl, BglII+ Hindlli и не расщепляется парой Bglil+BamHi; наоборот, больший фрагмент не расщепляется первыми тремя парами и расщепляется парой Bglil+BamHi. Определение молекулярных масс, образующихся при расщеплении плазмидной ДНК каждой из пар ферментов позволило установить, что один сайт узнавания для R Bgin расположен между сайтами Hindlli и BamHI, а второй между сайтами PstI Аналогичным способом определили положение сайтов узнавания для рестриктазы Smal на плазмиде пестициногенности. Один из них находится по часовой стрелке от сайта ВашНІ, а второй расположен против часовой стрелки от первого сайта EcoRI. Рестрикционный анализ pPstl различными парами рестриктаз с обязательным присутствием в них ферментов Bglll или Smal приведен на рисунке 25. Рестрикционные карты плазмиды пестициногенности игибридной плазмиды PGM6 приведены на рисунках 26 и 27. На эту же карту нанесено положение гена, детерминирующего синтез пести-цина I, которое определено при изучении фенотипической экспрессии рекомбинантных плазмид серии рам.
Положение негомологичной последовательности ДНК, содержащейся в плазмиде пестициногенности из штамма Y.pestis Java 19/36, определено в гетеродуплексном анализе. Из результатов рестрик-ционного анализа видно, что ни одна из исследованных рестриктаз не имеет сайтов узнавания в той области, где произошло включение вставки. Сравнение этих данных с рестрикционной картой плазмиды показывает, что вставка находится в левой ее части. Мы провели гибридизацию плазмиды из Y.pestis 19/36 с плазмидой pGM6 (рис.28), где точкой отсчета может служить сайт Pstl, легко определяемый электронномикроскопически, так как этот сайт дает начало однонитевой петли pBR 322. Измерение расстояния от сайта Pstl до однонитевой петли негомологичной последовательности ДНК позволило локализовать эту вставку на рестрикционной карте плазмиды пестициногенности.
